Name: Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Keşfedin MRGPRX2 reseptörünü aktive eden peptitleri taramak için tasarlanmış HEK hücreleri kullanarak yüksek verimli kalsiyum akışı analizi yöntemini. Bu protokol immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SR ve LDU, Alberta Innovates Stratejik Araştırma Projesi, NRC ve NSERC-Discovery'nin bu proje için hibesini kabul etmek istiyor.

1. Peptit kütüphanesinin tasarımı ve geliştirilmesi
<ol><li>Bilinen bir ligand yani PAMP-1213'edayanan mast hücresi MRGPRX2 reseptörün ligandlarını tanımlamak için aşağıdaki adımları izleyin.<ol>
<li>Ligandın N-terminal amino asit kalıntılarını art arda katı fazlı peptit sentezi (SPPS) ile keserek N kesilmiş peptit kütüphanesi oluşturun.</li>
		<li>Bilinen ligandın C-terminal amino asit kalıntılarını art arda SPPS ile keserek C kesilmiş peptit kütüphanesi oluşturun.</li>
		<li>1.1.1 ve 1.1.2 sonuçlarına dayanarak, sırasıyla N ve C terminalinden istenen kalıntıları keserek SPPS kullanarak bir N + C kesilmiş peptit kütüphanesi oluşturun.</li>
		<li>Peptitleri sentezlemek için katı fazlı peptit sentezi kullanın13.</li>
		<li>N-terminalini asetil (Ac) grubuna ve C-terminalini amid grubuna değiştirin.</li>
		<li>Peptidi, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanarak saflığı ve kütle spektrofotometresi kullanarak kütle için karakterize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ana PAMP-12 molekülü içindeki spesifik amino asitlerin önemini incelemek için aşağıdaki adımları izleyin.<ol>
<li>Peptit molekülündeki ilgili amino asit kalıntılarını SPPS kullanarak teker teker alanin ile değiştirerek bir alanin tarama peptit kütüphanesi oluşturun. N-terminalini asetil (Ac) grubuna ve C-terminalini amid grubuna değiştirin.</li>
		<li>Peptidi, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanarak saflığı ve kütle spektrofotometresi kullanarak kütle için karakterize edin. NOT: Sentezlenen peptitlerin yüksek saflıkta olduğundan emin olun. Kitle spektroskopisi ve HPLC kullanarak peptitleri karakterize edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tüp bebek kültürü
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek KÜLTÜR HEK-X2 ve HEK-WT hücreleri.<ol>
<li>Yüksek glikoz DMEM'i fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisan ile destekleyerek kültür ortamını hazırlayın.</li>
		<li>Doku kültüründeki (TC) hücrelerin T-75 kültür şişelerini tedavi etti ve% 75-80 birleştiğinde% 5 CO2içeren 37 ° C'de bir inkübatörde büyür.</li>
		<li>% 75 birleştiğinde, hücreleri yıkayın ve 2 - 3 dakika boyunca 2-3 mL tripsin ekleyin. Hücreleri ayırmak için 37 °C, %5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Hücreler ayrıldıktan sonra, hücreleri tripsin içinde toplayın. 6-9 mL taze orta ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri 3-5 dakika boyunca 1620 x g'da santrifüj edin.</li>
		<li>Santrifüjlemeden sonra, peletin toplanması için süpernatantı atın. Hücreleri taze bir kültür ortamında yeniden biriktirin. Hücreleri istenen konsantrasyona göre seyreltin. NOT: HEK hücreleri hızlı büyüyen hücrelerdir ve bu nedenle hücre ortamı takviyelerini optimize eder. HEK hücreleri yapışan hücrelerdir; yapıştırma desteklemek için TC ile işlenmiş kültür şişelerine geçiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deney için 96'lık iyi bir test plakası hazırlayın.<ol>
<li>40.000 hücre/kuyu tohumuna 200.000 hücre/mL konsantrasyonda, her kuyuya 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde24 saat büyütün. NOT: Plaka boyutuna ve hücre gerinim tipine bağlı olarak hücre yoğunluğunu kuyu başına optimize edin. Deneyi, düz şeffaf tabanlı siyah TC ile işlenmiş 96 kuyu plakasında triplicates olarak gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fura-2 kalsiyum tahlil
