Name: Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin, sıçan beyni için hidrofobik doku temizleme yöntemiyle tam devre analizi yapmayı. Bu teknik, doku bütünlüğünü koruyarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibeleri tarafından finanse edildi: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & T32 Eğitim Hibesi 5T32GM081740

Tüm hayvan protokolleri Güney Carolina Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından incelendi ve onaylandı.
1. Stok çözeltisi hazırlama
<ol><li>Çözelti 1 (1 L): 900 mL'ye deiyonize H2O, 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ve 2 mL Triton X-100 ekleyin.</li>
	<li>Çözüm 2 (1 L): 900 mL deiyonize H2O'ya, 10x PBS'nin 100 mL'si, 2mL Ara-20 ve 1 mL'lik 10 mg/mL Heparin stok çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Çözelti 3 (500 mL): 400 mL Çözelti 1'e 11,5 g glisin ve 100 mL dimetilsüllfoksit (DMSO) ekleyin.</li>
	<li>Çözelti 4 (50 mL): 42 mL Çözelti 1'e, karşılık gelen serumun 3 mL'si ve 5 mL DMSO ekleyin.</li>
	<li>Primer antikor çözeltisi (50 mL): Çözelti 2'nin 46 mL'sine 2,5 mL DMSO ve karşılık gelen serumun 1,5 mL'si ekleyin.</li>
	<li>İkincil antikor çözeltisi (50 mL): Çözelti 2'nin 48,5 mL'sine karşılık gelen serumun 1,5 mL'sini ekleyin. NOT: Çözüm 4, birincil çözelti ve ikincil çözelti için ikincil antikora karşılık gelen bir serum kullanın (örneğin, keçi, at, sığır).</li>
</ol>2. Numune hazırlama
NOT: PFA'ya maruz kalmayı sınırlamak için duman kaputunda 2.1 ile 2.7 arasında adımlar uygulayın.
<ol><li>Sevoflurane kullanarak genç (3-6 hafta) sıçanı derinden uyuşturmak; sıçan yanıt vermediğinde ve parmak ve kuyruk kıskacına yanıt vermediğinde 2.2'ye geçin.</li>
	<li>Sıçanı sırtüstü bir konuma getirin ve bir çift İris makası kullanarak karın duvarından bir kesi yapın.</li>
	<li>Mayo makası kullanarak göğüs kafesinin dibinden göğüs kafesinin her iki tarafındaki köprücük kemiğine kadar kesin.</li>
	<li>Sternumu ve kaburgaları kalpten ve akciğerlerden hemostatla yapıştırın.</li>
	<li>Sol ventrikülü perfüzyon pompasına bağlı 23 G'lik bir iğneyle delin ve sağ kulakçığı Iris makasıyla kesin.</li>
	<li>Yaklaşık 75 mL 100 mM (1x) PBS ile transkardiyal perfüzyon gerçekleştirin.</li>
	<li>1x PBS'de tamponlanmış yaklaşık %4 paraformaldehit (PFA) 100 mL ile transkardiyal perfüzyona devam edin.</li>
	<li>Beyni kafatasından çıkardık.</li>
	<li>Beyni sagittal konuma getirin ve bir jilet ve sıçan beyin matrisi kullanarak 4 eşit bölüme (yaklaşık 3 mm genişlik) dilimleyin.</li>
	<li>Her bölümü 1x PBS'de %4 PFA'da, bir çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de gece boyunca kapalı, 5mL plastik bir tüpte sabitleyin.</li>
	<li>1 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında (RT) 1x PBS'de% 4 PFA'da sabitlemeye devam edin.</li>
	<li>Her bölümü RT'de 1x PBS ile 30 dakika, 3 kez yıkayın.</li>
</ol>3. Dehidrasyon ve depigmentasyon
<ol><li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %20 metanol/%80 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %40 metanol/%60 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %60 metanol/%40 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %80 metanol/%20 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca %100 metanolde numuneyi kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Numuneyi yaklaşık 10 dakika boyunca 4° C'de% 100 metanolde soğutun.</li>
	<li>%66 diklorometan (DCM)/%33 metanol çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Rt'deki DCM/metanol çözeltisinde numuneyi bir gecede sallanarak kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>RT'de metanol ile 30 dakika, 2 kez yıkayın.</li>
	<li>Numuneyi yaklaşık 10 dakika boyunca 4° C'de% 100 metanolde soğutun.</li>
	<li>4° C'de bir gecede metanolde soğutulmuş, taze hazırlanmış% 5 hidrojen peroksit içinde çamaşır suyu.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %80 metanol/%20 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %60 metanol/%40 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %40 metanol/%60 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %20 metanol/%80 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi 1x PBS'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Çözüm 1'de RT'de 1 saat, 2 kez yıkayın.</li>
</ol>4. Kolera Toksin Alt Üni B etiketleme
<ol><li>Çekirdek akumbens bölgesine 1 mL şırınga iğne ucu yerleştirin.</li>
	<li>Yavaşça 20 sn'nin üzerine% 1 biyotin-CTB'nin 2,5 μL'sini enjekte edin.</li>
	<li>İğne ucunu 1 dakika yerinde bırakın ve sızıntıyı önlemek için 10 sn'nin üzerinde yavaşça çıkarın.</li>
</ol>5. Antikor uygulaması
<ol><li>Numuneyi Çözelti 3'te bir su banyosunda 37 °C'de 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Numuneyi Çözelti 4'te bir su banyosunda 37 °C'de 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bir su banyosunda 37 °C'de 7 gün boyunca birincil antikor ile kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Çözelti 2'de 5 kez yıkayın, yıkama başına 1 saat inkübe edin. Çözüm 2'de rt'de bir gecede saklayın.</li>
