Fekal (mikro) RNA İzolasyonu
28 Ekim 2020
Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.
MikroRNA'ları incelemek için dışkı örneklerinden RNA'yı izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, RNA'yı dışkıdan yüksek kalite ve miktarda izole etmek için kullanılabilir. Canlı mikroplardan gelen RNA'ları en aza indirir.
Bunu vurgulamak önemlidir ve bu protokolde bağlayıcı tampon kullanılmamaktadır. Bu protokol basit ve anlaşılır. İki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 600 mikrolitre steril 1X DPBS'de 25 ila 100 miligram dışkı örneğini yeniden süspanse ederek başlayın.
Numuneyi içeren tüpü oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra karışımı bir mililitrelik pipet ucuyla ezin ve iyice girdaplayın. Karışımı, RNA miktarını ve kalitesini optimize etmek ve artırmak için 45 saniye boyunca dakikada 4.000 dönüşte bir döngü ayarına sahip bir homojenizatörde yeniden süspanse edin.
Numuneye 600 mikrolitre asit fenol kloroform çözeltisi ekleyin ve karışımı 60 saniye boyunca girdaplayın. Alternatif olarak, verimdeki artan miktarda RNA'yı optimize etmek için, onu bir homojenizatör ile karıştırın. Sulu ve organik fazı ayırmak için numuneyi oda sıcaklığında 10.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
Arayüz kompakt olana kadar santrifüjlemeyi tekrarlayın. Alt fazı bozmadan üst sulu fazı dikkatlice menteşe kapaklı iki mililitrelik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Elde edilen sulu fazın hacminin 1.25 katına ACS derecesi% 100 etanol ekleyin ve üç saniye boyunca girdap yapın.
Filtre kartuşunu toplama tüplerine yerleştirin. MikroRNA izolasyon kitinde sağlanan filtre kartuşuna numunelerin her birinden 600 mikrolitre yükleyin. Karışımı kartuştan süzmek için 10.000 x g'da 90 saniye santrifüjleyin.
Ardından süzüntüyü atın. Bunu, ardışık uygulamalarda karışımın tüm hacmi aynı filtre membranından süzülene kadar tekrarlayın. Sonuçta, numune filtrelenir.
aynı filtre kartuşuna 700 mikrolitre mikroRNA yıkama solüsyonu 1 ekleyin. Yıkama solüsyonunu filtre kartuşundan süzmek için 60 saniye santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.
Filtre kartuşunu ACS sınıfı% 100 etanolde hazırlanmış 700 mikrolitre yıkama solüsyonu 2/3 ile yıkayın ve bir dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süzüntüyü atın ve filtre kartuşunu aynı tüpe yerleştirin. Filtre kartuşunu 500 mikrolitre yıkama solüsyonu 2/3 ile yıkayın ve bir dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
Elde edilen süzüntüyü atın ve filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin. Filtre kartuşunu ACS sınıfı% 100 etanolde hazırlanmış 250 mikrolitre yıkama solüsyonu 2/3 ile yıkayın ve bir dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süzüntüyü atın ve filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.
Son olarak, filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve kalan sıvıyı çıkarmak için tertibatı beş dakika döndürün. Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın, ardından filtrenin ortasına 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve tüpü kapatın. Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
Daha sonra, RNA'yı yeni bir toplama tüpüne geri kazanmak için tüpü 8.000 x g'da beş dakika döndürün. RNA'nın çip bazlı bir elektroforez testi, fare ve insan dışkısından elde edilen temsili RNA izolatlarının 18S ve 28S rRNA bileşimlerinin düşük olduğunu veya olmadığını ve RNA izolatlarının boyutunun küçük RNA bölgesine düştüğünü göstermektedir. Çip bazlı elektroforez ile daha küçük bir RNA elektroforezi, RNA'ların büyük bir kısmının mikroRNA boyutunda olduğunu ortaya çıkardı.