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek boya hazırlayın.<ol>
<li>Deney için Fura-2 boyasını kullanın.</li>
		<li>HEPES-Tyrode'un 25 mM HEPES tamponu, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/mL glikoz, 1 mg/mL sığır serum albümin (BSA) içeren tampon (HTB) tamponu hazırlayın ve otoklav sterilize suya 1,8 mM CaCl2 taze eklendi.</li>
		<li>Fura-2 boyasının 1 mM stok çözeltisini hazırlamak için 50 μg Fura-2 şişesine 50 μL DMSO ekleyin. 1 μM boya konsantrasyonuna sahip boya yükleme ortamını hazırlamak için taze ortamın mL'si başına 1 μL 1 mM Fura-2 boya ekleyin.</li>
		<li>96 kuyu plakasını inkübatörden çıkarın ve ortamı atın. Ortamı taze bir boya yükleme ortamıyla değiştirin. Her kuyuya 200 μL boya yükleme ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 inkübatörde 30-40 dakika kuluçkayayatırın.
</li>
		<li>40 dakikalık inkübasyondan sonra ortamı çıkarın. Hücreleri HTB arabelleğiyle yıkayın. Floresan okuma için 100 μL HTB tampon ekleyin. Floresan okuma için tabağı alın. NOT: Boya yükleme ortamındaki boya konsantrasyonu optimize edin. Boya sızıntısı ve fotobleaching, boya ile ilişkili olası endişelerdir. Yağıştan kaçınmak için CACL2'yi HTB tamponuna yeni ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Hücre aktivasyonu ve floresan okuma
NOT: Otomatik pipetleme sistemine sahip floresan plaka okuyucu, plakayı plaka okuyucudan çıkarmadan bileşiklerin bileşik bir kaynaktan test plakasına otomatik olarak aktarılmasını sağlar.
<ol><li>Hücreler inkübe edilirken, Plaka Okuyucu'sunu ayarlayın.<ol>
<li>Sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın.</li>
		<li>Ayarlar'da Flex 'iseçin.</li>
		<li>Okuma Modunu Floresan ve Alt okuma olarak ayarlayın.</li>
		<li>Dalga Boyları'nda Dalga Boylarının sayısını 2 olarak ayarlayın. Heyecanlandırmayı 340 nm ve 380 nm olarak ayarlayın. Emisyonu 510 nm olarak ayarlayın.</li>
		<li>Duyarlılığı Varsayılanolarak bırakın.</li>
		<li>Zamanlama'da Aralık 'ı 3,9 s olarak ayarlayın. 25 okuma almak için Çalışma Süresi'yi 94 s olarak ayarlayın.</li>
		<li>Ardından, Tahlil Plaka Türü 'nüseçin.</li>
		<li>Ardından, Okunacak Kuyular 'ıseçin.</li>
		<li>Bileşik Aktarımda, Aktarımları 1'e ve İlk Hacmi 100 μL'ye ayarlayın. </li>
		<li>Ardından, Bileşik Kaynak plaka türünü seçin.</li>
		<li>Triturate'i Kullanılmayanolarak bırakın.</li>
		<li>Pipet İpuçları Düzeni'ndeki ipuçlarını seçin.</li>
		<li>Bileşik ve Uç Sütunlarıiçin, aktarılacak bileşiklerin bileşik plakanın sütun 1'inde olduğundan emin olun. İpucu Sütununu 1'e ve Bileşik Sütunu 1'e ayarlayın.</li>
		<li>Otomatik Hesapla'ı AÇıKolarak bırakın.</li>
		<li>Tamam 'ıtıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıcaklık 37 °C'ye ulaştığında, plakaları Plaka Okuyucuyayükleyin.<ol>
<li>Tahlil Plakasını floresan Plaka Okuyucusunakoymak için Okuma Odasına basın.</li>
		<li>Bileşik Plaka koymak için Kaynağa basın. İlgili peptitler, iyonomisin ve etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, N,N′, N′-tetraasetik asit (EGTA)-Triton X-100 çözeltileri ekleyerek Bileşik Plakayı hazırlayın.</li>
		<li>İpucu Kutusunukoymak için Uç Rafı'na basın. Uç otofluoresansını önlemek için siyah bir uç kullanın.</li>
		<li>Plakalar yüklendikten sonra, yazılımın ayarlarını gözden geçirin ve Oku 'yabasın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Veri analizi