	<li>Su banyosunda 37 °C'de 7 gün boyunca ikincil antikor ile kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Çözelti 2'de 5 kez yıkayın, yıkama başına 1 saat inkübe edin; Çözüm 2'de rt bir gecede saklayın. NOT: Son depolama dahil 5,6'dan itibaren tüm adımlar düşük ışıkta gerçekleşmelidir. Numune tüpleri alüminyum folyo ile korunabilir. Bu protokoldeki antikorlar için kullanılan konsantrasyonlar şöyleydi: TH 1:100'de, Iba1 1:200'de ve ikincil antikor 1:100'de. Tüplerin tamamen doldurulmasını sağlamak için 5.1-5.6 adımlarına ek Çözüm 2 ekleyin.</li>
</ol>6. Doku temizleme
<ol><li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %20 metanol/%80 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %40 metanol/%60 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %60 metanol/%40 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %80 metanol/%20 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %100 metanolde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>RT'de bir gecede taze %100 metanol içinde kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Oda sıcaklığında sallanarak 3 saat boyunca% 66 DCM / 33% metanol içinde kuluçkalayın.</li>
	<li>Dibenzyl eterde (DBE) titremeden kuluçkaya yatır. Numuneyi temizleyene kadar DBE'de bırakın ve görüntülemeye kadar DBE'de saklayın.</li>
</ol>7. Montaj
<ol><li>Visijet M3 Crystal reçineden yapılmış 3D baskılı bir oda edinin (idisco.info web sitesinde bulunan şablonlar).</li>
	<li>Hazneyi bir epoksi kullanarak mikroskop kaydırana sabitleyin.</li>
	<li>Örneği odanın ortasındaki kare alana yerleştirin.</li>
	<li>Odayı tamamen DBE ile doldurun.</li>
	<li>Odanın üzerine 0,17 mm kalınlığında bir kapak kılıfı yerleştirin ve kapak kapağı oda duvarlarıyla tam temas edene kadar basınç uygulayın.</li>
	<li>Kapak kapağının kenarlarını epoksi kullanarak odaya kapatın.</li>
	<li>Hava kabarcıklarının dolum girişinden kaçmasına izin vermek için odayı döndürün.</li>
	<li>Odayı ek DBE ile doldurun.</li>
	<li>Dolgu girişini epoksi ile kapatın ve kürlemesine izin verin. NOT: Montaj sırasında fazla DBE dökülür.</li>
</ol>8. Görüntüleme
<ol><li>4x büyütmede z taraması yapmak için bir konfokal mikroskop sistemi kullanın (ekli 3D videoyabakın).</li>
	<li>İkincil antikor tarafından belirtilen dalga boylarına benzer bir dalga boyunda yayacak bir lazer seti kullanarak numunenin floresan eksitasyonunu elde edin. TH ekscitasyon, 632 nm'de yayılması için bir HeNe lazer seti kullanılarak elde edildi.</li>
	<li>Dedektörü lazer emisyonu için yakın bir dalga boylarına ayarlayın. Mevcut protokol için, TH dedektörü 650 nm olarak ayarlandı.</li>
	<li>Görünür bir sinyal olana kadar dedektörün kazancını artırın. Görüntüler için 650LP kazancı 7.50 B olarak belirlendi.</li>
	<li>Konfokal görüntüleme yazılımındaki Tarama seçeneğini kullanarak, numune netleme getirilene kadar mikroskop aşamasını hareket ettinin.</li>
	<li>Tüm düzlüklerde dokunun etrafında gezinin ve konfokal görüntüleme yazılımını kullanarak tek görüntüler veya z yığını görüntüler elde edin.</li>
	<li>Görüntüleme tamamlandıktan sonra, numuneyi odadan çıkarın. Tamamen DBE ile dolu bir tüpe geri yerleştirin ve RT'de tercihen alüminyum folyo ile kaplı karanlık bir yerde saklayın. NOT: Floresan sinyali hala güçlü olduğu sürece numuneler yeniden monte edilebilir ve görüntülenebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298(2020).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li>
<li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li>
<li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens%3A+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).</li>
<li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins%2C+Tat+and+gp120%2C+target+the+developing+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li>
<li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404(2017).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152(2018).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurovirology%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li>
<li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li>
<li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braking+dopamine+systems%3A+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li>
<li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).</li>
<li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li>
<li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy%3A+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13(2019).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Doku temizleme, geleneksel IHC protokolünün sınırlamalarına bir çözüm sunar. Şeffaf olan bir örnek, sağlam dokulara hücresel düzeyde optik erişim sağlayan ışığın saçılmasını ve emilimini en aza indirir18,19. Doku temizleme teknikleri, çözücülerin yönetimi ile delipidasyon, dekolorizasyon ve kireçten arındırma yoluyla bir dokuyu şeffaf hale gelir. Doku örneğinin kırılma indeksi seçilen görüntüleme ortamının kırılma indeksiyle eşleştiğinde, örnek tamamen şeffaf gör...

