SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir ilgilenilen protein için protein etkileşim ortaklarını belirlemektir. Bu, ilk olarak, hücrelerin farklı kararlı karbon ve nitrojen izotopları ile etiketlenmiş arginin ve lizin içeren hücre kültürü ortamında büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ilgilenilen bir proteini veya bir kontrol plazmitini etiketli hücrelere transfekte etmek, plazmitler yapmak ve kaplamaktır.

Daha sonra, hücreler parçalanır ve numuneler lizatlardan immüno-çökeltilir. Daha sonra eşit hacimlerde kontrol ve numune immünoçökeltileri birleştirilir ve lc MS MS analizi için gönderilir. Son adım, ilgilenilen protein ile etkileşime giren proteinleri tanımlamak için kütle spektrometresi verilerini analiz etmektir.

Sonuç olarak, hücre kültüründe veya silac amino çökeltilerinde amino asitlerin kararlı izotop etiketlemesi, doku kültürü hücrelerinden ilgilenilen bir protein ile çok sayıda hem doğrudan hem de dolaylı etkileşimi tanımlayabilir. Bu tekniğin, musluk etiketleme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, araştırmacının kütle spektrometresinden tek tek bantları gönderme ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır. Bu, hassasiyeti artırırken önemli bir önyargı kaynağını ortadan kaldırır.

Bu yöntem hücresel protein hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilse de, protein etkileşimleri, patojen konak etkileşimlerinin incelenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Hücre kültürü kabından buz gibi soğuk PBS'ye GFP etiketli ilgilenilen proteini veya GFP kontrolünü eksprese eden SLAC etiketli HEK 2 93 T hücrelerini kazımaya başlamak için, hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 220 kez G'de santrifüjleyin, hücreleri 10 mililitre buz soğuğunda üç kez daha yıkayın PBS, hücre peletini yeni eklenmiş proteaz inhibitör kokteyli içeren 200 mikrolitre hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin bir X konsantrasyonunda üç ve mililitre lizis tamponu başına beş mikrolitre RNA kokteyli ekleyin, beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra hücre lizatını dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı çözünür hücre lizatı olarak tutun.

Bir BCA testi kullanarak hücre lizatının protein konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra, proteaz inhibitörleri içeren lizis tamponunu kullanarak her bir numune lizatındaki protein konsantrasyonunu 500 mikrolitrelik bir nihai hacimde normalleştirin. Toplam hacmi bir mililitreye ayarlamak için normalleştirilmiş hücre lizatlarının her birine üç x proteaz inhibitörü kokteyli içeren 500 mikrolitre seyreltme tamponu ekleyin.

Anti GFP boncukları hazırlarken lizatları buz üzerinde tutun ve numune girişi için kullanılacak her numuneden 50 mikrolitrelik bir alikot bulundurun. Boncukları yeniden askıya almak için boncuk bulamacını girdaplayın. Ardından, numune başına 25 mikrolitre boncuğu yeni bir tüpe aktarmak için ucu kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.

Her 25 mikrolitre boncuk bulamacı için, yıkamak için 20 hacim seyreltme tamponu ekleyin, boncukları beş dakika boyunca 2.700 kez G'de santrifüjleyin. Boncukları 20 hacim seyreltme tamponu ile ek sürelere kadar yıkayın. Daha sonra, 25 mikrolitre boncuk bulamacı başına 100 mikrolitre seyreltme tamponu ekleyin.

Ardından, 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın ve 85 mikrolitre yeniden askıya alınmış boncuk bulamacını SLAC etiketli numune Lysates'in her birine aktarmak için uç kesimi ile kullanın. Numuneler boncuklarla inkübe edildikten sonra iki saat boyunca dört santigrat derecede bir döndürücü üzerinde boncuklarla inkübe edin, numuneleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2.700 kez G'de santrifüjleyin. Bağlanmamış numune olarak 50 mikrolitre süpernatanı tutun ve süpernatantın geri kalanını atın.

Her tüpteki boncukları bir mililitre seyreltme tamponunda yeniden süspanse edin ve daha sonra dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2.700 kez G'de santrifüjleyin. Boncuklardan proteini çıkarmak için bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Her numuneye 50 mikrolitre iki XSDS yükleme tamponu ekleyin ve 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.

Isıtma bittiğinde, her bir numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2.700 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı önceden yağlanmış tüplere aktarın ve MS analizi için gönderilmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra eşit hacimlerde kontrol ve numune amino çökeltilerini karıştırın ve birleştirilmiş numuneyi lc ms MS analizi için bir kütle spektrometresi tesisine gönderin.

Kütle spektrometresi verilerini analiz etmeden önce, ham verileri yeni bir elektronik tabloya kopyalayın. Daha sonra bu elektronik tabloda, erişim numarasını, benzersiz peptit oranlarının sayısını, numunelerin karşılaştırılmasını, oran değişkenliğini ve protein tanımını içeren sütunlar dışındaki tüm sütunları kaldırın. Verileri peptit sayısına göre sıralamak ve birden fazla peptit içermeyen proteinler için girişleri kaldırmak için Excel sıralama işlevini kullanın.