<ol><li>Grynkiewicz denklemi ile floresan oranından kalsiyum konsantrasyonu belirleyin - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62448/62448eq01.jpg"> burada, Kd Fura-2 AM'nin ayrışma sabitidir, R, ilgili peptitler için 340 nm ve 380 nm'de (F340 / F380) uyarılma sonrası emisyon oranıdır, Rmax, 30 μM iyonomisin 50 μL ilavesi ile gözlenen maksimum floresan oranıdır, Rmin 100 mM EGTA / 2.5% Triton X-100'ün 50 μL eklenmesiyle gözlenen minimum floresandır, ve F380dk ve F380max, fura-2 AM'nin kalsiyumsuz ve bağlı durumdaki mutlak floresan yoğunluğudur. NOT: Makine sıvıyı bir miktar kuvvetle dağıtır. Peptit dağıtım yüksekliğini plakanın altına çok yakın ayarlamayın; hücreleri ayırabilir. Otofluoresansı önlemek için siyah pipet uçlarını kullanın. Her deney için her plaka için maksimum floresan ve minimum floresan okuyun.</li>
</ol>

<ol><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Mas-related+G+protein-coupled+receptor+X2+on+mast+cell-mediated+host+defense%2C+pseudoallergic+drug+reactions%2C+and+chronic+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).</li>
<li>Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+isolation%2C+and+maintenance+of+human+mast+cells+and+mast+cell+lines+derived+from+peripheral+blood+or+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood.</a> Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53568(2015).</li>
<li>Occhiuto, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+entry+via+STIM1+contributes+to+MRGPRX2+induced+mast+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions.</a> Frontiers in Immunology. 10, 3143(2020).</li>
<li>Baba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+for+the+calcium+sensor+STIM1+in+mast+cell+activation+and+anaphylactic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses.</a> Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).</li>
<li>Hoth, M., Penner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+calcium+stores+activates+a+calcium+current+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells.</a> Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).</li>
<li>Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+method+to+quantify+intraplatelet+calcium+dynamics+by+ratiometric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry.</a> PLoS One. 10 (4), 0122527(2015).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fura-2+measurement+of+cytosolic+free+Ca2%2B+in+monolayers+and+suspensions+of+various+types+of+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Generation+of+Ca2+%2B+Indicators+with+Greatly+Improved+Fluorescence+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+nanoscaffold+that+activates+human+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).</li>
<li>Lansu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+design+of+novel+probes+for+the+atypical+opioid+receptor+MRGPRX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).</li>
<li>Navinés-Ferrer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRGPRX2-mediated+mast+cell+response+to+drugs+used+in+perioperative+procedures+and+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11628(2018).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+store-operated+calcium+%28Ca+2%2B%29+entry+%28SOCE%29+in+HEK293+cells+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Calcium+Signalling%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2.</a> Calcium Signalling. , 163-172 (2019).</li>
<li>Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+340%2F380+nm+light-emitting+diode+illuminator+for+Fura-2+AM+ratiometric+Ca2%2B+imaging+of+live+cells+with+better+than+5+nM+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Kalsiyum sinyali mast hücre degranülasyonu için merkezidir ve reseptör-ligand etkileşimleri, ligand tanımlama ve ilaç keşfi çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır14. MRGPRX2, kaşıntı, astım ve atopik dermatit gibi birçok enflamatuar hastalıkta önemli bir rol oynadığı tespit edilen yakın zamanda keşfedilen bir mast hücre reseptörüdür2. Ayrıca, mrgprx2 reseptör15aracılığıyla enflamatuar yanıt ortaya çıkarmak için onaylanmış birkaç ilaç gösterilmiş...

