Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

eIF4F kompleks sinyalinin düzenlenmesi, kanser proliferasyonu ve sağkalımında rol oynayan mRNA alt kümesinin artan translasyonu ile ilişkilidir. Burada, canlı hücrelerde eIF4F kompleks bütünlüğünde ilaca bağlı bozulmayı değerlendirmemizi sağlayan bir eIF4E-eIF4G hücre bazlı protein-protein etkileşim testlerini açıklıyoruz. Protein-protein arayüzünü verimli bir şekilde hedefleyen modalitelerin geliştirilmesine artan bir ilgi vardır.

eIF4E-eIF4G PPI testlerimizin bu stratejilerin geliştirilmesine ve doğrulanmasına yardımcı olacağını öngördük. Bu test, eIF4E-eIF4G inhibitörlerinin optimizasyonuna öncülük etmesi için optimal bir birincil şema sağlayacaktır. Hücrenin doğru bir şekilde tohumlanması ve transfer transfeksiyonunun gerçekleştirilmesi, bu ürünün en zorlu yönüdür, çünkü doğrudan PPI raporlama sisteminin baskılanmasına yansıyabilirler.

Hücrelerin çözülmesinden ve sayılmasından sonra, oyuk başına 2 mililitre standart büyüme ortamı kullanarak HEK 293 hücreli 6 oyuklu plakayı tohumlayın. 2. günün sabahı, planlanan her transfeksiyon için, fenol kırmızısı içermeyen 125 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı içeren bir tüpte 9 mikrolitre lipozom bazlı çözeltiyi seyreltin. Seyreltilmiş lipozomlar oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilirken, her bir transfeksiyon tüpü için her bir plazmitin 3 mikrogramını 125 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyrelterek ana DNA karışımını hazırlayın.

DNA ana karışımına 2'ye 12 mikrolitre arttırıcı reaktif ekleyin, ardından iyice karıştırın. Bu karışımı hemen 1 ila 1 oranında seyreltilmiş lipozomların her bir tüpüne ekleyin. Bu DNA lipid kompleksini oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ettikten sonra, kompleksi 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna ekleyin.

Hücreleri 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. 3. günün sabahı, her birini 1 mililitre PBS ile durulayın ve 0.3 mililitre tripsin ekleyin. Plakaları 37 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, fenol kırmızısı içermeyen indirgenmiş serum ortamının her bir oyuğuna 2 mililitre ekleyerek tripsini nötralize edin. Kesilen hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, hücreleri 290x G'de 5 dakika santrifüjleyin.

Ortamı aspire edin ve hücre peletini indirgenmiş serum ortamının 2 mililitresinde yeniden süspanse edin. Kopyalanan HEK 293 hücrelerini, 90 mikrolitre ortamda oyuk başına 30.000 hücre yoğunluğunda, 96 oyuklu opak plakalara tohumlayın. Aynı deneyde 3 farklı bileşik için 3 teknik kopya elde etmek için 60 kuyu tohumlayın.

Kenarlardaki kuyuları hariç tutun. Kopyalanan hücrelerin tohumlanmasından hemen sonra, her bir oyuğa 10 mikrolitre% 10 DMSO bileşik çözeltisi ekleyin. İlgilenilen her bir bileşiği %100 DMSO'da çözerek 1 milimolar bileşik stok çözeltisi hazırlayın.

Her bileşik titrasyonu için 3 kopyaya sahip olmak için, 1 milimolar bileşik stok çözeltisinden 8 mikrolitre kullanın. Her titrasyon noktası için 1 milimolar stoğun 4 mikrolitresini 4 mikrolitre %100 DMSO'ya pipetleyerek 96 oyuklu bir PCR plakasının 8 oyuğunda her bir stok bileşiği çözeltisinin iki kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. İki katlı seri seyreltmenin son noktasından sonra fazla 4 mikrolitreyi atın.

% 10 DMSO'da 40 mikrolitre 10x bileşik seri seyreltme çözeltisi hazırlamak için her tüpe 36 mikrolitre HPLC sınıfı steril su ekleyin. Ayrıca, bir denetim hazırlayın. HPLC sınıfı steril suda% 10 DMS tek stok çözeltisi.

İstenen nihai konsantrasyonu elde etmek için 96 oyuklu opak plakadaki hücrelere 10 mikrolitre 10x çalışma solüsyonu ekleyin, kalıntı DMSO konsantrasyonu% 1 ile plakayı 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile 3 saat inkübe edin. 3 saat sonra, 1 hacim substratı 19 hacim seyreltme reaktifi ile birleştirerek lusiferaz substrat reaktifini hazırlamaya başlayın. Hücrelerle birlikte 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna hemen 25 mikrolitre substrat reaktifi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.

Plakayı oda sıcaklığında 50 dakika boyunca 350 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Lüminesansı değerlendirmek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin. Ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 455'e ayarlayın.

1 saniyelik bir ölçüm süresi ile 6,5 milimetrelik bir ölçüm yüksekliği kullanın. Hücre canlılığını değerlendirmek için, her oyuğa 33 mikrolitre canlılık tahlil reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika sonra, ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 600'e ayarlayarak plaka okuyucu ile lüminesansı değerlendirin.

6,5 milimetrelik bir ölçüm yüksekliği ve 1 saniyelik bir ölçüm süresi kullanın. Her bir bileşiğin IC 50 değerini belirlemek için plaka okuyucudan gelen verileri kullanın, verileri makalede açıklanan 4 parametreli bağlantı eğrisi denklemine eğri uydurarak. HEK 293 hücreleri eIF4E-eIF4G kompleman sistemi ile transfekte edildi ve daha sonra geri çekildi ve mTOR inhibitörleri ile tedavi edildi.

Lüminesans tedaviden 4 saat sonra değerlendirildiğinde, PP242 ve rapamisinin her ikisi de sinyalin doza bağlı bir inhibisyonunu üretti. Ne PP242 ne de rapamisin hücre canlılığında önemli bir azalmaya neden olmadı, bu da eIF4E-eIF4G tamamlama sistemindeki lüminesanstaki azalmanın spesifik olmayan hücre ölümünden değil, EIF4E-4G etkileşiminin bozulmasından kaynaklandığını gösteriyor. M7GTP aşağı çekme deneyini takiben Western blot analizi, endojen eIF4E-eIF4G etkileşiminin 4EBP1 aracılı bozulmasının ölçülen eIF4E-eIF4G tahlil sinyali ile ilişkili olduğunu gösterdi.

PP242, rapamisinden daha güçlü bir toplam 4EBP1 fosforilasyon inhibitörüydü. Her iki inhibitör de normal olarak mTOR sinyalizasyonu üzerinde bir etki gösterdi, rapamisin mTORC1 substratlarına karşı daha aktifti ve PP242 hem mTORC1 hem de mTORC2'yi hedef aldı. Bu ürünün en kritik yönü, hücrelerin işlem gününde tohumlanması, hücrelerin fenol kırmızısı olmayan bir ortamda yeniden tohumlanması, eIF4E-eIF4G tamamlama testinin lüminesansının değerlendirilmesi ve aynı plaka üzerinde canlılık testinde çalıştırılmasıdır.

Herhangi bir hedef ilacı ve bilinen spesifik etkileri değerlendirmek için ikincil bir canlılık testi yapılabilir.