Name: Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçerek eIF4F kompleks dinamiklerini değerlendirme yöntemini. Bu hücre temelli analiz, kanser tedavileri için protein-protein etkileşim inhibitörlerinin geliştirilmesine katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma p53lab (BMSI, A*STAR) ve JCO VIP hibesinden (A*STAR) çekirdek bütçe ile desteklendi.

HEK293 hücre hattı protokol için kullanıldı ve Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu, 2 mM L-glutamin ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Modifiye Kartal Orta'sında kültürlendi. Hücreler nemlendirilmiş bir ortamda %5 CO2 ile 37 °C'de kültürlendi.
1. eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı test yoluyla eIF4F karmaşık bozulmanın nicel değerlendirmesi
<ol><li>Hücre kültürü ve eIF4E geçici transfeksiyon:eIF4G604-646 tamamlayıcı test<ol>
<li>Tüm deneyler için 20'den az pasajlı yeni çözülmüş hücreler kullanın. 1. günde, standart bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin ve Trypan mavi dışlama yöntemi13'ü kullanarak toplam uygulanabilir hücreleri sayın.</li>
		<li>2 mL standart büyüme ortamında kuyu başına 0,9 - 1,2 x 10 6 HEK 293 hücreli tohum6 kuyu plakaları. NOT: Yukarıda belirtilen hücre hatları içinde en iyi transfeksiyon verimliliğini elde etmek için, kaplamalı hücrelerin tohumlamadan sonraki gün% 70-90 birleştiğinden emin olun.</li>
		<li>2. günün sabahında, suba-eIF4E ve eIF4G604-646-SubB plazmid ile birlikte lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanarak hücrelerin eş transfectleri (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>9 μL lipozom bazlı çözeltiyi fenol kırmızısı olmadan 125 μL azaltılmış serum ortamı içeren bir tüpte seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu)her transfeksiyon için ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Her transfeksiyon tüpü için 125 μL azaltılmış serum ortamında her plazmidden 3 μg seyrelterek DNA'nın ana karışımını hazırlayın.</li>
			<li>DNA ana karışım tüpüne 12 μL arttırıcı reaktif ekleyin, iyice karıştırın ve hemen DNA'yı ekleyin: seyreltilmiş lipozomların her tüpüne 1:1 oranında arttırıcı ana karışımı. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.</li>
			<li>DNA lipid kompleksini her kuyuya ekleyin ve hücreleri 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3. günün sabahında, her birini 1 mL PBS ile iyice durulayın.</li>
		<li>PBS'yi çıkarın ve her kuyudaki hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca 0,3 mL tripsin ile kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Her kuyuya % 0 FCS içeren fenol kırmızısı içermeyen azaltılmış serum ortamının 2 mL'sini ekleyerek trypsin'i nötralize edin ve transfected hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. NOT: Fenol kırmızısı luciferaz aktivitesini engelleyebilir; bu nedenle, hücreler bu adımdan itibaren fenol kırmızısı olmadan ortamda ele alınmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri 290 x g'da 5 dakika döndürün ve ortamı aspire edin. Hücreleri% 0 FCS içeren fenol kırmızısı olmadan azaltılmış serum ortamının 2 mL'sinde yeniden kullanın. Adım 1.1'de açıklandığı gibi sayın.</li>
		<li>Tohum, %0 FCS içeren fenol kırmızısı olmayan 90 μL orta alanda kuyu başına 30.000 hücre yoğunluğunda 96 kuyu opak plakada HEK 293 hücrelerini trans enfekte etti. 3 farklı bileşik için aynı deneyde 3 teknik çoğaltma elde etmek için, kenarlardaki kuyular hariç hücrelere sahip plakaların tohum 60 kuyusu.</li>
		<li>Transfected hücreleri tohumlamadan hemen sonra, % 10 DMSO bileşik çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin (bkz. adım 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik hazırlama<ol>
<li>Faiz bileşiği %100 DMSO 'da (v/v) eriterek 1 mM bileşik stok çözümleri hazırlayın. Her bileşik titrasyon için 3 çoğaltmaya sahip olmak için, 1 mM bileşik stok çözeltisinin 8 μL'sini kullanın. NOT: Kullanılan 1 mM stok bileşiği hacmi ihtiyaç duyulandan daha fazladır. Bu, varsa pipetleme hatalarını dikkate almak için yapılır.</li>