Mast hücreleri bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçasıdır ve hem doğuştan gelen hem de adaptif immün yanıtlarda çok önemli bir rol oynar. Mast hücreleri öncelikle bir antijenin immünoglobulin E (IgE) - FcφRI reseptör kompleksine bağlanması veya yakın zamanda keşfedilen mas ile ilgili G-protein reseptörü-X2 (MRGPRX2)1ile aktive edilir. MRGPRX2 aktivasyonu birkaç bağışıklık ve enflamatuar hastalığa bağlanmıştır ve bu nedenle reseptörün ligandlarına bağlanma mekanizmasını anlamak önemlidir2. Bunun için, HEK hücrelerinde aşırı ifade edilen MRGPRX2 reseptörlerine karşı küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane geliştirildi ve tarandı. Çalışmada peptit kütüphanesi alanin taraması ve amino asit kesilmesinin basit ve çok yönlü teknikleri kullanılarak inşa edilmiştir. Alanin taraması, spesifik amino asitlerin alanin kalıntısı ile değiştirilmesini içerir. Alanin küçük ve nötr olmak, değiştirilen kalıntı tarafından verilen belirli özelliklerin peptidini sıyırır ve reseptör etkileşimlerinde amino asidin ilgili fizyokimyasal özelliklerinin önemini ardışık olarak vurgular. Aksine, amino asit kesilmesinde, peptit dizileri N terminali, C terminali veya her ikisinden bir veya daha fazla amino asit kalıntısından yoksun olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu peptit seti MRGPRX2 bağlanması için çok önemli olan amino asit dizilerini tanımlamak için kullanıldı.
İnsan mast hücreleri hatları (LAD-2) ile deneyim, bu hücrelerin in vitrokültür ve bakımının zor olduğunu göstermiştir: iki haftalık bir iki katlama süresi, pahalı orta takviyeler ve geçiş sırasında doğrudan dikkat3. Bu özellikler, hücreleri potansiyel ligandların büyük ölçekli taraması için uygun hale getirir. Burada, peptit kütüphanesini taramak için MRGPRX2 reseptörü (HEK-X2) ifade eden stably transfected HEK hücreleri kullanılmıştır1. HEK-293 hücreleri, yüksek transeksiyon verimliliği, daha hızlı iki katına çıkma oranı ve pahalı olmayan orta takviyelerin laboratuvarda kültüre edilmesi ihtiyacı nedeniyle yüzey reseptörlerinin heterolog ifadesi için yaygın olarak kullanılır ve çalışılmıştır4. HEK-293 hücre hattının transfect protokolü gösterilmiştir ve iyi kurulmuştur5. MRGPRX2 reseptörü (pasaj 13-19) saplı olarak ifade eden HEK-293 hücreleri, N-truncation, C-truncation, N+C-truncation ve alanine scanning1yoluyla oluşturulan peptitlerle aktive edildi. Kontrol olarak yabani tip HEK hücreleri (HEK-WT) (pasaj 16-21) kullanılmıştır. MRGPRX2 bazlı aktivasyonu incelemek için aktivasyon üzerine hücre içi kalsiyum salınımı izlendi.
MRGPRX2 ile hücre aktivasyonunu sitozolitik kalsiyum mobilizasyon takip edilir. Mast hücrelerindeki bu düzenlenmiş hücre içi kalsiyum salınımı, stromal etkileşim molekülü 1 (STIM1) tarafından koordine edilen depo tarafından işletilen kalsiyum girişi (SOCE) tarafından düzenlenir; ve immün yanıt basamak6,7merkezidir. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu tespit etmek için yama kelepçeleri ve floresan boyalar8dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Mevcut tüm teknikler arasında, çeşitli algılama teknikleri ile konjugasyonda florometrik kalsiyum boyaları yaygın olarak kullanılmaktadır9. İlgi gören iki tip florometrik boya, yani Fluo-4 gibi tek dalga boyu boyaları ve Hint -1 ve Fura-2 gibi çift dalga boyu oranmetrik boyalarıdır. Çift dalga boyu oransal boyaların tek dalga boyu boyaları üzerine getirdiği avantaj, oranmetrik boyaların boya yükleme, fotoğraf ağartma ve odaklama10,11gibi deneysel hatalar için doğru olmasıdır.