Beyinde kullanım için çeşitli doku temizleme teknikleri doğrulanmıştır: hidrojel, hidrofilik ve hidrofobik. Bu teknikler, çözücülerin yönetimi yoluyla bir dokuyu delipidasyon, dekolorizasyon ve kireçten arındırma yoluyla şeffaf hale getirmeyi amaçlamaktadır. Doku örneğinin kırılma indeksi seçilen görüntüleme ortamının kırılma indisiyle eşleştiğinde, numunenin net bir görüntüsü elde edilebilir. CLARITY gibi hidrojel bazlı teknikler, dokudaki biyomolekülleri akril bazlı hidrojellere bağlayarak güvence altına almakta, bu da yapısal hasarı ve protein kaybını önler1. Bununla birlikte, hidrojel teknikleri daha kırılgan dokulara zarar verme potansiyeline sahip olandan daha sert kimyasallar kullanır ve daha yoğun doku örnekleri hidrojel protokolü ile uyumlu olmayabilir. Bazı hidrojel teknikleri pahalı ekipman gerektirebilir veya doku genişlemesine yol açabilir. CUBIC gibi hidrofilik teknikler, doku içinde hidrojen bağları oluşumu yoluyla 3D yapıyı korur2. Doku genişlemesi bazı hidrofilik protokollerde de ortaya çıkabilir. Hidrofilik tekniklerin temizleme yeteneği genellikle daha yoğun ve kalın dokular için önemli olan hidrofobik tekniklerin sahip olduğu yetenekle eşleşmez3.
Hidrofobik teknikler genellikle hızlıdır, özel ekipman gerektirmez ve kullanımı ve depolaması kolay bir örnek üretir. iDISCO, diğer hidrofobik protokollerde meydana gelebilecek büzülmeleri ortadan kaldıran bir hidrofobik tekniktir. Başlangıçta, iDISCO doku temizleme tekniği, farelerin embriyoları ve yoğun, yetişkin organları için Renier ve ark.4 tarafından tanımlanmıştır. Bu teknik, ilk dehidrasyon adımında dokudaki suyu temizler, böylece ışık saçılmasını azaltır. Doku, derin antikor penetrasyonunu sağlamak için ön işlem sırasında permeabilize edilir. Uzak kırmızı spektrumdaki Alexa Fluor boyaları, alt dalga boylarında dokunun otoflüoresansını önlemek için immünolabeling için kullanılır5. Hidrofobik temizleme protokollerinden geçen doku kolayca işlenebilir ve Alexa Fluor boyalarının uzun ömürlü olması nedeniyle birkaç kez görüntülenebilir. Düzgün bir şekilde saklanırsa, dokular ilk işlemden sonra aylarca ila bir yıl boyunca görüntü sağlayabilir.
Mevcut protokolde hem erkek hem de kadın kontrolünde ve HIV-1 transgenik (Tg) sıçan beyinlerinde tirozin hidroksilaz (TH) antikoru, Iba1 antikoru ve Kolera Toksini Alt Ünlem B (CTB) kullanılmıştır. HIV-1 Tg sıçanı, HIV-1 viral genomu oluşturan dokuz genden yedisine sahiptir, bu da uzun süreli HIV-1 protein maruziyetinin bulaşıcı olmayan bir modeline yol açar6,7,8. Dopaminerjik değişiklikler daha önce HIV-1 Tg sıçanında gösterilmiştir ve HIV-1'in kendisi enflamatuar bir hastalıktır, bu nedenle antikor seçimi deneysel tasarım 9 , 10,11,12ile ilişkiliydi. CTB, ganglioside bağlama yoluyla nöronlara bağlanan ve beyindeki farklı projeksiyonları izlemek için kullanılabilen bir izleyicidir. CTB daha önce çekirdek akumbens'ten substantia nigra bölgesine, beynin dopaminerjik yollar13 , 14,15ile yoğun olarak ilgili iki bölgesine kadar projeksiyonları incelemek için kullanılmıştır.
Bu protokolde, TH dopamin üretimi için bir işaretleyici olarak hizmet edecek ve Iba1 aktif mikrogliayı işaretleyecek. Kullanılan TH antikor, tirozin hidroksilaz'a karşılık gelen yaklaşık 62 kDa'da tek bir bandı seçici olarak etiketler. Iba1 antikorı Iba1 karboksi-terminal dizisine karşılık gelir. Her iki antikor da tavşanda bulundu ve poliklonaldi. CTB, nöronların çekirdek akumbens bölgesinden substantia nigra bölgesine retrograd izlenmesi için kullanılacaktır. Mevcut protokol ayrıca orijinal iDISCO protokolünün iki farklı şekilde ayarlanması için bir kılavuz sunar: 1) engelleme adımlarındaki serum reaktiflerini değiştirerek arka plan boyamanın genel olarak azaltılması ve 2) kuluçka süresinin daha büyük doku örnekleri için uygun olacak şekilde ölçeklendirilmesi. Genel olarak, mevcut protokol, hidrofobik temizleme tekniklerinin sıçanın beyin dokularında mümkün olduğuna, HIV-1 viral proteinlerle ayırt edilebilir zararlı etkileşimleri olmadığına ve TH antikor, Iba1 antikor ve CTB ile uyumlu olduğuna dair sürekli kanıtlar sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Kolera Toksin Alt Birimi B (Rekombinant), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 birincil antikoru</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil epoksi</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon makinesi</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>mini pompa değişken akışlı</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH birincil antikor</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

