Fekal (mikro) RNA İzolasyonu

MikroRNA'ları incelemek için dışkı örneklerinden RNA'yı izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, RNA'yı dışkıdan yüksek kalite ve miktarda izole etmek için kullanılabilir. Canlı mikroplardan gelen RNA'ları en aza indirir.

Bunu vurgulamak önemlidir ve bu protokolde bağlayıcı tampon kullanılmamaktadır. Bu protokol basit ve anlaşılır. İki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 600 mikrolitre steril 1X DPBS'de 25 ila 100 miligram dışkı örneğini yeniden süspanse ederek başlayın.

Numuneyi içeren tüpü oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra karışımı bir mililitrelik pipet ucuyla ezin ve iyice girdaplayın. Karışımı, RNA miktarını ve kalitesini optimize etmek ve artırmak için 45 saniye boyunca dakikada 4.000 dönüşte bir döngü ayarına sahip bir homojenizatörde yeniden süspanse edin.

Numuneye 600 mikrolitre asit fenol kloroform çözeltisi ekleyin ve karışımı 60 saniye boyunca girdaplayın. Alternatif olarak, verimdeki artan miktarda RNA'yı optimize etmek için, onu bir homojenizatör ile karıştırın. Sulu ve organik fazı ayırmak için numuneyi oda sıcaklığında 10.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.

Arayüz kompakt olana kadar santrifüjlemeyi tekrarlayın. Alt fazı bozmadan üst sulu fazı dikkatlice menteşe kapaklı iki mililitrelik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Elde edilen sulu fazın hacminin 1.25 katına ACS derecesi% 100 etanol ekleyin ve üç saniye boyunca girdap yapın.

Filtre kartuşunu toplama tüplerine yerleştirin. MikroRNA izolasyon kitinde sağlanan filtre kartuşuna numunelerin her birinden 600 mikrolitre yükleyin. Karışımı kartuştan süzmek için 10.000 x g'da 90 saniye santrifüjleyin.

Ardından süzüntüyü atın. Bunu, ardışık uygulamalarda karışımın tüm hacmi aynı filtre membranından süzülene kadar tekrarlayın. Sonuçta, numune filtrelenir.

aynı filtre kartuşuna 700 mikrolitre mikroRNA yıkama solüsyonu 1 ekleyin. Yıkama solüsyonunu filtre kartuşundan süzmek için 60 saniye santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.

Filtre kartuşunu ACS sınıfı% 100 etanolde hazırlanmış 700 mikrolitre yıkama solüsyonu 2/3 ile yıkayın ve bir dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süzüntüyü atın ve filtre kartuşunu aynı tüpe yerleştirin. Filtre kartuşunu 500 mikrolitre yıkama solüsyonu 2/3 ile yıkayın ve bir dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.

Elde edilen süzüntüyü atın ve filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin. Filtre kartuşunu ACS sınıfı% 100 etanolde hazırlanmış 250 mikrolitre yıkama solüsyonu 2/3 ile yıkayın ve bir dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süzüntüyü atın ve filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.

Son olarak, filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve kalan sıvıyı çıkarmak için tertibatı beş dakika döndürün. Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın, ardından filtrenin ortasına 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve tüpü kapatın. Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra, RNA'yı yeni bir toplama tüpüne geri kazanmak için tüpü 8.000 x g'da beş dakika döndürün. RNA'nın çip bazlı bir elektroforez testi, fare ve insan dışkısından elde edilen temsili RNA izolatlarının 18S ve 28S rRNA bileşimlerinin düşük olduğunu veya olmadığını ve RNA izolatlarının boyutunun küçük RNA bölgesine düştüğünü göstermektedir. Çip bazlı elektroforez ile daha küçük bir RNA elektroforezi, RNA'ların büyük bir kısmının mikroRNA boyutunda olduğunu ortaya çıkardı.

Ekstrakte edilen RNA'nın saflığı, 260 ve 280 nanometre dalga boyları için 2.0 absorbans oranı ve 260 ve 230 nanometrede absorbans için 1.8 oran değeri ile gösterildiği gibi yüksekti. Organik ekstraksiyonun başarısını sağlamak için, yüzlerin belirgin olduğundan emin olun ve sulu fazımızın hacminin azalması pahasına bile, alt fazı bozmadan sadece üst sulu fazı transfer edin.