Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Numune Odası Tabanlı Işık Levhası Floresan Mikroskopları, yüksek verim yerine yüksek içerik için tasarlanmıştır. Bu nedenle canlı görüntüleme testleri sırayla yapılmalı ve bu nedenle ortam değişkenliğinden daha az etkilenmelidir. Örümcek ağı tutucumuz, birden fazla embriyonun istiflenmesine ve aynı anda görüntülenmesine olanak tanıyarak ortam değişkenliğini ortadan kaldırır ve verimi artırır.

Embriyoları örümcek ağı tutucusuna monte etmek belli bir incelik gerektirir. Açıklayıcı bir video, birçok kısa davranış hareketinin sırasını göstermek için idealdir. Işık Levhası Floresan Mikroskobu Tabanlı Numune Odasının kalibrasyonu için.

İlk olarak, bir agaroz alikotunu 80 santigrat derecede kuru blok ısıtıcı karıştırıcıda sıvılaştırın. Erimiş agarozun 35 santigrat dereceye kadar soğumasına izin verin ve 50 mikrolitre agarozu 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. 0.5 mikrolitre floresan mikroküre çözeltisini agaroz ile bir dakika boyunca dakikada 1.400 devirde karıştırın ve örümcek ağı tutucusunun oluklu deliğini 10 mikrolitre agaroz floresan mikroküre çözeltisi karışımı ile doldurun.

Sadece ince bir agaroz filmi kalana kadar mümkün olduğunca çok agarozu aspire edin ve agarozun 30 ila 60 saniye katılaşmasına izin verin. Numune haznesini otoklavlanmış musluk suyuyla doldurun ve örümcek ağı tutucusunu numune haznesine yavaşça yerleştirin. Algılama merceğinin önündeki oluklu deliği hareket ettirin ve tutucuyu aydınlatma ve algılama eksenlerine göre 45 derecelik bir konuma döndürün.

Örümcek ağı tutucusu, iletim ışık kanalında görünmemelidir. Uygun floresan kanalına geçin ve floresan mikro küreciklerin uygun bir sinyal sağlaması için lazer gücünü ve maruz kalma süresini ayarlayın. Şimdi enine yönlendirilmiş agaroz filmi tamamen kaplayan bir görüş hacmi belirleyin ve Z aralığını tanımlamak için ilgili aydınlatma ve algılama lensi kombinasyonu için mümkün olan maksimum eksenel çözünürlüğü hesaplayın.

Ardından, floresan mikro küreciklerin üç boyutlu bir test Z yığınını kaydedin ve X, Y ve Z maksimum projeksiyonlarını kalibrasyon tablosuyla karşılaştırın. Mikro küreler bulanık, bulanık ve/veya bozuk görünüyorsa. Aydınlatma ve/veya algılama merceklerinin konumlarını ayarlayın.

Embriyo dekoryonasyonu için, hat başına bir-altı oyuklu plakanın A1, A2, A3 ve B3 kuyularına sekiz mililitre otoklavlanmış musluk suyu ekleyin. Ardından, B1 ve B2 kuyularına yedi mililitre otoklavlanmış musluk suyu ve bir mililitre sodyum hipoklorit çözeltisi ekleyin. İlk plakayı stereo mikroskop altına yerleştirin ve ilk embriyo içeren hücre süzgecini A1 kuyucuğuna yerleştirin.

Süzgeci B1 kuyucuğuna taşımadan önce embriyoları 30 ila 60 saniye boyunca hafif çalkalama altında yıkayın. Süzgeci A30 kuyucuğuna aktarmadan önce plakayı 2 saniye kuvvetlice çalkalayın. Embriyoları hafif çalkalama altında bir dakika boyunca yıkayın ve embriyoların çoğu tamamen dekoryonasyon olana kadar kuvvetli çalkalamak için süzgeci B2 Kuyusuna taşıyın.

Daha sonra, diğer hatların embriyoları gösterildiği gibi muamele edilene kadar dekoryonlu embriyoların süzgecini B3 kuyucuğunda saklamadan önce, süzgeci bir dakikalık nazikçe yıkamak için A3 kuyucuğuna aktarın. Embriyoları örümcek ağı tutucusuna monte etmek için, gösterildiği gibi başka bir agaroz alikotunu sıvılaştırın. Agaroz soğuduğunda, örümcek ağı tutucusunu stereo mikroskobun altına yerleştirin ve oluklu deliğe 10 mikrolitre agaroz ekleyin.

