Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme
1 Mayıs 2020
Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.
eIF4F kompleks sinyalinin düzenlenmesi, kanser proliferasyonu ve sağkalımında rol oynayan mRNA alt kümesinin artan translasyonu ile ilişkilidir. Burada, canlı hücrelerde eIF4F kompleks bütünlüğünde ilaca bağlı bozulmayı değerlendirmemizi sağlayan bir eIF4E-eIF4G hücre bazlı protein-protein etkileşim testlerini açıklıyoruz. Protein-protein arayüzünü verimli bir şekilde hedefleyen modalitelerin geliştirilmesine artan bir ilgi vardır.
eIF4E-eIF4G PPI testlerimizin bu stratejilerin geliştirilmesine ve doğrulanmasına yardımcı olacağını öngördük. Bu test, eIF4E-eIF4G inhibitörlerinin optimizasyonuna öncülük etmesi için optimal bir birincil şema sağlayacaktır. Hücrenin doğru bir şekilde tohumlanması ve transfer transfeksiyonunun gerçekleştirilmesi, bu ürünün en zorlu yönüdür, çünkü doğrudan PPI raporlama sisteminin baskılanmasına yansıyabilirler.
Hücrelerin çözülmesinden ve sayılmasından sonra, oyuk başına 2 mililitre standart büyüme ortamı kullanarak HEK 293 hücreli 6 oyuklu plakayı tohumlayın. 2. günün sabahı, planlanan her transfeksiyon için, fenol kırmızısı içermeyen 125 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı içeren bir tüpte 9 mikrolitre lipozom bazlı çözeltiyi seyreltin. Seyreltilmiş lipozomlar oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilirken, her bir transfeksiyon tüpü için her bir plazmitin 3 mikrogramını 125 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyrelterek ana DNA karışımını hazırlayın.
DNA ana karışımına 2'ye 12 mikrolitre arttırıcı reaktif ekleyin, ardından iyice karıştırın. Bu karışımı hemen 1 ila 1 oranında seyreltilmiş lipozomların her bir tüpüne ekleyin. Bu DNA lipid kompleksini oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ettikten sonra, kompleksi 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna ekleyin.
Hücreleri 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. 3. günün sabahı, her birini 1 mililitre PBS ile durulayın ve 0.3 mililitre tripsin ekleyin. Plakaları 37 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, fenol kırmızısı içermeyen indirgenmiş serum ortamının her bir oyuğuna 2 mililitre ekleyerek tripsini nötralize edin. Kesilen hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, hücreleri 290x G'de 5 dakika santrifüjleyin.
Ortamı aspire edin ve hücre peletini indirgenmiş serum ortamının 2 mililitresinde yeniden süspanse edin. Kopyalanan HEK 293 hücrelerini, 90 mikrolitre ortamda oyuk başına 30.000 hücre yoğunluğunda, 96 oyuklu opak plakalara tohumlayın. Aynı deneyde 3 farklı bileşik için 3 teknik kopya elde etmek için 60 kuyu tohumlayın.
Kenarlardaki kuyuları hariç tutun. Kopyalanan hücrelerin tohumlanmasından hemen sonra, her bir oyuğa 10 mikrolitre% 10 DMSO bileşik çözeltisi ekleyin. İlgilenilen her bir bileşiği %100 DMSO'da çözerek 1 milimolar bileşik stok çözeltisi hazırlayın.
Her bileşik titrasyonu için 3 kopyaya sahip olmak için, 1 milimolar bileşik stok çözeltisinden 8 mikrolitre kullanın. Her titrasyon noktası için 1 milimolar stoğun 4 mikrolitresini 4 mikrolitre %100 DMSO'ya pipetleyerek 96 oyuklu bir PCR plakasının 8 oyuğunda her bir stok bileşiği çözeltisinin iki kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. İki katlı seri seyreltmenin son noktasından sonra fazla 4 mikrolitreyi atın.