Fura-2 asetoksimetil ester (Fura-2 AM), kalsiyum bağlayıcılığı üzerine eksitasyonu daha düşük bir dalga boylarına kayan, yeşil floresan bir hücredir. Deneysel olarak, Fura-2 340 ve 380 nm'de heyecanlanırken, emisyon 510 nm'de kaydedilir. Kalsiyum bağlanması üzerine, Şekil 1'degösterildiği gibi, 340 nm'deki floresan yoğunluğu artarken, 380 nm azalır. Veriler, 340 nm'de (F340) heyecanlandıktan sonra floresan yoğunluğunun 380 nm'de (F380) yani F340/F380'de heyecanlandıktan sonraki yoğunluğa oranı olarak temsil edilir. F340/F380 oranı, değeri Grynkiewicz denklemi12ile hesaplanabilen hücre içi kalsiyum ile orantılıdır. Floresan sinyali boyanın iki dalga boyunda (340 nm ve 380 nm) çıkarılmasından elde edildiğinden, floresan sinyallerinin oranı boya yükleme, boya kaçağı, fotobleaching ve hücre yoğunlukları gibi deneysel faktörler için düzeltir.

<table><tbody><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793939</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Kuyusu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>Siyah Polistiren</td><td>Mikroplaka Sigma Aldrich</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fischer</td><td>11995065</td><td>Yüksek Glikoz</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Termo Fischer</td><td>D12345</td><td>Steril, biyolojik sınıf</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fischer</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Flexstation 3</td><td></td><td></td> Fura-2 Thermo Fischer F1221 Glikoz Sigma Aldrich D8270 HEPES FV06060 <td></td>moleküler cihazlar</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> tampon</td><td>Thermo Fischer</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>İyonomisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamin</td><td>Thermo Fischer</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Kalem Strep</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peptitler</td><td>RS Syntehsis</td><td>Custom</td><td>&ge; % 95 saf; N terminali - asetil grubu C terminali - amid grubu</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>DOW Kimyasal</td><td>166704</td><td></td></tr></tbody></table>

tasarlanmış hek hücrelerini kullanarak mrgprx2'i etkinleştiren peptitlerin taranır

Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells

Terapötik olarak önemli hücre reseptörlerine özgü ligandların tanımlanması, yeni terapötiklerin tasarımı ve geliştirilmesi de dahil olmak üzere birçok uygulama için çok önemlidir. Mas ile ilişkili G-protein reseptörü-X2 (MRGPRX2), mast hücre aktivasyonunu düzenleyen ve böylece genel immün yanıtı yönlendiren önemli bir reseptördür. MRGPRX2 için çok sayıda ligand tanımlanmıştır ve PAMP'ler, defensinler, LL-37 ve diğer protein parçaları (yani bozulmuş albümin) gibi endojen peptitleri içerir. MRGPRX2 spesifik ligandların daha fazla tanımlanması, çok sayıda peptitin (yani peptit kütüphanesinin) taranmışlığını gerektirir; bununla birlikte, mast hücrelerinin in vitro olarak tutulması zor ve pahalıdır ve bu nedenle çok sayıda molekülün taranması için kullanılması ekonomik değildir. Bu makale, HEK hücrelerini ifade eden MRGPRX2 kullanarak küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane tasarlamak, geliştirmek ve taramak için bir yöntem göstermektedir. Bu hücre hattının bakımı nispeten kolay ve ucuzdur ve in vitro yüksek verim analizi için kullanılabilir. Aktivasyonu izlemek için aktivasyon üzerine hücre içi kalsiyum akısını işaretlemek için kalsiyuma duyarlı fura-2 floresan boya kullanıldı. Kalsiyum konsantrasyonunu hesaplamak için 510 nm'de Fura-2'nin floresan yoğunluğunun 340 ve 380 nm'lik ekscitasyon dalga boylarına karşı oranı kullanılmıştır. Bu sistemi doğrulamak için kullanılan peptit kütüphanesi, MRGPRX2'yi yüksek özgüllük ve benzeşim ile bağladığı bilinen endojen proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) salgıya dayanıyordu. Pamp-12'ye uygulanan amino asit kesilmesi ve alanin tarama teknikleri ile sonraki peptitler üretildi. Burada açıklanan yöntem, bağlayıcı etki alanlarını ve reseptör aktivasyonunda önemli rol oynayan diğer önemli parametreleri tanımlamak için büyük bir bileşikler kitaplığını taramak için basit ve ucuz ancak sağlamdır.