sıçan beyin dokusu için hidrofobik doku temizleme yöntemi

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hidrofobik doku temizleme yöntemleri, değiştirilmemiş doku örneklerinde ilgi molekülünün incelenmesini sağlayan kolayca ayarlanabilir, hızlı ve düşük maliyetli prosedürlerdir. Geleneksel immünolabeling prosedürleri, numunenin sağlam yapıları etiketleme ve inceleme yeteneğini kısıtlayan ince bölümlere kesilmesini gerektirir. Ancak, işlem sırasında beyin dokusu bozulmadan kalabiliyorsa, analiz için yapılar ve devreler bozulmadan kalabilir. Daha önce kurulan temizleme yöntemleri dokuyu tamamen temizlemek için önemli zaman alır ve sert kimyasallar genellikle hassas antikorlara zarar verebilir. iDISCO yöntemi dokuyu hızlı ve tamamen temizler, birçok antikorla uyumludur ve özel bir laboratuvar ekipmanı gerektirmez. Bu teknik başlangıçta fare dokusunda kullanım için doğrulandı, ancak mevcut protokol bu yöntemi kontrol ve transgenik sıçan beyinlerinin görüntü yarımkürelerine uyarlıyor. Buna ek olarak, mevcut protokol, daha az arka plan boyama ile daha net görüntüler sağlamak için önceden var olan protokolde birkaç ayarlama yapar. Iba-1 ve tirozin hidroksilaz antikorları HIV-1 transgenik sıçanda ve F344/N kontrol sıçanlarında mevcut hidrofobik doku temizleme yöntemi kullanılarak doğrulandı. Beyin, yapıların birbirinden ayrı olarak daha sık birlikte çalıştığı iç içe geçmiş bir ağdır. Beyni tek tek parçaların bir kombinasyonunun aksine bütün bir sistem olarak analiz etmek, tüm bu beyin temizleme yönteminin en büyük yararıdır.