		<li>Stok bileşik çözeltisinin 2 kat seri seyreltilmesini, 1 mM'lik stoğun 4 μL'si ile her titrasyon noktası için % 100 DMSO'nun 4 μL'sine gerçekleştirin. NOT: Tam bir bileşik titrasyon için başlangıç stoğundan %100 DMSO'da 9 seri seyreltme gerçekleştirin. Birden fazla bileşiğin test edilmesi gerekiyorsa, bu adımı ve sonraki seyreltmeleri kolaylaştırmak için bir 96 kuyu plakası ve çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
		<li>%10 DMSO (v/v) (v/v) içinde 40 μL 10x çalışma çözümleri hazırlamak için 2 kat seri seyreltmenin her noktası için 36 μL HPLC sınıfı steril su ekleyin. 100 μM ila 0,39 μM %10 DMSO stok serisi, hücrelere eklendiğinde %1 DMSO'da 10 μM ila 0,039 μM arasında nihai bir çözüme yol açacaktır. Arıtma kontrolüne gelince, HPLC sınıfı steril suda% 10 DMSO sadece stok çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Toplam 100 μL hacimde% 1 (v / v) kalıntı DMSO konsantrasyonu ile hedeflenen son konsantrasyonu elde etmek için 96 kuyu opak plakasındaki hücrelere 10 μL 10x çalışma çözeltisi ekleyin ve% 5 v / v atmosferik CO2ile 37 ° C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Luciferaz kompleasyonu ve uygulanabilirlik tahlilleri<ol>
<li>3 saat ilaçlamadan sonra, 1 hacimli substratı seyreltme reaktifinin 19 hacmiyle birleştirerek luciferaz substrat reaktifini hazırlamaya başlayın (üreticinin talimatlarına bakın). NOT: Luciferaz tahlili, piyasada bulunan bir kit kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Hemen 25 μL substrat reaktif eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
		<li>Plakayı oda sıcaklığında yörüngesel bir çalkalayıcıda 50 dakika boyunca 350 rpm'de sallayın.</li>
		<li>Plaka okuyucu kullanarak lüminesansı değerlendirin. Bunu yapmak için ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 455'e ayarlayın. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın.</li>
		<li>Hücre canlılığını yok etmek için, 33 μL canlılık tahlil reaktifi ekleyin ve plaka okuyucuyu kullanarak oda sıcaklığında 15 dakika sonra lüminesansı tekrar ölçün.</li>
		<li>Ayna okuyucuyu Lüminesans'a ve emisyon filtresini 600 nm'ye ayarlayarak plaka okuyucu ile lüminesansı değerlendirin. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın. NOT: Uygulanabilirlik, üretici talimatlarına göre hücre içi ATP seviyesi hücre içi liziz üzerinde ölçülerek değerlendirilir. Bu durumda çoklama mümkündür, çünkü canlı test farklı bir emisyon dalga boyunda farklı bir luciferaz kullanır.</li>
		<li>Verileri 4 parametreli sığdırma eğrisi denklemine sığdırarak her bileşiğin IC50 değerlerini belirlemek için verileri kullanın: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D D ve A sayısal değerleri eğri sığdırma işleminde kısıtlanmalıdır: D = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen minimum eğri asemptot veya minimum teorik yanıt seviyesi için Y eksenindeki parlak değer. A = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen maksimal eğri asemptot veya maksimal teorik seviye yanıtı için Y ekseninde parlaklık değeri. NOT: Minimum yanıtın değeri %1 DMSO (v/v) kontrol tedavisinden, maksimum yanıtın değeri ise hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan yüksek benzeşimli mTOR inhibitörünün maksimum tepkisinden elde edilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. eIF4E:eIF4G604-646 tahlil inhibisyonunu hücrelerde eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilendiren
<ol><li>Test tarafından ölçülen sinyalin, 1.1 adımında açıklandığı gibi, bileşik, tohum hücreleri tarafından eIF4E-eIF4G etkileşiminin fiziksel bozulmasına karşılık geldiğini onaylamak için.</li>
	<li>Ertesi gün, ortamı fenol kırmızısı içermeyen 1 mL azaltılmış serum ortamı ile değiştirin ve ilgi bileşiği ile 4 saat kuluçkaya yatırın. Toplam 1 mL hacimde %1 (v/v) kalıntı DMSO konsantrasyonu sağlayın. NOT: Sonuçla kolayca bir korelasyona izin vermek için, ölçülen tamamlayıcı test titrasyon eğrisinin başında, orta noktasında ve uç noktasında bileşik konsantrasyonlar kullanın.</li>
	<li>EIF4F ve eIF4E:4EBP1 komplekslerini izole etmek için Lyse hücreleri ve gerçekleştirilen m7GTP aşağı çekme. m7GTP aşağı çekme deneyinin nasıl gerçekleştirileceğine dair ayrıntılı prosedürler başka bir yerde bulunabilir14.</li>
	<li>Batı blot analizi ile m7GTP bağlı eIF4G, eIF4E ve 4EBP1 protein seviyelerini tespit edin ve ardından tamamlayıcı test sinyali inhibisyonu ile eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilidir.</li>
</ol>