Tablo 1, terminal amino asit kesilmesi ve alanin taraması yoluyla oluşturulan peptit dizilerini içerir. Tablo 1'degösterildiği gibi, peptit dizisi RKKWNKWALSR, ana PAMP-12 ile ilgili olarak N-terminal fenilalaninden (F) yoksundur ve bu nedenle N kesilmiş kütüphanede temsili bir peptittir. Benzer şekilde, FRKKWNKWALS'da PAMP-12'den türetilen C kesilmiş peptit kütüphanesini temsil eden PAMP-12 C-terminal serini kaldırılmıştır. N+C kesilmiş peptit kütüphanesinde hem N hem de C-terminalinden...

MRGPRX2 reseptörü ile mast hücrelerini aktive edebilecek kısa peptitlerden oluşan bir kütüphane oluşturma teknikleri açıklanmıştır. İlişkili teknikler kolay, ucuzdur ve diğer hücre reseptörlerine genişletilebilir.

Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır

Identifying ligands specific to therapeutically significant cell receptors is crucial for many applications, including the design and development of new ...

Bugün, MRGPRX2 reseptörü olarak da bilinen Mas ile ilgili G protein reseptörü X2 olan yakın zamanda keşfedilen bir ana reseptöre karşı bir peptit kütüphanesini taramak için bir yöntem göstereceğiz. Mast hücreleri bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçasıdır ve hem doğuştan gelen hem de adaptif immün yanıtlarda çok önemli bir rol oynar. Mast hücreleri antijene bağlı Fc epsilon R1 reseptörü veya yakın zamanda keşfedilen X2 reseptörü tarafından aktive edilir.Yüzeye bağlı X2 reseptörün aktivasyonu, birkaç immünolojik ve iltihaplı hastalıkla bağlantılıdır ve bu nedenle, bu reseptörün ligandlarına bağlanma mekanizmasını anlamak önemlidir. Bunu yapmak için, küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane geliştirdik ve bunları heksi üzerinde aşırı ifade edilen X2 reseptörlerine karşı taradık. Çalışmada, Alanine tarama ve amino asit kesilmelerinin basit ve çok yönlü teknikleri kullanılarak bir peptit kütüphanesi inşa edilmiştir.Heck293, peptitlerle aktive edildiğinde X2 reseptörlerini ifade ettiğini ve kontrol olarak geniş tip heksi kullanıldığını söylüyor. Etkinleştirme üzerine kesilme serbest bırakma X2 tabanlı aktivasyonu incelemek için izlendi. Deneysel olarak, Fura-2 Kalsiyuma Duyarlı Boya 340 ve 380 nanometrelerde heyecanlanırken, emisyon 510 nanometrede kaydedilir.Kalsiyum bağlanması üzerine, 340'taki floresan yoğunluğu artarken, 380 nanometre azalır. Boya daha sonra 340'taki floresan yoğunluğunun 380 nanometreye oranında biriktirilir. 380 oranının 340'ı hücre içi kalsiyumla orantılıdır, değeri Grynkiewicz Denklemi ile hesaplanabilir.