Bu modifiye hidrofobik doku temizleme protokolü kullanılarak hem F344/N hem de HIV-1 sıçan beyin dokusunun geniş bölümlerinin tam olarak temizlenmesi sağlandı. Şekil 1, substantia nigra bölgesinde TH için tipik bir konfokal görüntü görüntüler. Şekil 1A yoğun, pozitif lekeleri temsil eder. Bu gibi yoğun alanlar pozitif lekeleme ve uygun hücre morfolojisini doğrulamak için "Z" düzlemine odaklanarak ayrıştırılabilir. Şekil 1B, TH nöron...

Burada, hedef moleküllerin sağlam beyin yapılarının bir parçası olarak görüntülenmesini sağlayan hidrofobik bir doku temizleme yöntemi sunuyoruz. Bu teknik artık F344/N kontrolü ve her iki cinsiyetten HIV-1 transgenik sıçanlar için onaylanmıştır.

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Bu temizleme tekniğinin genel amacı, sıçan beyni için bir doku temizleme yöntemi oluşturmaktır. Bu protokol aynı zamanda HIV-1 transgenik sıçan için de kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sıçan beyin dokusunun temizlenmesi için bozulmadan bırakılabilmesi ve böylece tam devre seviyesi analizine izin vermesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora adayı olan Kristin Kirchner ve ayrıca laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Hailong Li olacak. Üç ila altı haftalık bir sıçanda transkardiyal perfüzyon yaptıktan sonra, forseps kullanarak beyni kafatasından çıkarın. Daha sonra sagital pozisyona getirin ve bir tıraş bıçağı ve bir sıçan beyni matrisi kullanarak dört eşit üç milimetre genişliğinde bölümlere ayırın.Her bölümü yüzde dört PFA'da, gece boyunca dört santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde kapalı beş mililitrelik plastik bir tüpe sabitleyin. Ertesi gün, sabitlemeye oda sıcaklığında bir saat devam edin. Her bölümü yıkama başına yaklaşık 30 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.Yıkanan bölümleri 20, 40, 60, 80 ve %100 metanol çözeltisinde her biri bir saat boyunca seri olarak inkübe edin. Dehidrasyonu %100 metanol ile tekrarlayın. Daha sonra numuneleri %100 metanol içinde dört santigrat derecede 10 dakika soğutun.% 66 DCM ve% 33 metanol içeren bir çözelti hazırlayın ve soğutulmuş bölümleri bu çözelti içinde gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayarak inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi 30 dakika boyunca metanol ile iki kez yıkayın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede %100 metanol içinde soğutun. Ağartma için, numuneyi metanol içinde taze yüzde beş hidrojen peroksit içine koyun ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Gece boyunca inkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında her biri bir saat boyunca 80, 60, 40 ve %20 metanol çözeltileri içinde seri olarak inkübe edin. Daha sonra numuneyi PBS'de bir saat inkübe edin ve iki kez solüsyon içinde, bir yıkama başına bir saat yıkayın. Bir mililitrelik bir şırıngayı 2,5 mikrolitre yüzde bir biotin-CTB ile doldurun ve 20 saniye boyunca yavaşça nucleus accumbens bölgesine enjekte edin.İğne ucunu bir dakika yerinde bırakın ve sızıntıyı önlemek için 10 saniye boyunca yavaşça çıkarın. Numuneyi üçüncü çözeltide ve daha sonra dördüncü çözeltide her biri 37 santigrat derece su banyosunda iki gün boyunca inkübe edin. Daha sonra birincil antikoru ekleyin ve inkübasyona yedi gün boyunca devam edin.Numuneyi, yıkama başına bir saat boyunca ikinci çözeltide beş kez yıkayın ve gece boyunca oda sıcaklığında ikinci çözeltide saklayın. Numuneyi 37 santigrat derece su banyosunda yedi gün boyunca ikincil bir antikor ile inkübe edin. Son olarak, yıkama başına bir saat boyunca ikinci solüsyonda beş kez yıkayın ve gece boyunca düşük ışıkta oda sıcaklığında ikinci solüsyonda saklayın.Numuneyi oda sıcaklığında her biri bir saat boyunca %20, 40, 60, 80 ve %100 metanol içinde seri olarak inkübe edin. Daha sonra gece boyunca taze% 100 metanol içinde inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi taze hazırlanmış% 66 DCM'de% 33 metanol içinde oda sıcaklığında çalkalayarak üç saat inkübe edin.