<ol><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li>
<li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+translation+machinery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li>
<li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex%3A+a+critical+nexus+for+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li>
<li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis%3A+the+role+of+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4E%3A+A+retrospective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li>
<li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li>
<li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G%3A+comparison+with+eIF4E-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li>
<li>Grüner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li>
<li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).</li>
<li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1%3A+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li>
<li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Translation%22%5BJournal%5D)">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819(2013).</li>
<li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40(2019).</li>
<li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+protein-protein+interactions+%28PPIs%29%3A+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makalede açıklanan yöntem, canlı hücrelerde eIF4G-eIF4E etkileşiminin doğrudan ölçümü yoluyla eIF4F karmaşık montajını nicel olarak izlemek için luciferaz tabanlı bir tamamlayıcılık tahlili kullanır. EIF4E-eIF4G kompleasyon sisteminin kullanımı için ayrıntıları sağladık ve ayrıca sistemin eIF4E-eIF4G etkileşiminin ilaç kaynaklı 4EBP1 aracılı ayrışması ölçümlemede son derece doğru olduğunu gösterdik16. Bu tahlilin verimini kolaylaştırmak için, bu makalede açıklanan deneysel kurulum 96 kuyu mikro...

Gen ekspresyonunun kontrolü, büyüme çoğalması ve farklılaşma gibi hücresel programların doğru yürütülmesinde önemli bir rol oynar. Gen transkripsiyonu düzeyinde veya mRNA çevirisi düzeyinde bir düzenleyici kontrol mekanizması uygulanabilir. Son on yılda, daha sonraki uzama ve sonlandırma adımları yerine başlatma sürecinin modülasyonu ile çeviri kontrolünün, çok çeşitli biyolojik işlevleri oynayan belirli protein alt kümelerinin sentezini ince bir şekilde düzenleyebileceği giderek daha belirgin hale gelmiştir.
Sağkalım, anti-otofajik ve anti-apoptotik yanıtlarda yer alan mRNA'ların artan çevirisi birkaç kansere karışmıştır ve ayrıca sapkın aktivasyon veya çeviri başlatma faktörlerinin aşırı ekspresyonu ile nedensel olarak bağlantılıdır1.
eIF4F kompleksi, çeviri başlatmanın ana düzenleyicisidir. mRNA'ların 5' ucundaki kapak yapısını bağlayarak, eIF4F ilk mRNA-ribozom alımını yönlendiriyor ve buna karşılık zayıf çevrilmiş ökaryotikmRNA'larınmRNA çeviri verimliliğini artırıyor 2 . Kansere bağlı mRNA'ların eIF4F aracılı çevirisi, RAS / MAPK veya AKT / TOR yollarının anormal aktivasyonunu barındıran birçok kanser modeli için bildirilmiştir, bu da kanser hücrelerinin kendi neoplastik aktivitelerini artırmak için eIF4F'yi yükselttiğini göstermektedir. EIF4F karmaşık oluşumunu engelleyerek bu ilerleme döngüsünün bozulması, böylece çok umut verici bir terapötik stratejidir3,4.
