Birincil Murine Hipokampal Nöronlarda Majör Histocompatibility Complex Class I'in Akış Sitometrisi ile İfadesinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, farelerden kültürlenen primer nöronlarda hücre dışı MHC sınıf 1 ekspresyonunu kantitatif olarak değerlendirmek için akış sitometrisini kullanır. MHC1 ekspresyonu için NC2 immün boyama, protein, üçüncül, yapısal değişiklikler, geçirgenlik veya denatürasyon koşulları nedeniyle sinyal kaybını önlemek için de yapılabilir. Enfeksiyonlara karşı bağışıklık tepkilerini yönlendirmeye ek olarak, MHC sınıf 1 nöronal sinaptik bağlantıları modüle eder.

Bununla birlikte, MHC sınıf 1 ifadesini düzenleyen faktörler hala bilinmemektedir. Embriyonik beyin diseksiyonu adımlarında ustalaşmak için pratik yapılır. Tekniği öğrenirken, zaman veya sonraki kültür süreci hakkında endişelenmeden diseksiyonu uygulamaya özen gösterin.

Embriyonik hipokampusun izolasyonu için, ilk hasat edilen fare embriyonik beynini bir stereo-diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Ve koku soğancıklarını sıkıştırmak ve meninksleri iyice çıkarmak için iki çift Steril Dumont 5 numaralı forseps kullanın. Meninksler tamamen çıkarıldıktan sonra, korteksin üst tarafı hipokampusu ortaya çıkarmak için yanal olarak açılacaktır.

Hipokampusu bağlı korteksten uzaklaştırmak için forsepsleri kullanın ve izole edilmiş hipokampusu, buz üzerinde beş mililitre Hibernate-E Ortamı içeren Steril 15 mililitrelik konik bir tüpe dikkatlice aktarın. Tüm hipokampuslar 15 mililitrelik tek bir tüpte toplandığında, beyin dokusunu santrifüjleme ile çökeltin. Süpernatanı embriyo başına 0.5 mililitre taze hazırlanmış papain ayrışması ile değiştirin ve tüpü ters çevirerek birkaç kez karıştırın.

Dokuyu 30 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin, dokuyu santrifüjleme ile tekrar toplamadan önce numuneleri her 10 dakikada bir ters çevirerek karıştırın. Süpernatanı eşit hacimde taze Hibernate-E Medium ile değiştirin ve dokuyu 10 kez ezmek için tamamen açık cam, ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti kullanın. Dokunun iki dakika oturmasına izin verdikten sonra, süpernatanı 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın.

Dokuya eşit hacimde Hibernate-E Medium ekleyin ve dokuyu 10 kez ezmek için yarı açık cam ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti kullanın. Dokunun iki dakika daha oturmasına izin verdikten sonra, süpernatanı 50 mililitrelik tüpte toplayın. Dokulara eşit hacimde Hibernate-E Medium ekleyin ve dokuyu çeyrek açık cam ateşte parlatılmış Pasteur pipeti ile 10 kez ezin.

Dokunun iki dakika oturmasına izin verdikten sonra, süpernatanı 50 mililitrelik tüpte toplayın. Süpernatanttaki ayrışmış hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Ve peleti saymak için beş mililitre nöron büyüme ortamında yeniden süspanse edin: Hücreleri, mililitre nöron büyüme ortamı başına beş kez 10 ila beşinci canlı hücrenin son kaplama yoğunluğuna seyreltin ve her birine bir mililitre hücre ekleyin 12 oyuklu poli-D-lizin kaplı plaka.

Daha sonra plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve kültürün ömrü boyunca ortamın yarısını haftada iki kez eşit hacimde taze ortamla değiştirin. Kültürlenmiş nöronların MHC1'i eksprese etme yeteneğini değerlendirmek için, uygun kültür gününde, her bir oyuktaki 0.5 mililitre süpernatanı, hücre kültürü inkübatöründe altı ila 72 saatlik bir inkübasyon için mililitre başına 200 birim interferon beta ile desteklenmiş 0.5 mililitre taze nöron büyüme ortamı ile değiştirin. İnkübasyonun sonunda, mililitre FC bloğu başına bir mikrogram ve mililitre floresan konjuge anti-MHC1 antikoru başına bir mikrogram ile takviye edilmiş 0.5 mililitre takviyesiz soğuk Nörobazal Ortam eklemeden önce her bir kuyucuğu takviyesiz soğuk Neurobazal Medium ile bir kez yıkayın.

Dört santigrat derecede 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra, ışıktan koruyun. Her kuyuyu soğuk Dulbeccos PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 0.5 mililitre oda sıcaklığında enzim içermeyen hücre ayrışma tamponu ekleyin ve hücreleri çıkarmak için çalkalayın.

Ters doku kültürü mikroskobu altında ayrışmayı onaylayın ve her oyuğa 0,5 mililitre FACS tamponu ekleyin. Kümeleri dağıtmak için hücreleri ezin ve tüm hacmi her bir kuyudan ayrı ayrı 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti tüp başına 100 mikrolitre taze FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Her bir süspansiyonu 96 oyuklu bir U-alt plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın ve her oyuğa 100 mikrolitre fiksatif reaktif ekleyin. Hücre topaklanmasını önlemek için birkaç kez ezin ve plakayı ışıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, kuyucukların dibindeki hücreleri toplamak için santrifüjleyin ve peletleri kuyu başına 200 mikrolitre taze FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Santrifüjlemeden sonra, peletleri oyuk başına floresan konjuge anti-nöronal çekirdek antikoru ile takviye edilmiş 100 mikrolitre geçirgenlik reaktifi içinde yeniden süspanse edin. Karıştırdıktan sonra, plakayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ışıktan korunarak sallanarak inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri üç kez santrifüjleme ile toplayın ve peletleri santrifüjlemeler arasında 100 mikrolitre taze FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Son yıkamadan sonra, hücreleri FACS tamponunda 100 mikrolitre% 2 formaldehit çifti içinde iyice karıştırarak yeniden süspanse edin. Nöronlar, hücresel kalıntıları ve çiftleri dışlamak için toplam olayların sıralı geçitlenmesi ve nöronal çekirdek pozitifliği ile tanımlanabilir. Nöronal çekirdek pozitif hücreler daha sonra MHC1 pozitiflikleri için daha fazla analiz edilebilir.

Bu verilerden, MHC1 boyaması için pozitif nöronların yüzdesi ve medyan floresan yoğunluğu hesaplanabilir, bu da örneğin interferon beta tedavisinin MHC1 nöron ekspresyonunun yüzdesini ve yoğunluğunu önemli ölçüde artırdığını ortaya koymaktadır. Küçük değişikliklerle, bu yöntemler kortikal nöronlar gibi diğer nöronal popülasyonları kültürlemek veya farklı hücresel belirteçleri, uyarıcı molekülleri veya genetik modifikasyonları test etmek için kullanılabilir.