Üç saat sonra, numuneyi berrak olana kadar çalkalamadan dibenzil eter içinde inkübe edin. Daha sonra görüntülemeye kadar dibenzil eter içinde saklayın. Bir 3D yazıcı odası edinin ve epoksi kullanarak bir mikroskop lamına sabitleyin.Numuneyi haznenin ortasındaki kare boşluğa yerleştirin ve hazneyi tamamen dibenzil eter ile doldurun. Haznenin üzerine 0,17 milimetre kalınlığında bir örtü mendili yerleştirin ve hazne duvarlarıyla tam temas halinde olduğundan emin olmak için basınç uygulayın. Ardından kenarları epoksi kullanarak kapatın.Doldurma girişinden hava kabarcıklarının çıkmasına izin vermek için hazneyi döndürdüğünüzden emin olun. Hazneyi ilave dibenzil eter ile doldurun. Daha sonra doldurma girişini epoksi ile kapatın ve kurulaşmasına izin verin.Dört kat büyütmede bir z-taraması gerçekleştirmek için konfokal bir mikroskop sistemi kullanarak numuneyi gözlemleyin. Dört kat büyütmede hidrofobik olarak temizlenmiş doku örneğinin konfokal görüntüsü, substantia nigra alanında yoğun TH boyama, substantia nigra'ya bitişik seyrek TH nöronları ve TH nöronları olmayan koyu siyah bir doku alanı gösterir. 20 kat büyütmede TH pozitif bir nöronun tipik morfolojisi, büyük bir soma ve birkaç dallanma sürecine sahiptir.IBA1 ile boyanmış mikroglia ise küçük hücre gövdelerine ve daha kısa uzama süreçlerine sahiptir. İdeal konfokal görüntü, uygun floresan kazancı ile substantia nigra bölgesinde pozitif ve yoğun TH boyamasını gösterir. Kötü konfokal görüntülerin örnekleri arasında çok fazla floresan kazancı olan yanlış odaklanmış bir görüntü, dokunun geri kalanıyla odaklanmayan parlak noktalarla yanlış pozitif boyama ve ikincil bir antikorla eşleşmeyen bir bloke edici serum kullanmanın bir sonucu olarak yüksek bir arka plan boyaması yer alır.Sıçan beynindeki pozitif CTB boyaması burada gösterilmiştir. Uzun ince lifler, dopaminerjik yol boyunca sevgi dolu çıkıntılardır. TH ve CTB'nin kolokalizasyonu, yoğun floresan yeşil bir daire olarak görünen nucleus accumbens bölgesindeki enjeksiyon bölgesini görselleştirmeyi mümkün kılar.Substantia nigra'da TH ve CTB'nin kolokalizasyonu burada gösterilmiştir. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şeyler, numunenin tüm antikor çözeltilerinde inkübe etmesi için bolca zaman tanımak ve görüntülemeden önce tamamen temizlenmesi için bolca zaman tanımaktır. Numuneye zarar vereceği için numunenin havaya sınırlı maruz kalması gerekir.Bu teknik çok yönlüdür ve beynin farklı bölgelerinde ilgilenilen birçok farklı proteini araştırmak için kullanılabilir. Mevcut teknik, sinirbilimcilerin sıçan beynini, beynin bütün bir sistem olarak incelenmesi için gerekli olan bir devre düzeyinde araştırmalarının önünü açmaya yardımcı olmaktadır.

a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, sıçan beyin dokusu dilimlerini görselleştirmek ve orta serebral arter tıkanıklığı ve reperfüzyonunu takiben canlı ve hasarlı dokuyu ayırt etmek için 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolyum klorür boyama prosedürü açıklanmaktadır.