eIF4F kompleksi (i) eIF4E, mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase ve (iii) eIF4G'nin 5' UTR'sinde bulunan kapak yapısıyla etkileşime giren eIF4F'nin kapak bağlama alt birliği, hem eIF4A hem de eIF4E ile etkileşime giren ve sonunda 40S ribozomal alt birliği5'iişe alan iskele proteini. eIF4E ile eIF4G ilişkisi fonksiyonel eIF4F komplekslerinin montajı için hız sınırlayıcı adımdır ve eIF4E bağlayıcı proteinler (4EBP'ler, üyeler 1, 2 ve 3)) tarafından olumsuz düzenlenir6. 4EBP, kurallı ve kurallı olmayan eIF4E bağlama dizileri7, 8,9'dan (insan eIF4E'de aa 604-646'yı kapsayan bölge) oluşan bir arayüz aracılığıyla eIF4E'ye eIF4G bağlama ile rekabet ederek, çeviride aktif olarak yer alan eIF4E havuzunu azaltır ve eIF4F karmaşık oluşumunu önler. Bu protein-protein etkileşimlerinin etkileşimi esas olarak 4EBP'nin rapamycin (mTOR) aracılı fosforilasyonunun memeli hedefi tarafından düzenlenir. Mitojenik uyaranlar üzerine, mTOR doğrudan 4E-BP protein ailesinin üyelerini fosforilize eder, eIF4E ile ilişkilerini azaltır ve böylece eIF4E-eIF4G etkileşimini ve fonksiyonel eIF4F komplekslerinin oluşumunu teşvikeder 10.
EIF4F karmaşık bütünlüğünü hedefleyen bileşikler geliştirmedeki büyük çabaya rağmen, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin doğrudan bozulmasını ölçen tahlillerin olmaması hücresel aktif isabet bileşiklerinin aranmasını sınırlamıştır. EIF4E-eIF4G etkileşimi yoluyla eIF4F bütünlüğünün durumunu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir koelenterazin analoga (örneğin, Nanolüc tabanlı kompleasyon tahlili) dayanan bir luciferaz tahlil uyguladık. Luciferaz kompleasyon protein sistemi, minimum kendi kendine ilişki ve stabilite için optimize edilmiş 18 kDa protein parçası (SubA) ve 11 amino asit peptit parçasından (SubB) oluşur11. Bir kez insan tam uzunlukta eIF4E ve insan eiF4G1 (aa 604-646) eIF4E etkileşim etki alanı ile bir füzyon ürünü olarak ifade edildikten sonra, iki etkileşim proteini SubA ve SubB parçasını birbirlerinin yakınına getirecek ve aktif luciferaz oluşumunu teşvik edecektir, bir hücre geçirgen substratı varlığında, sonunda parlak bir parlaklık sinyali üretecektir (Şekil 1). EIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin16.
Burada, canlı hücrelerde 4EBP1 aracılı eIF4E-eIF4G bozulmasını doğru bir şekilde ölçmek için eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı sisteminin (istek üzerine kullanılabilir) nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Ek olarak, şu anda klinik çalışmalar altında olan birkaç mTOR inhibitörünün etkilerini potansiyel kanser terapötik ilaçlar olarak ölçerek faydasını gösteriyoruz12. Hedef dışı etkiler genellikle ilaca özgü aktiviteyi maskelediğinden, eIF4E:eIF4G604-646 sistem ölçümünün çok yönlülüğünün, bunları dikkate almak için hücresel canlılığın ortogonal ölçümleriyle nasıl genişletilebileceğini de açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>293FT hücreler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü mikroplakası 96 kuyu, F-Bottom</td><td>greiner bio-one</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>Hücre titresi Glo 2.0</td><td>PROMEGA</td><td>G9241</td><td></td></tr><tr><td>Envision Çok Etiketli Okuyucu</td><td>PerkinElmer</td><td>uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Çok Kanallı Pipetler 12 kanallı 30-300 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Çok Kanallı Pipetler 12 kanallı 5-50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662050</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE6</td><td>PROMEGA</td><td>E2692</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI Başlangıç Sistemleri</td><td>PROMEGA</td><td>N2014</td><td></td></tr><tr><td>Optimem I Azaltılmış Serum Mediun, fenol kırmızısı yok</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>Eppendorf</td><td>uygulanamaz</td><td></td></tr> <tr><td>ve gama;-Aminofenil-m7GTP (C<alt>10</alt>-aralayıcı)-Agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-155S</td><td></td></tr></tbody></table>