% 10 DMSO'da 40 mikrolitre 10x bileşik seri seyreltme çözeltisi hazırlamak için her tüpe 36 mikrolitre HPLC sınıfı steril su ekleyin. Ayrıca, bir denetim hazırlayın. HPLC sınıfı steril suda% 10 DMS tek stok çözeltisi.
İstenen nihai konsantrasyonu elde etmek için 96 oyuklu opak plakadaki hücrelere 10 mikrolitre 10x çalışma solüsyonu ekleyin, kalıntı DMSO konsantrasyonu% 1 ile plakayı 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile 3 saat inkübe edin. 3 saat sonra, 1 hacim substratı 19 hacim seyreltme reaktifi ile birleştirerek lusiferaz substrat reaktifini hazırlamaya başlayın. Hücrelerle birlikte 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna hemen 25 mikrolitre substrat reaktifi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
Plakayı oda sıcaklığında 50 dakika boyunca 350 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Lüminesansı değerlendirmek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin. Ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 455'e ayarlayın.
1 saniyelik bir ölçüm süresi ile 6,5 milimetrelik bir ölçüm yüksekliği kullanın. Hücre canlılığını değerlendirmek için, her oyuğa 33 mikrolitre canlılık tahlil reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika sonra, ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 600'e ayarlayarak plaka okuyucu ile lüminesansı değerlendirin.
6,5 milimetrelik bir ölçüm yüksekliği ve 1 saniyelik bir ölçüm süresi kullanın. Her bir bileşiğin IC 50 değerini belirlemek için plaka okuyucudan gelen verileri kullanın, verileri makalede açıklanan 4 parametreli bağlantı eğrisi denklemine eğri uydurarak. HEK 293 hücreleri eIF4E-eIF4G kompleman sistemi ile transfekte edildi ve daha sonra geri çekildi ve mTOR inhibitörleri ile tedavi edildi.
Lüminesans tedaviden 4 saat sonra değerlendirildiğinde, PP242 ve rapamisinin her ikisi de sinyalin doza bağlı bir inhibisyonunu üretti. Ne PP242 ne de rapamisin hücre canlılığında önemli bir azalmaya neden olmadı, bu da eIF4E-eIF4G tamamlama sistemindeki lüminesanstaki azalmanın spesifik olmayan hücre ölümünden değil, EIF4E-4G etkileşiminin bozulmasından kaynaklandığını gösteriyor. M7GTP aşağı çekme deneyini takiben Western blot analizi, endojen eIF4E-eIF4G etkileşiminin 4EBP1 aracılı bozulmasının ölçülen eIF4E-eIF4G tahlil sinyali ile ilişkili olduğunu gösterdi.
PP242, rapamisinden daha güçlü bir toplam 4EBP1 fosforilasyon inhibitörüydü. Her iki inhibitör de normal olarak mTOR sinyalizasyonu üzerinde bir etki gösterdi, rapamisin mTORC1 substratlarına karşı daha aktifti ve PP242 hem mTORC1 hem de mTORC2'yi hedef aldı. Bu ürünün en kritik yönü, hücrelerin işlem gününde tohumlanması, hücrelerin fenol kırmızısı olmayan bir ortamda yeniden tohumlanması, eIF4E-eIF4G tamamlama testinin lüminesansının değerlendirilmesi ve aynı plaka üzerinde canlılık testinde çalıştırılmasıdır.
Herhangi bir hedef ilacı ve bilinen spesifik etkileri değerlendirmek için ikincil bir canlılık testi yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin ölçülmesi için bir protokol sunar ve eIF4F kompleksi dinamiklerinde ilaç kaynaklı bozulmaların değerlendirilmesini kolaylaştırır. Test, bu protein-protein etkileşimini hedef alan inhibitörlerin geliştirilmesini desteklemeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Protein-Protein Etkileşimleri
- Kanser Araştırmaları
Arka Plan
- eIF4F kompleksi, mRNA translasyon düzenlemesi için kritik öneme sahiptir.