İki floresan yoğunluğunun sekme oranı, seyreltme, fotobleaching, boya kaçağı ve koku yoğunlukları gibi deneysel faktörlerin etkisi tespit edilir. Daha fazla gecikmeden deneye başlayalım. Pam-12 yanlış orantısızlığının N-terminali, C terminali ve N+C-terminal amino asitlerini keserek, mast hücresi MRGPR X2 reseptörü, jeneratör N-Truncated, C-Truncated ve N+C-Truncated peptit kütüphanesinin ligandlarını tanımlamak için.Peptitleri sentezlemek için katı fazlı peptit sentezi kullanın. Bitiş terminalini ayarlanmış bir gelgit grubuna ve C-terminalini amid grubuna değiştirin. Üretin ve alaninler, Pam-12'nin ilgili amino asitlerini Alanine tarafından teker teker değiştirerek peptid kütüphanesini kullanabilir.Uç terminali bir setide grubuna ve C-terminalini amid grubuna değiştirin. Yüksek glikoz DMEM'i% 10 fetal sığır serumu, iki milimolar L-Glutamin, ml penisilin başına yüz birim ve streptomisinin ml'si başına yüz mikrogram ile destekleyerek kültür ortamını hazırlayın. Tee sue kültüründeki hücrelerin yanı sıra, 37 santigrat derecede 375 kültür şişesi, % 5 CO2, 75 ila% 80 birleştiğinde.%75 birleştiğinde, hücreleri yıkayın ve hücreleri ayırmak için iki ila üç ml Proof-C ekleyin. Hücreler ayrıldıktan sonra, hücreleri Proof-C'de toplayın. Altı ila dokuz ml taze orta ekleyin.1620g'daki hücreleri üç ila beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, peletin toplanması için süpernatantı atın. Hücreleri taze kültür ortamında yeniden biriktirin.İstenilen konsantrasyona göre hücreleri seyreltin. 200.000 hücre konsantrasyonuna sahip hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresinde, kuyu başına 40.000 hücre aramak için ambonu her kuyuya dökün. Hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat koruyun, %5 CO2 inkübatörü.Deney için Fura-2 boyasını kullanın. Fura-2 boyasının bir milimolar stark çözeltisini hazırlamak için 50 mikrogram Fura-2 AM'de 50 mikrolitre DMSO ekleyin. Bir mikromoler boya konsantrasyonunun seyreltici ortamını hazırlamak için taze ortamın ml'si başına bir milimoler Fura-2 boyadan bir mikrolitre ekleyin.96 kuyu plakasını inkübatörden çıkarın ve ortamı atın. Ortamı taze seyreltme ortamı ile değiştirin. Her kuyuya 200 mikrolitre seyreltme ortamı ekleyin.Hücreleri 37 santigrat derecede 30-40 dakika kuluçkaya bırakın, % 5 CO2 inkübatör. Hücreler inkübe edilirken plaka okuyucuyu ayarlayın. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın.Ayarlarda Flex'i seçin. Okuma Modunu Floresan ve Alt Okuma olarak ayarlayın. Dalga Boylarında dalga boylarının sayısını ikiye ayarlayın.Heyecanlandırmayı 340 nanometre ve 380 nanometre olarak ayarlayın. Emisyonu 510 nanometre olarak ayarlayın. Duyarlılığı Varsayılan olarak bırakın.Zamanlama'da aralığı 3,9 saniye olarak ayarlayın. 25 Okuma Sayısı almak için Çalışma Süresini 94 saniye olarak ayarlayın. Ardından, Test Plakası türünü seçin.Ardından, Okunacak Kuyular'ı seçin. Bileşik Aktarım'da aktarımları bire, Başlangıç Hacmini yüz mikrolitreye ayarlayın. Pipet Yüksekliğini yüz mikrolitreye, Hacmi 50 mikrolitreye ve Zaman Noktasını bileşiği eklemek ve okumaya bakmak için 36 saniyeye ayarlayın.Ardından, Bileşik Kaynak plaka türünü seçin. Triturate'i kullanılmaması için bırakın. İpuçları ve Pipet İpuçları Düzeni'ni seçin.Bileşik ve Uç Sütunları için bileşik, bileşik plakanın birinci sütununda transfer edilecektir. İpucu Sütununu bire, Bileşik Sütunu bir olarak ayarlayın. Otomatik Hesapla'yı Açık olarak bırakın.Tamam'ı tıklatın. 