canlı hücrelerde eif4e-eif4g etkileşimi Ölçülerek eif4f montajlarını İzleme

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

eIF4F kompleksinin oluşumu, insanlarda sıklıkla onkojenik aktivasyona uğrayan sinyal yollarının yakınsaması için anahtar aşağı akış düğümü olarak gösterilmiştir. eIF4F, çeviri başlatmanın mRNA-ribozom işe alım aşamasında yer alan bir kapak bağlama kompleksidir. Birçok hücresel ve klinik öncesi kanser modelinde, eIF4F'nin deregülasyonu, kanserin çoğalması ve sağkalımında rol oynayan spesifik mRNA alt kümelerinin çevirisinin artmasına yol açar. eIF4F, kapak bağlama alt birliği eIF4E, helicase eIF4A ve iskele alt birliği eIF4G'den inşa edilmiş hetero-trimerik bir komplekstir. Aktif eIF4F komplekslerinin montajı için kritik olan eIF4E ve eIF4G proteinleri arasındaki protein-protein etkileşimidir. Bu makalede, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin durumunu izleyen eIF4F derlemesini ölçmek için bir protokol açıklıyoruz. eIF4e:4G hücre bazlı protein-protein etkileşimi tahlili, eIF4F karmaşık bütünlüğündeki ilaç kaynaklı değişikliklerin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini de sağlar. Bu yöntemin ticari olarak mevcut bileşiklerin aktivitesini doğrulamak veya eIF4F kompleksinin oluşumunu verimli bir şekilde bozan yeni bileşiklerin veya modalitelerin daha fazla taranması için uygulanabileceğini öngörüyoruz.

eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin hassasiyetini doğrulamak için mTOR inhibitörleri kullanılarak eIF4F kompleks montajının 4EBP1 aracılı inhibisyonu değerlendirildi. 4EBP protein ailesinin mTORC1 kinaz bağımlı fosforilasyonunu inhibe ederek, mTOR inhibisyonu eIF4E'ye 4EBP1 ilişkisini geliştirir ve bu nedenle eIF4F sökme15. MTOR kinazlarının mekanistik olarak farklı inhibitörünün iki sınıfı test edilmiştir: mTORC1'in allosterik inhibitörleri olan a...