Ekstrakte edilen RNA'nın saflığı, 260 ve 280 nanometre dalga boyları için 2.0 absorbans oranı ve 260 ve 230 nanometrede absorbans için 1.8 oran değeri ile gösterildiği gibi yüksekti. Organik ekstraksiyonun başarısını sağlamak için, yüzlerin belirgin olduğundan emin olun ve sulu fazımızın hacminin azalması pahasına bile, alt fazı bozmadan sadece üst sulu fazı transfer edin.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, dışkı örneklerinden yüksek kaliteli RNA'yı izole etmek için yaşayan mikroplardan gelen kirliliği en aza indiren basit bir yöntem sunar. Hem hayvan hem de insan örnekleri için tasarlanmış olup, sonraki uygulamalar için optimize edilmiş verim ve saflığı garanti eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Mikrobiyoloji
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Dışkı örneklerinden RNA izole etmek, mikroRNA'ları incelemek için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler mikrobiyal RNA'dan kaynaklanan kirlenmeye yol açabilir.
- Yüksek kaliteli RNA, sonraki analizleri doğru bir şekilde yapmak için esastır.
- Bu protokol, geliştirilmiş sonuçlar için ticari bir miRNA izolasyon kitini uyarlar.
Çalışmanın Amacı
- Dışkıdan RNA ekstraksiyonu için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- RNA izolatlarının kalitesini ve miktarını artırmak.
- Çeşitli biyolojik bağlamlarda mikroRNA'lar üzerinde araştırma yapmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Dışkı örneklerinin steril 1X DPBS içinde yeniden süspanse edilmesi.
- İşleme için iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpünün kullanılması.
- Ticari bir miRNA izolasyon kitinin uyarlanması.
- Yaşayan mikroplardan gelen RNA kirlenmesinin en aza indirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'nın başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Optimize edilmiş protokol, dizileme ve RT-PCR için uygun RNA verir.
- Mikrobiyal RNA kirlenmesini azaltmada etkinliği gösterilmiştir.
- Protokol, araştırmacılar için basit ve anlaşılırdır.
Sonuçlar
- Bu protokol, dışkı örneklerinden RNA ekstraksiyonu için güvenilir bir yöntem sunar.
- Yüksek kaliteli RNA, sonraki uygulamalar için esastır.
- Ticari kitlere yapılan uyarlamalar RNA verimini ve saflığı artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity RNA from fecal samples enables mechanistic de-risking in target validation by providing access to host-derived microRNAs without microbial contamination. This supports predictive confidence in biomarker discovery and pathway analysis for gastrointestinal and systemic diseases. The protocol’s scalability and reproducibility facilitate enterprise reuse across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host microRNA signatures in feces for therapeutic hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing confounding signals from living microbes in sample preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces RNA isolates suitable for sequencing, RT-PCR, and microarray applications, enabling reliable compound screening readouts.
- Operational Value: Standardized washing steps and phase separation ensure reproducibility and scalability for high-throughput assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by yielding disease-relevant small RNA profiles from animal and human fecal models.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with consistent RNA quality and quantity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical validation by providing a standardized input for omics and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by isolating host-derived RNA from complex fecal matrices.
- Screening: Enables assay readiness through high-yield, pure RNA outputs compatible with downstream analytical platforms.
- Analytics: Delivers quantitative RNA measurements with high purity (A260/A280 ~2.0, A260/A230 ~1.8) for accurate condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via species-agnostic application in mouse and human models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for fecal RNA isolation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced microbial contamination and enhanced target validation in host-microbiome studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via optimized resuspension, washing, and filtration steps.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker-driven programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reliable RNA-derived data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and phase separation techniques to avoid interphase disruption.
- Dependent on centrifugation equipment capable of 10,000 x g and homogenization at 4,000 rpm for sample processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample mass limits (25–200 mg) to ensure consistent aqueous phase recovery.
- Adaptation considerations include adjusting wash volumes and incubation times for varying sample types and inhibitor loads.
- Practical limitation: samples exceeding 200 mg may compromise phase separation and RNA purity due to interface instability.
