Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Bu temizleme tekniğinin genel amacı, sıçan beyni için bir doku temizleme yöntemi oluşturmaktır. Bu protokol aynı zamanda HIV-1 transgenik sıçan için de kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sıçan beyin dokusunun temizlenmesi için bozulmadan bırakılabilmesi ve böylece tam devre seviyesi analizine izin vermesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora adayı olan Kristin Kirchner ve ayrıca laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Hailong Li olacak. Üç ila altı haftalık bir sıçanda transkardiyal perfüzyon yaptıktan sonra, forseps kullanarak beyni kafatasından çıkarın. Daha sonra sagital pozisyona getirin ve bir tıraş bıçağı ve bir sıçan beyni matrisi kullanarak dört eşit üç milimetre genişliğinde bölümlere ayırın.

Her bölümü yüzde dört PFA'da, gece boyunca dört santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde kapalı beş mililitrelik plastik bir tüpe sabitleyin. Ertesi gün, sabitlemeye oda sıcaklığında bir saat devam edin. Her bölümü yıkama başına yaklaşık 30 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.

Yıkanan bölümleri 20, 40, 60, 80 ve %100 metanol çözeltisinde her biri bir saat boyunca seri olarak inkübe edin. Dehidrasyonu %100 metanol ile tekrarlayın. Daha sonra numuneleri %100 metanol içinde dört santigrat derecede 10 dakika soğutun.

% 66 DCM ve% 33 metanol içeren bir çözelti hazırlayın ve soğutulmuş bölümleri bu çözelti içinde gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayarak inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi 30 dakika boyunca metanol ile iki kez yıkayın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede %100 metanol içinde soğutun. Ağartma için, numuneyi metanol içinde taze yüzde beş hidrojen peroksit içine koyun ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Gece boyunca inkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında her biri bir saat boyunca 80, 60, 40 ve %20 metanol çözeltileri içinde seri olarak inkübe edin. Daha sonra numuneyi PBS'de bir saat inkübe edin ve iki kez solüsyon içinde, bir yıkama başına bir saat yıkayın. Bir mililitrelik bir şırıngayı 2,5 mikrolitre yüzde bir biotin-CTB ile doldurun ve 20 saniye boyunca yavaşça nucleus accumbens bölgesine enjekte edin.

İğne ucunu bir dakika yerinde bırakın ve sızıntıyı önlemek için 10 saniye boyunca yavaşça çıkarın. Numuneyi üçüncü çözeltide ve daha sonra dördüncü çözeltide her biri 37 santigrat derece su banyosunda iki gün boyunca inkübe edin. Daha sonra birincil antikoru ekleyin ve inkübasyona yedi gün boyunca devam edin.

Numuneyi, yıkama başına bir saat boyunca ikinci çözeltide beş kez yıkayın ve gece boyunca oda sıcaklığında ikinci çözeltide saklayın. Numuneyi 37 santigrat derece su banyosunda yedi gün boyunca ikincil bir antikor ile inkübe edin. Son olarak, yıkama başına bir saat boyunca ikinci solüsyonda beş kez yıkayın ve gece boyunca düşük ışıkta oda sıcaklığında ikinci solüsyonda saklayın.

Numuneyi oda sıcaklığında her biri bir saat boyunca %20, 40, 60, 80 ve %100 metanol içinde seri olarak inkübe edin. Daha sonra gece boyunca taze% 100 metanol içinde inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi taze hazırlanmış% 66 DCM'de% 33 metanol içinde oda sıcaklığında çalkalayarak üç saat inkübe edin.

Üç saat sonra, numuneyi berrak olana kadar çalkalamadan dibenzil eter içinde inkübe edin. Daha sonra görüntülemeye kadar dibenzil eter içinde saklayın. Bir 3D yazıcı odası edinin ve epoksi kullanarak bir mikroskop lamına sabitleyin.

Numuneyi haznenin ortasındaki kare boşluğa yerleştirin ve hazneyi tamamen dibenzil eter ile doldurun. Haznenin üzerine 0,17 milimetre kalınlığında bir örtü mendili yerleştirin ve hazne duvarlarıyla tam temas halinde olduğundan emin olmak için basınç uygulayın. Ardından kenarları epoksi kullanarak kapatın.

Doldurma girişinden hava kabarcıklarının çıkmasına izin vermek için hazneyi döndürdüğünüzden emin olun. Hazneyi ilave dibenzil eter ile doldurun. Daha sonra doldurma girişini epoksi ile kapatın ve kurulaşmasına izin verin.

Dört kat büyütmede bir z-taraması gerçekleştirmek için konfokal bir mikroskop sistemi kullanarak numuneyi gözlemleyin. Dört kat büyütmede hidrofobik olarak temizlenmiş doku örneğinin konfokal görüntüsü, substantia nigra alanında yoğun TH boyama, substantia nigra'ya bitişik seyrek TH nöronları ve TH nöronları olmayan koyu siyah bir doku alanı gösterir. 20 kat büyütmede TH pozitif bir nöronun tipik morfolojisi, büyük bir soma ve birkaç dallanma sürecine sahiptir.

IBA1 ile boyanmış mikroglia ise küçük hücre gövdelerine ve daha kısa uzama süreçlerine sahiptir. İdeal konfokal görüntü, uygun floresan kazancı ile substantia nigra bölgesinde pozitif ve yoğun TH boyamasını gösterir. Kötü konfokal görüntülerin örnekleri arasında çok fazla floresan kazancı olan yanlış odaklanmış bir görüntü, dokunun geri kalanıyla odaklanmayan parlak noktalarla yanlış pozitif boyama ve ikincil bir antikorla eşleşmeyen bir bloke edici serum kullanmanın bir sonucu olarak yüksek bir arka plan boyaması yer alır.

Sıçan beynindeki pozitif CTB boyaması burada gösterilmiştir. Uzun ince lifler, dopaminerjik yol boyunca sevgi dolu çıkıntılardır. TH ve CTB'nin kolokalizasyonu, yoğun floresan yeşil bir daire olarak görünen nucleus accumbens bölgesindeki enjeksiyon bölgesini görselleştirmeyi mümkün kılar.

Substantia nigra'da TH ve CTB'nin kolokalizasyonu burada gösterilmiştir. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şeyler, numunenin tüm antikor çözeltilerinde inkübe etmesi için bolca zaman tanımak ve görüntülemeden önce tamamen temizlenmesi için bolca zaman tanımaktır. Numuneye zarar vereceği için numunenin havaya sınırlı maruz kalması gerekir.

Bu teknik çok yönlüdür ve beynin farklı bölgelerinde ilgilenilen birçok farklı proteini araştırmak için kullanılabilir. Mevcut teknik, sinirbilimcilerin sıçan beynini, beynin bütün bir sistem olarak incelenmesi için gerekli olan bir devre düzeyinde araştırmalarının önünü açmaya yardımcı olmaktadır.