Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Embriyo mikroenjeksiyon teknikleri, çok sayıda genetik temelli vektör kontrol aracının geliştirilmesine zemin hazırlamıştır. Çok sayıda böcek türü halihazırda iyi geliştirilmiş protokollere sahip olsa da, Culex quinquefasciatus nispeten az çalışılmıştır. Bu mikroenjeksiyon protokolü, yumurta toplama, yumurta sal ayırma ve enjeksiyon sonrası prosedürler dahil olmak üzere Culex quinquefasciatus'un benzersiz biyolojik özelliklerini barındırmak için özel olarak tasarlanmıştır.

Bu yöntem muhtemelen ilgilenilen herhangi bir Culex türüne uyarlanabilir ve gen fonksiyonunu incelemek veya Culex türleri için genetik tabanlı kontrol teknolojileri oluşturmak için kullanılabilir. Yumurtaları sallardan ayırarak başlayın. Salın üzerine bastırmak için forseps veya boya fırçası kullanın ve tek tek yumurtaları ayırın.

Yumurtaları, bir cam sürgünün üst kısmına yerleştirilmiş ince bir çift taraflı yapışkan bant şeridi üzerine hizalayın ve her bir yumurtanın ön tarafını aynı yöne doğru yönlendirmeye çalışın. Halokarbon reaktiflerini suyla hafifçe karıştırarak ve karışımı gece boyunca 25 santigrat derecede inkübe ederek halokarbon karışımını hazırlayın. Hizalanmış yumurtaları halokarbon yağ karışımı ile örtün.

Mikroenjeksiyonlar için iğneler oluşturmak için, üreticinin talimatlarını izleyerek bir alüminosilikat kılcal camı bir iğne çekiciye yerleştirin. Isıyı 560'a, hızı 100'e, gecikmeyi 70'e, çekmeyi 97'ye ve basıncı 500'e ayarlayın. Ardından iğne çekiciyi etkinleştirin.

İğne ucunu eğim vermek için çekilen iğnenin ucuna dönen elmas aşındırıcı plaka üzerinde 50 derecelik bir açıyla yaklaşık 10 saniye boyunca hafifçe dokunun. Çekilmiş ve eğimli iğneleri bir petri kabındaki modelleyici kil çizgilerine gömün. Genom modifikasyon reaktiflerinden oluşan enjeksiyon karışımını hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.

Enjeksiyon iğnesine iki mikrolitre enjeksiyon karışımı yüklemek için bir mikro yükleyici ucu kullanın. Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini elektronik bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin ve hizalanmış yumurtalarla birlikte cam slaytı bir bileşik mikroskop tablasına yerleştirin. Mikromanipülatörü kullanarak, iğneyi embriyonun arka ucunu 25 ila 35 derecelik bir açıyla hedefleyecek şekilde hizalayın.

İğneyi dikkatlice embriyoya yerleştirin ve karışımı embriyo hacminin yaklaşık% 10'u kadar bir miktarda enjekte edin. Bir seferde 20 yumurta enjekte edin, ardından durdurun ve embriyo kurtarma prosedürlerini gerçekleştirin. Enjeksiyondan sonraki 20 dakika içinde, halokarbon yağını yumurtalardan temiz bir boya fırçası ile hafifçe fırçalayarak dikkatlice çıkarın.

Yumurtaları boya fırçası ile kaldırın ve yumurtaları yüzeyde tutmaya özen göstererek bir bardak çift damıtılmış suya koyun. Önümüzdeki yedi gün boyunca, yumurtaları kuluçka için günlük olarak kontrol edin ve normal larva yetiştirme prosedürlerini izleyin. Enjekte edilen sivrisinekleri bir stereoskop kullanarak mutant fenotipler için tarayın.

Bu yöntem, koyu göz pigmentasyonunun gelişimi için kritik olan bir genin somatik ve germ hattı mutasyonlarını başarılı bir şekilde oluşturmak için kullanılmıştır. CRISPR-Cas9 tarafından oluşturulan somatik mutasyonlar, enjekte edilen bireylerin pupil evre gözlerinde pigmentasyon kaybı taraması yapılarak puanlandı. Somatik mutasyonlar genellikle mozaik fenotipler olarak mevcuttu, burada hücrelerin tamamı olmasa da bazıları mutant fenotipe sahipti.

Germ hattı mutasyon oranları, mozaik G sıfır bireylerin çaprazlanması ve tamamen beyaz gözlü yavru başına puanlama ile belirlendi. Bu deneyler, %64 ila 82'lik bir embriyo sağkalım oranı, %37 ila 57'lik bir somatik mutajenez oranı ve %61'den fazla germline mutajenez oranı ile sonuçlandı. Aynı gendeki birden fazla lokusu hedeflemek için sgRNA'ları çoğaltarak, somatik ve germ hattı mutajenez oranları %86'ya kadar yükseldiEk olarak, birçok nesil boyunca, beyaz mutantların canlı homozigot stokları laboratuvarda başarıyla tutulmuştur.

Sağkalım ve mutajenez oranlarını optimize etmek için, halokarbon yağı, enjeksiyon sıvısı ve iğneler dahil olmak üzere tüm materyaller mikroenjeksiyonlara başlamadan önce uygun şekilde hazırlanmalıdır. Bu, daha akıcı ve odaklanmış bir mikroenjeksiyon işlemine izin verecektir.