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

eIF4F kompleks sinyalinin düzenlenmesi, kanser proliferasyonu ve sağkalımında rol oynayan mRNA alt kümesinin artan translasyonu ile ilişkilidir. Burada, canlı hücrelerde eIF4F kompleks bütünlüğünde ilaca bağlı bozulmayı değerlendirmemizi sağlayan bir eIF4E-eIF4G hücre bazlı protein-protein etkileşim testlerini açıklıyoruz. Protein-protein arayüzünü verimli bir şekilde hedefleyen modalitelerin geliştirilmesine artan bir ilgi vardır.eIF4E-eIF4G PPI testlerimizin bu stratejilerin geliştirilmesine ve doğrulanmasına yardımcı olacağını öngördük. Bu test, eIF4E-eIF4G inhibitörlerinin optimizasyonuna öncülük etmesi için optimal bir birincil şema sağlayacaktır. Hücrenin doğru bir şekilde tohumlanması ve transfer transfeksiyonunun gerçekleştirilmesi, bu ürünün en zorlu yönüdür, çünkü doğrudan PPI raporlama sisteminin baskılanmasına yansıyabilirler.Hücrelerin çözülmesinden ve sayılmasından sonra, oyuk başına 2 mililitre standart büyüme ortamı kullanarak HEK 293 hücreli 6 oyuklu plakayı tohumlayın. 2. günün sabahı, planlanan her transfeksiyon için, fenol kırmızısı içermeyen 125 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı içeren bir tüpte 9 mikrolitre lipozom bazlı çözeltiyi seyreltin. Seyreltilmiş lipozomlar oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilirken, her bir transfeksiyon tüpü için her bir plazmitin 3 mikrogramını 125 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyrelterek ana DNA karışımını hazırlayın.DNA ana karışımına 2'ye 12 mikrolitre arttırıcı reaktif ekleyin, ardından iyice karıştırın. Bu karışımı hemen 1 ila 1 oranında seyreltilmiş lipozomların her bir tüpüne ekleyin. Bu DNA lipid kompleksini oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ettikten sonra, kompleksi 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna ekleyin.Hücreleri 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. 3. günün sabahı, her birini 1 mililitre PBS ile durulayın ve 0.3 mililitre tripsin ekleyin. Plakaları 37 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin.İnkübasyondan sonra, fenol kırmızısı içermeyen indirgenmiş serum ortamının her bir oyuğuna 2 mililitre ekleyerek tripsini nötralize edin. Kesilen hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, hücreleri 290x G'de 5 dakika santrifüjleyin.Ortamı aspire edin ve hücre peletini indirgenmiş serum ortamının 2 mililitresinde yeniden süspanse edin. Kopyalanan HEK 293 hücrelerini, 90 mikrolitre ortamda oyuk başına 30.000 hücre yoğunluğunda, 96 oyuklu opak plakalara tohumlayın. Aynı deneyde 3 farklı bileşik için 3 teknik kopya elde etmek için 60 kuyu tohumlayın.Kenarlardaki kuyuları hariç tutun. Kopyalanan hücrelerin tohumlanmasından hemen sonra, her bir oyuğa 10 mikrolitre% 10 DMSO bileşik çözeltisi ekleyin. İlgilenilen her bir bileşiği %100 DMSO'da çözerek 1 milimolar bileşik stok çözeltisi hazırlayın.Her bileşik titrasyonu için 3 kopyaya sahip olmak için, 1 milimolar bileşik stok çözeltisinden 8 mikrolitre kullanın. Her titrasyon noktası için 1 milimolar stoğun 4 mikrolitresini 4 mikrolitre %100 DMSO'ya pipetleyerek 96 oyuklu bir PCR plakasının 8 oyuğunda her bir stok bileşiği çözeltisinin iki kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. İki katlı seri seyreltmenin son noktasından sonra fazla 4 mikrolitreyi atın.% 10 DMSO'da 40 mikrolitre 10x bileşik seri seyreltme çözeltisi hazırlamak için her tüpe 36 mikrolitre HPLC sınıfı steril su ekleyin. Ayrıca, bir denetim hazırlayın. HPLC sınıfı steril suda% 10 DMS tek stok çözeltisi.İstenen nihai konsantrasyonu elde etmek için 96 oyuklu opak plakadaki hücrelere 10 mikrolitre 10x çalışma solüsyonu ekleyin, kalıntı DMSO konsantrasyonu% 1 ile plakayı 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile 3 saat inkübe edin. 3 saat sonra, 1 hacim substratı 19 hacim seyreltme reaktifi ile birleştirerek lusiferaz substrat reaktifini hazırlamaya başlayın. Hücrelerle birlikte 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna hemen 25 mikrolitre substrat reaktifi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.Plakayı oda sıcaklığında 50 dakika boyunca 350 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Lüminesansı değerlendirmek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin. Ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 455'e ayarlayın.1 saniyelik bir ölçüm süresi ile 6,5 milimetrelik bir ölçüm yüksekliği kullanın. Hücre canlılığını değerlendirmek için, her oyuğa 33 mikrolitre canlılık tahlil reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika sonra, ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 600'e ayarlayarak plaka okuyucu ile lüminesansı değerlendirin.6,5 milimetrelik bir ölçüm yüksekliği ve 1 saniyelik bir ölçüm süresi kullanın. Her bir bileşiğin IC 50 değerini belirlemek için plaka okuyucudan gelen verileri kullanın, verileri makalede açıklanan 4 parametreli bağlantı eğrisi denklemine eğri uydurarak. HEK 293 hücreleri eIF4E-eIF4G kompleman sistemi ile transfekte edildi ve daha sonra geri çekildi ve mTOR inhibitörleri ile tedavi edildi.Lüminesans tedaviden 4 saat sonra değerlendirildiğinde, PP242 ve rapamisinin her ikisi de sinyalin doza bağlı bir inhibisyonunu üretti. Ne PP242 ne de rapamisin hücre canlılığında önemli bir azalmaya neden olmadı, bu da eIF4E-eIF4G tamamlama sistemindeki lüminesanstaki azalmanın spesifik olmayan hücre ölümünden değil, EIF4E-4G etkileşiminin bozulmasından kaynaklandığını gösteriyor. M7GTP aşağı çekme deneyini takiben Western blot analizi, endojen eIF4E-eIF4G etkileşiminin 4EBP1 aracılı bozulmasının ölçülen eIF4E-eIF4G tahlil sinyali ile ilişkili olduğunu gösterdi.PP242, rapamisinden daha güçlü bir toplam 4EBP1 fosforilasyon inhibitörüydü. Her iki inhibitör de normal olarak mTOR sinyalizasyonu üzerinde bir etki gösterdi, rapamisin mTORC1 substratlarına karşı daha aktifti ve PP242 hem mTORC1 hem de mTORC2'yi hedef aldı. Bu ürünün en kritik yönü, hücrelerin işlem gününde tohumlanması, hücrelerin fenol kırmızısı olmayan bir ortamda yeniden tohumlanması, eIF4E-eIF4G tamamlama testinin lüminesansının değerlendirilmesi ve aynı plaka üzerinde canlılık testinde çalıştırılmasıdır.Herhangi bir hedef ilacı ve bilinen spesifik etkileri değerlendirmek için ikincil bir canlılık testi yapılabilir.