Sadece ince bir agaroz filmi kalana kadar mümkün olduğunca fazla agarozu aspire etmeden önce, agarozu oluklu deliğin üzerine yaymak için pipet ucunu kullanın. Agaroz katılaştığında, embriyoları dikkatlice toplamak ve agaroz filmine aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Bunları, ön-arka eksenleri oluklu deliğin uzun ekseni ile aynı hizada olacak şekilde oluklu deliğin uzun ekseni boyunca düzenleyin.

Embriyoları stabilize etmek için, embriyolar ve agaroz filmi arasındaki boşluğa bir ila iki mikrolitre agarozu dikkatlice pipetleyin. Agaroz katılaştığında, monte edilmiş embriyolarla birlikte örümcek ağı tutucusunu görüntü tamponu ile doldurulmuş numune odasına yavaşça yerleştirin. Embriyoları görüntülemek için, örümcek ağı tutucusunun aydınlatma ve algılama eksenlerine göre 45 derecelik bir konumda olduğunu onaylayın ve iletim ışık kanalında embriyoyu görüş alanının merkezine hareket ettirin.

Örümcek ağı tutucusu görünmemelidir. Daha sonra, embriyonun orta düzlemi odak düzlemi ile örtüşene ve anahat keskin görünene kadar embriyoyu Z'deki mikro öteleme aşaması ile hareket ettirin. Floresan kanalına geçmeden, görüş hacmini belirtmek için embriyoyu her iki yönde 250 mikron hareket ettirin.

Birden fazla yönde görüntüleme gerekiyorsa, embriyoyu uygun şekilde döndürün, embriyoyu odak noktasına getirin ve az önce gösterildiği gibi görüş hacmini belirtin. Ardından, diğer tüm monte edilmiş embriyolar için bu işlemi tekrarlayın. Tüm embriyolar için görüş hacmi belirlendiğinde, floresan kanal ve hızlandırılmış parametreleri tanımlayın ve görüntüleme işlemini başlatın.

Birkaç gün süren tahliller için, buharlaşmayı azaltmak için numune haznesi açıklığını en azından kısmen kapatmayı düşünün. Görüntüleme testi sona erdiğinde, örümcek ağı tutucusunu numune odasından dikkatlice çıkarın ve embriyoları agaroz filmden ayırmak ve embriyoları uygun şekilde etiketlenmiş bir mikroskop lamına yerleştirmek için küçük bir boya fırçası kullanın. Slaytı, uygun standart yetiştirme koşulları altında inkübasyon için bir geri alma kabına yerleştirin.

Kuluçka zaman noktası yaklaştıkça, geri alma kaplarını sık sık kontrol edin ve yumurtadan çıkan larvaları 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Kuyuları yarısına kadar uygun büyüme ortamı ile doldurun, ardından larvaları uygun standart yetiştirme koşulları altında kuluçkaya yatırın. Gözlemlenen bireyler yetişkinliğe ulaştığında, uygun çiftleşme partnerleri sağlayın ve birkaç gün sonra dölleri kontrol edin.

Bu videoda, yaklaşık bir günlük bir süre boyunca farklı transgenik Drosophila hatlarından türetilen üç embriyonun floresan sinyal dinamikleri gözlemlenebilir. Benzer bir floresan paterni bekleniyordu, çünkü tüm hatlar muhtemelen her yerde bulunan ve kurucu olarak aktif promotörlerin kontrolü altında nükleer lokalize EGFP'yi ifade etti. Bununla birlikte, karşılaştırmalı canlı görüntüleme sonuçları, ortam değişkenliği nedeniyle ikincil etkiler olmayan ifade modellerinde güçlü uzamsal zamansal farklılıklar ortaya çıkardı.

Bu analizde, aynı piggyback tabanlı transgeni taşıyan üç Tribolium embriyosu. Gastrulasyon sırasında serosa pencere kapatma işleminin karşılaştırmalı canlı görüntüleme sonuçları, ikinci alt hattın diğer iki alt çizgiden önemli ölçüde daha güçlü bir genel sinyal sağladığını göstermektedir. Bu verilerin gösterdiği gibi, genomik bağlam, Tribolium'daki transgenlerin ekspresyon seviyesi üzerinde de güçlü bir etkiye sahip olabilir.

Yaklaşımımız, vahşi tip kontrol embriyolarının aynı anda görüntülenmesine izin verdiği için, nakavt ve nakavt fenotiplerini analiz etmek için çok uygundur. Protokolümüz ayrıca iki veya daha fazla böcek türünün morfogenezini karşılaştırmak için de kullanılabilir. Ve böylece, gelişimin evrimi hakkında daha derin içgörüler elde edin.