Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi İn Vivo A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Bu prosedürün genel amacı, retinal mikroglianın fagositik fonksiyonunu in vivo olarak değerlendirmektir. Bu yöntem, bazı bileşiklerin fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik fonksiyonunu değiştirip değiştirmediği gibi oftalmoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, mikroglial fagositozun hızlı ve kesin bir kantitatif analizine izin veren akış sitometrisini kullanmasıdır.

Prosedürü göstermeme yardımcı olacak, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Susumu Sakimoto olacak. 33 gauge bir iğne ve şırıngaya 0,5 mikrolitre floresan etiketli partikül çözeltisi yükleyerek başlayın. Daha sonra anestezi uygulanmış bir fareyi cerrahi mikroskop altında yumuşak bir malzeme üzerine yanlamasına yerleştirin ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun sedasyon seviyesini onaylayın.

Daha sonra, bir göz kapağının etrafına dikkatlice baskı uygulamak için forseps kullanın, böylece göz küresi yuvadan hafifçe dışarı çıkar. Daha sonra başını iki parmağınızla kulağın hemen üstünden ve hayvanın çenesinden kavrayın ve gözü yuvadan hafifçe şişkin tutmak için cildi göz kapaklarına paralel olarak nazikçe gerin. İntravitreal enjeksiyonlar zordur ve doğru şekilde yapılmazsa yanlı ve değişken sonuçlara yol açacaktır.

Göze gelen travmayı azaltmak için, hayvanı minimum kafa hareketi ile sabit bir pozisyonda tutun. Göz küresini delmek için, fareyi bir elinizle nazikçe kavrayın. Ardından, pigmentli farelerde gri bir daire olarak görülebilen kornea ve skleranın birleştiği kornea limpusunu bulun.

Diğer elinizdeki şırıngayı tutarak, iğneyi limbusa sokun. Ardından, küçük bir hacimde vitreus sıvısını dışarı atmak için iğneyi hafifçe geri çekin ve parçacıkları enjekte etmek için pistona yavaşça bastırın. Tüm boncuklar teslim edildiğinde, enjekte edilen malzemenin geri akışını önlemek için şırıngayı yavaşça geri çekin ve göz tekrar yerine geri çekildiğinde gözü nemli tutmak için nemlendirici damlalar uygulayın.

Daha sonra hayvanı, tamamen iyileşene kadar izleme ile kendi kafesinde bir ısıtma yastığına yerleştirin. İntravitreal enjeksiyondan üç saat sonra, göz küresini proptos etmek için göz kapağına hafifçe bastırmak için 45 derecelik açılı forseps kullanın. Forsepsleri göz küresinin arkasına yerleştirin ve çekin.

Daha sonra göz küresini, diseksiyon mikroskobu altında kalsiyum ve magnezyum içeren küçük bir hacimde PBS içeren bir petri kabının kuru alanına aktarın. Ve kornea limpusunda gözü delmek için çok ince bir forsepsin bir ucunu kullanın. Daha sonra, göz küresini 45 derecelik açılı forsepslerle tutarak, çevrenin kabaca yarısı kesilene kadar kornea limbusunun etrafını kesmek için yaylı makas kullanın.

Göz küresini PBS'ye aktarın ve kornea ve sklerayı ayırmak için ikinci bir çift ince 45 derece açılı forseps kullanın. Lens ve retina sağlam çıkacaktır. Lens ve retinanın ayrıldığından emin olun ve retinayı kalsiyum ve magnezyum içeren iki mililitre PBS içeren 5.4 mililitrelik bir polistiren test tüpüne aktarın.

Retina hücrelerinin tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için, üreticinin talimatlarına göre bir nöronal doku ayrışma kiti kullanın ve hücreleri 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra numuneyi 96 oyuklu U tabanlı bir plakanın bir kuyusuna aktarın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atmak için plakayı ters çevirin ve FC reseptörlerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca oyuk başına CD16, CD32 antikoru içeren 25 mikrolitre leke tamponu ile bloke edin.

Daha sonra, karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ilgili antikorlarla hücreleri etiketleyin. Daha sonra hücreleri pelet haline getirin ve bunu kuyucuk başına 200 mikrolitre taze boyama tamponunda yıkayın. Şimdi peletleri 200 mikrolitre leke tamponu ve canlılık boyası içinde yeniden süspanse edin ve numuneleri 1.2 mililitrelik mikrotitre tüplerine aktarın.

Daha sonra kuyucukları ek 100 mikrolitre boyama tamponu ve canlılık boyası ile yıkayın ve yıkamaları akış sitometrisi ile analiz için ilgili numunelerle bir araya getirin. Bu yöntem, 10 ila 20 günlük doğum sonrası veya yetişkin farelerde kullanılabilir ve bileşiklerin etkisini ve / veya mikroglial fagositozun genetik manipülasyonunu test etmek için uyarlanabilir. Örneğin, bu deneyde, değişen dozlarda LPS ile intraperitoneal meydan okumadan sonra, kilogram başına 1.42 miligramlık bir LPS dozunun, araç tarafından zorlanan kontrollere kıyasla fagositik mikroglia yüzdesinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışa neden olduğu belirlenmiştir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, hücre sınıflandırma ve ardından qPCR veya proteomik analiz gibi diğer yöntemler, retinadaki fagositik ve fagositik olmayan mikroglia arasındaki farklar hakkında daha fazla soruyu yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniği geliştirirken, görme ve sinirbilimcilerin mikroglial fagositik fonksiyonu yerinde ve fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda daha fazla keşfetmelerini mümkün kılabileceğimizi umuyoruz.