Sıçan Beyin Dokusu Dilimlerinin TTC Boyama: İskemi-Reperfüzyon Hasarı Sonrası Doku Dilimlerinde Canlı ve Nekrotik Dokuyu Ayırt Etmek İçin Bir Boyama Prosedürü

Bu video, ötenazi uygulanmış sıçanlardan beyin mikro damarlarını izole etme sürecini göstermektedir. Beynin diseksiyonunu, dokunun temizlenmesini ve mekanik sindirimi ve ardından mikro damarların saf fraksiyonunu izole etmek için tekrarlanan santrifüjlemeyi içerir.

Sıçan Beyninden Nörovasküler Ünitelerin İzolasyonuna Yönelik Bir Yöntem

Kaynak: Kirchner, K.N., et al., Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi. J. Vis. Uzm. (2020). Bu video, bir sıçan beyin dokusu örneğinin hidrofobik doku temizleme yöntemini göstermektedir. Numune metanol içinde sırayla dehidre edilir, lipitleri ve pigmentleri çözmek için bir diklorometan ve metanol karışımı ile muamele edilir ve tam doku temizliği için dibenzil etere aktarılır, bu da ince kesit almadan ayrıntılı görüntüleme sağlar.

Sıçan Beyin Dokusu Örneği için Hidrofobik Bir Doku Temizleme Yöntemi

Sistemik hipotansiyon ile birlikte iki taraflı karotis tıkanıklığı tekrarlanabilir şiddeti ile hipokampus hasar görebilir, sıçan küresel beyin iskemi üretir. Hayvanlar üzerinde beyin hasarı tahmin modelleri ile engelli, onlar expediently kurtarmak ve ölüm oranları nispeten düşüktür.

2-Gemi Tıkanıklığı / Hipotansiyon: Küresel Beyin İskemi Rat Modeli

Biz burada, formalinle fiksasyonlu, parafine gömülü sıçan merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik lenf nodu (LN) doku kesitlerinde çift immün boyama için optimize edilmiş, ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Nöronal ağların yapısını anlamak için, bireysel nöronların fonksiyonel ve morfolojik karakterizasyon bir zorunluluktur. Burada, juxtasomal biocytin dışı yapılandırmada elektrofizyolojik kayıtları etiketleme izin verir, ama hücre içi dendritik ve aksonal mimari post hoc yeniden için nöron etiket yeteneğini muhafaza göstermektedir.

Juxtasomal Biocytin Etiketleme Bireysel Kortikal nöronlar yapı-fonksiyon ilişkisi Çalışması için

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi kullanılarak gangliosidlerin tespiti için DAN matrisinin sıçan beyin dokusu üzerine süblimleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Burada, sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı örnekleri kabul edilebilir protein ile bireysel hayvanlardan verim zenginleştirilmiş microvessel üreten açık avantajı vardır. Örnekleri daha sonra beyin mikrovasküler endotel, sağlam protein analizleri için kullanılabilir.

Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem

Otolog kanın çift enjeksiyonu yoluyla bir sıçanda büyük bir pontin kanama modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Otolog Kanın Çift Enjeksiyonu ile Masif Pontine Kanaması

Nöronal dendritik morfoloji genellikle fonksiyon alttan. Gerçekten de, nöronların gelişimini etkileyen birçok hastalık süreci morfolojik bir fenotip ile kendini gösterir. Bu protokol, bozulmamış dendritik çardakları ve ilişkili dikenlerini analiz etmek için basit ve güçlü bir yöntemi açıklar.

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Bu çalışma, korunmuş floresan sinyalleri ile temizlenmiş tüm beyin ve omurilik örneklerinin çıkarılması ve hazırlanması için bir protokol sunmakta, sinirbilim araştırmalarını ilerletmek için deneysel verimliliği ve veri bütünlüğünü artırmaktadır.

Fare Beyin-Omurilik Örneklerinin Ekstraksiyonu ve Doku Temizleme Hazırlanması

Öğrenin, sıçan beyni için hidrofobik doku temizleme yöntemiyle tam devre analizi yapmayı. Bu teknik, doku bütünlüğünü koruyarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Daha fazla video keşfet