Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Shailesh  K. Shahi; Kasra Zarei; Natalya  V. Guseva; Ashutosh K. Mangalam

doi:10.3791/59980

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

Full Text

31,384 Views

11:22 min

October 15, 2019

DOI: 10.3791/59980-v

Shailesh K. Shahi¹, Kasra Zarei², Natalya V. Guseva¹, Ashutosh K. Mangalam^1,2,3,4

¹Department of Pathology,University of Iowa, ²Medical Scientist Training Program,University of Iowa, ³Graduate Program in Immunology,University of Iowa, ⁴Graduate Program in Molecular Medicine,University of Iowa

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a detailed methodology for microbiome profiling through 16S rRNA metagenomic sequencing. Aimed at both novice and experienced researchers, the protocol offers insights into achieving accurate bacterial profiling using accessible tools.

Key Study Components

Research Area

Microbiome analysis
Metagenomic sequencing
Bacterial profiling

Background

The microbiome's role in health and disease
Importance of high-quality DNA isolation
Applications in various biological specimens

Methods Used

16S rRNA sequencing protocol
Fecal sample preparation and DNA extraction
Use of freely available bioinformatics tools for analysis

Main Results

Successful isolation of high-quality bacterial DNA
Robust library preparation for sequencing
Detailed guidance for researchers to establish microbiome pipelines

Conclusions

The study offers a comprehensive protocol for microbiome profiling.
It enhances understanding of microbiome methodologies relevant to health research.

Frequently Asked Questions

What is the main goal of this protocol?

To provide a standardized method for microbiome profiling using 16S rRNA sequencing.

Can this protocol be used for other biospecimens?

Yes, it can be extended to nasal, oral, or skin samples from humans and animals.

Why is DNA quality important in this process?

High-quality DNA ensures accurate downstream analysis and sequencing results.

What tools are recommended for analysis?

Freely available bioinformatics tools are suggested for data analysis.

What steps are crucial in the DNA extraction process?

Bead picking and proper sealing of the preservation plate are critical for quality.

Who can benefit from this protocol?

Both novice and experienced microbiome researchers can utilize this protocol.

Burada açıklanan serbestçe kullanılabilir araçları kullanarak 16S rRNA metagenomik sıralama ve analiz kullanarak mikrobiyom profilleme için basitleştirilmiş bir standart işletim prosedürüdür. Bu protokol mikrobiyom alanında yeni araştırmacılar yanı sıra daha yüksek bir çözünürlükte bakteriyel profilleme elde etmek için yöntemler güncellemeleri gerektiren yardımcı olacaktır.

Mikrobiyom profilleme sağlık ve hastalık mikrobiyom rolünü tanımlama ya doğru ilk adımdır. Burada, dışkı örneğinden yüksek kaliteli bakteri DNA'sını izole etmek için basit bir prosedürü tanımlıyoruz, 16SR RNA ve meta genomik sıralama ve mikrobiyom veri analizi gerçekleştiriyoruz. Bu protokol, mikrobiyom alanında yeni araştırmacıların yanı sıra laboratuvarlarında mikrobiyom boru hattını kurmada mikrobiyom alanında çalışan araştırmacılara yardımcı olacaktır. Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin burun, oral veya deri örnekleri gibi diğer biyoörneklerden mikrobiyom profilleme için uzatılabilir. Tüm downstream adımlar yüksek kaliteli DNA bağlıdır gibi boncuk toplama en önemli adımlardır. Koruma plakasının uygun şekilde sızdırmazlığı önemlidir, çünkü eksik sızdırmazlık, güçlendirilmiş ürünün baskılanmasına yol açarak düşük kaliteli sıralama verilerine yol açabilir. Başlamak için,% 70 etanol ile bölücü kutuları sterilize. Sterilize bölücü kutuları fareler yerleştirin ve onları bir saate kadar normal dışkı sağlar. Boş bir önceden etiketli 1.5 mililitre mikro santrifüj tüp dışkı pelet toplamak için steril forceps kullanın. Tüpü güvenli bir şekilde içine tonuyla tonuyla tolun. Her fareden dışkı topladıktan sonra forsepsleri %70 etanol ile sterilize edin, ardından mikrop öldürücü tek kullanımlık mendil. 0,1 mililitrelik cam boncuklarla 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne 200 miligram dışkı peletağırlığında olun ve boncuk tüpünü homogenizer'i yenen bir boncuk içine yerleştirin ve numuneleri saniyede 4,5 metre hızla oda sıcaklığında 45 saniye homojenize edin. 1,5 mililitrelik mikro santimetreperfüj tüp kiti üreticisi ve elute DNA talimatları na göre DNA ayıklayın. DNA'yı izole ettikten sonra, bir florometreye 1 mikrolitre DNA yükleyerek izole edilmiş DNA'yı ölçün. Kurulum 16S ribozomal RNA gen amplifikasyonu PCR1 96-Well PCR plaka, 25 mikrolitre reaksiyon hacmi kullanarak. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 40 nano gram DNA, 13,5 mikro litre 2X yüksek kaliteli polimeraz enzim karışımı, tampon içeren, artı ileri ve ters astar DNTPs ekleyin. PCR plakayı dört kenar boyunca yukarıdan aşağıya doğru düzgün bir şekilde kapatın. Ve santrifüj 1000 kez G 20

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos

Explore More Videos

Biyoloji Sayı 152 Dışkı DNA çıkarma kütüphane hazırlama 16S değişken bölge 16S rRNA yeni nesil sıralama bağırsak mikrobiyota