- Sinyal vermesi, kanser hücresi çoğalması ve hayatta kalma ile ilişkilidir.
- Protein-protein arayüzlerini hedef almak, büyüyen bir ilgi alanıdır.
- eIF4E-eIF4G etkileşimlerinin değerlendirilmesi, ilaç keşfinde yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- eIF4E-eIF4G etkileşimleri için hücre tabanlı bir test geliştirmek.
- İlaçların eIF4F kompleksi bütünlüğü üzerindeki etkilerini değerlendirmek.
- eIF4E-eIF4G inhibitörlerini optimize etmek için bir çerçeve sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre ekimi ve transfer transfeksiyon teknikleri.
- Canlı hücrelerde protein-protein etkileşim testleri.
- İlaç kaynaklı bozulmaların değerlendirilmesi.
- Güvenilir sonuçlar için test koşullarının optimizasyonu.
Ana Sonuçlar
- Test, eIF4E-eIF4G etkileşimlerini başarılı bir şekilde ölçer.
- İlaç tedavileri, eIF4F kompleksinin dinamiklerini değiştirebilir.
- Hücre işleme zorlukları, test sonuçlarını etkileyebilir.
- Yöntem, potansiyel inhibitörlerin doğrulanması için destek sağlar.
Sonuçlar
- eIF4E-eIF4G testi, kanser araştırması için değerli bir araçtır.
- Protein etkileşimleri üzerindeki ilaç etkilerinin değerlendirilmesini sağlar.
- Bu yaklaşım, hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Monitoring eIF4F assembly via eIF4E-eIF4G interaction provides a live-cell readout of a key oncogenic signaling node, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking of translation initiation inhibitors. This assay supports predictive confidence in compound screening by linking target engagement to functional disruption of cancer-relevant mRNA translation, informing portfolio decisions in oncology drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the eIF4E-eIF4G protein-protein interaction as a functional readout of eIF4F complex assembly in live cells.
- Operational Value: Enables assessment of drug-induced perturbations in target engagement without relying on cell death confounders.
- Strategic Value: Supports target validation by correlating compound effects with known pathway inhibitors like PP242 and rapamycin.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantitative luminescence-based readout amenable to dose-response profiling and IC50 determination.
- Operational Value: Compatible with 96-well format and dual-readout design (target engagement and viability) for assay robustness.
- Strategic Value: Enables primary screening and lead optimization of eIF4E-eIF4G disruptors in a physiologically relevant cellular context.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures target modulation in a disease-relevant system where eIF4F dysregulation drives oncogenic translation.
- Operational Value: Demonstrates correlation with biochemical validation (e.g., 4EBP1-mediated disruption via m7GTP pull-down), supporting translational continuity.
- Strategic Value: Facilitates go/no-go decisions by distinguishing specific target effects from cytotoxic artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling quantitative lead optimization prior to preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of the eIF4F node and pathway clarification in oncogenic signaling contexts.
- Screening: Enables reproducible, quantitative compound evaluation with built-in viability counterscreening.
- Analytics: Generates dose-response data and IC50 values via 4-parameter curve fitting for compound prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical validity through correlation with orthogonal validation of eIF4E-eIF4G disruption.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing PPI-targeted modalities across oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation and reduces mechanistic ambiguity in PPI-directed screening.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable readouts with internal viability controls to ensure data quality.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by isolating specific target effects from cytotoxic confounders.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of eIF4E-eIF4G inhibitors based on target engagement and functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell transfection and protein-protein interaction assay design.
- Dependent on luminescence detection infrastructure and orbital shaking for signal development.
- Necessitates standardization of cell seeding density and transfection efficiency across wells.
- Involves optimization of compound dilution series in DMSO to maintain consistent solvent exposure.
- Limited by the need for careful cell handling to avoid artifacts in PPI reporting, particularly during transfer and re-seeding steps.