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

FRET tabanlı gazetecilere giderek canlı hücre kinaz ve fosfataz aktiviteleri izlemek için kullanılır. Burada hedef fosforilasyon hücre döngüsü bağımlı değişiklikleri değerlendirmek için FRET tabanlı gazetecilere nasıl kullanılacağı hakkında bir metodu tanımlar.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Protein sentezi kontrolü esas olarak translasyon başlatma adımında gerçekleşir, eksiklikler çeşitli bozukluklarla bağlantılıdır. Etiyolojilerini daha iyi anlamak için, burada translasyon başlatma faktörü eIF4G1'in bir mutantının varlığında mos transkriptinin translasyonunu değerlendiren Xenopus laevis oositlerini kullanan bir protokol tanımladık.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Burada, IRF3 transkripsiyon faktörünün fosforilasyona bağlı aktivasyonunun ayrıntılı bir analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, yüksek çözünürlüklü bir SDS-PAGE ve çoklu fosfospesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlara bağlı bir doğal PAGE'nin kombinasyonu ile elde edilir.

Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör

Burada, fizyolojik oksijen koşulları sırasında mRNA'nın 5' başlığını bağlayan translasyon başlatma faktörlerini analiz etmek için insan hücre kültürü protokollerini sunuyoruz. Bu yöntem, Agaroz bağlantılı bir m7GTP başlık analoğu kullanır ve kapak bağlama faktörlerini ve bunların etkileşen ortaklarını araştırmak için uygundur.

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Bireysel çeviri olaylarını izlemek, kap bağımlı çeviri mekanizmalarının yüksek çözünürlüklü kinetik çalışmalarına izin verir. Burada floresan etiketli antikorlar ve epitop etiketli nascent peptitler arasındaki görüntüleme etkileşimlerine dayanan bir in vitro tek moleküllü test gösteriyoruz. Bu yöntem, aktif in vitro kap bağımlı çeviri sırasında başlatma ve peptit uzama kinetiğinin tek moleküllü karakterizasyonunu sağlar.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Burada, canlı HepG2 hücrelerinde Akt aktivasyonu ve fosforilasyonunun uzay-zamansal dinamiklerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme, kanser hücrelerinde insülin sinyal yolları ve metabolik düzenleme hakkında değerli bilgiler sağlayan güçlü bir araçtır.

HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi

Öğrenin canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçerek eIF4F kompleks dinamiklerini değerlendirme yöntemini. Bu hücre temelli analiz, kanser tedavileri için protein-protein etkileşim inhibitörlerinin geliştirilmesine katkı sağlar.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Daha fazla video keşfet