Daha sonra orana göre sıralayın ve SLAC oranları olmayan proteinleri çıkarın. Ardından, slac oranlarını iki değer günlüğe kaydetmek için dönüştürün. Formülün kullanılması günlük parantezlerine, SLAC oranı ikisine ve hücre tanımlayıcısı yerine SLAC oranının değiştirildiği parantezlere eşittir.

Ardından Excel dosyasında yeni bir sütun oluşturun ve hesaplayın Sahte örnek oranını örnek sahte orana dönüştürmek için tüm örnek sahte sütunlar için günlük iki SLAC oranı. Eşittir formülünü bir bölü oran kullanın. GraphPad prizmasını açın.

Yeni veri tablosunu ve grafiği seçin: Pencerenin sol tarafındaki listeden sütunu seçin ve içe aktarma verilerini gir'i seçin. Sütun seçenekleri halinde yığılmış çoğaltma değerlerini girin. Oluştur'a basın.

Ardından, Excel elektronik tablosundan belirli bir günlük iki örnek sahte SLAC oranı sütununu seçin ve yeni prizma dosyasına kopyalayın. Ardından, açılır ekleme menüsünü tıklayın ve yeni analiz'i seçin. Sütun analizi'nin altında frekans dağılımını seçin.

Varsayılan seçenekleri koruyun ve Tamam'ı tıklayın. Sonuçlar klasöründe yeni bir histogram bölümü oluşturulmuş olacaktır. Frekans dağılımı bölümünü seçin, ardından açılır ekleme menüsünü tıklayın ve yeni analiz XY doğrusal olmayan regresyon eğrisi uyumunu seçin.

Gauss dağılımına tıklayın ve Tamam'a tıklayın. Görünen sonuçlar penceresinde ortalama ve standart sapma verilir. Excel dosyasına ortalama dönüşe 1,96 standart sapma ekleyerek bir eşik oluşturun.

Birleşik etiket sütunu A erişimi adlı yeni bir sekme oluşturun ve her bir denemedeki tüm erişim numaralarını bu tek sütuna kopyalayın. Ardından, veri sekmesini ve ardından kopyaları kaldır seçeneğini seçin. Ardından, her deneyden SLAC oranları ve oran değişkenliğinin yanı sıra protein adı açıklama sütunu için sütunlar oluşturun.

Açıklama sekmesinde, her bir erişim numarasının açıklamasını toplamak için DÜŞEYARA formülünü kullanın. Protein açıklamasını doldurmak için formülü sütundan aşağı sürükleyin ve ardından bu formülü tek tek deneylerden oran ve değişkenlik verilerini elde etmek için kullanın. Birleşik veri kümesindeki etkileşimli proteinleri vurgulamak için, belirli bir deney için eşik değerine dikkat edin.

Oran sütununu seçin ve ana sayfa sekmesine tıklayın. Ardından koşullu biçimlendirme, hücreleri vurgulayın, daha fazla kuralı seçin, ardından stil klasik biçimini seçin, yalnızca satış değeri büyük veya eşit olan satışları seçin. Kutuya 1,96 standart sapma değerini yazın ve Tamam'ı tıklayın.

Her pozitif etkileşim için oran değişkenliğini değerlendirin. Yüzde değişkenliği çıkarılırsa, isabet eşik değerinin altına düşer. Bu dikkatle ele alınmalıdır.

Sonuç sütunlarının her biri için bunu tekrarlayın ve deneyler arasında karşılaştırın: iki veya daha fazla deneyde tanımlanan vurgulanan proteinler yüksek güvenilirlikli bir etkileşimi temsil eder. Western blot analizi, ilgilenilen GFP etiketli proteinin saflaştırılmasını doğruladı. Bağlı numunelerde bir boşluk DH bandının olmaması, etkileşmeyen proteinlerin immünopresipitasyon adımı ile numunelerden tükendiğini gösterirken, bu numunelerde bir EIF 4G bandının varlığı, bilinen etkileşimli bağlanma ortaklarının korunduğunu gösterir.

Tanımlanan EIF dört A bağlayıcı proteinin birçoğu iki izoform arasında korunmuştur. EIF dört A ile etkileşime giren proteinler, yüksek LAC oranı ile tanımlanırken, bu deneyde spesifik olarak bağlı olmayan proteinler 0.96'nın altında oranlara sahiptir. Başlatma faktörü kompleksinin bu diyagramında, SLAC amino çökeltme deneyinde tanımlanan EIF dört A bağlayıcı proteinleri kırmızıdan beyaza gölgelendirilir.

Log iki SLAC oranına göre, EIF dört A bir ve iki kompleksinin hem doğrudan hem de dolaylı bağlanma ortaklarının yüksek kapsamı, protein etkileşimlerini tanımlamak için bu yaklaşımın etkinliğini göstermektedir Bu prosedürü denerken, protein seviyelerindeki bazı değişikliklerin veri analizi aşamasında telafi edilebildiğini hatırlamak önemlidir, Protein giriş seviyelerinin doğru bir şekilde normalleşmesini sağlayarak ve yıkama adımları sırasında aros boncuklarını kaybetmekten kaçınarak bunun önlenmesi en iyisidir.