40 dakika kuluçkadan sonra ortamı çıkarın.Hücreleri XDB arabelleğiyle yıkayın. Floresan okuma için yüz mikrolitre XDB tamponu ekleyin. Floresan okuma için tabağı alın.Pritchett 37 santigrat dereceye ulaştığında, test plakasını floresan plaka okuyucusuna koymak için okuma odasına basın. Bileşik plakayı koymak için kaynağa basın. X çözümlerini çevirmek için 200 mikrolitre saygın peptit iyonomisin ve EGTA ekleyerek bileşik plakayı hazırlayın.Uç kutusunu koymak için uç pratt'e basın. Uç otofluoresansını önlemek için siyah uç kullanın. Plakalar tutulduktan sonra ve yazılımın ayarlarını kullanırsanız ve Oku'ya basın.Grynkiewicz Denklemi ile Floresan Oranından Kalsiyum Konsantrasyonu'nu belirleyin. Pam iyi peptidin floresan verileri gösterilmiştir. Görüldüğü gibi, 36 saniyede peptit ilavesi yaptıktan sonra, 340 nanometrede floresan, 380 nanometre rekoru ile artar.Veriler, 340'ın 380 sinyaline oranı olarak temsil edilir. Peptit ilavesi sonrası sinyallerin arttığını gösterirler. Bu rakam, aktive edici bir peptit için temsili verilerdir.Şekil A, aktive edici bir peptit için floresan sinyallerini gösterir. Temsili veriler cram12 Peptide'e karşılık gelir, ado tarafından gösterildiği gibi, ihale döngüleri için bir taban çizgisi oluşturduktan sonra eklendi. Şekil B, 340 nanometrede ekscitasyondan sonra floresan emisyonunun, 380 nanometrede ekscitasyondan sonra floresan emisyonunun oranını göstermektedir.Bu rakam, boş için Temsili verilerdir. Şekil A, boşluk için floresan sinyallerini gösterir. HTB, ado tarafından gösterildiği gibi 10 besleme döngüsü için bir taban çizgisi seyreltildikten sonra eklendi.Şekil B, 340 nanometrede 340 nanometrede flüoresan emisyonunun 380 nanometrede ekscitasyondan sonra floresan emisyonunun rasyonunu göstermektedir. Bu şekil, boya kalibrasyonu standartları için Temsili verilerdir. Şekil A, 10.EGPA Triton X yüz, minimum sinyal alan ado tarafından gösterildiği gibi 20 okumadan sonra eklendi. Şekil B, 340 nanometrede fıskiye sonrası floresan emisyonunun 380 nanometrede flütasyon sonrası oranı göstermektedir. Bu değerler, hücre içi konsantrasyon önbelleğini elde etmek için Grynkiewicz Denklemi'ne daha da konur.Bu şekil, Diziyi ve Saflığı Onaylamak için Temsili Peptit Nitelemeyi gösterir. Şekil A, temsili peptit dizisi WNK WAL'un dikey kütlesinin 857.90 boya inceltme olduğunu göstermektedir. Kütle Spektroskopisinde N üzerinde Zed oranı ile gösterilmiştir.Şekil B, HPLC tarafından onaylanan% 99'luk bir peptit saflığı göstermektedir. Bu peptit N+C kesilmiş peptit kütüphanesine aittir. Sonuç olarak, burada açıklanan yöntem, son ölçekli kalsiyum bazlı tarama için verimli ve parlak olabilen kolay ve çok yönlü bir yöntemdir.Bununla birlikte, verilerin kalitesini belirleyen çeşitli faktörler vardır ve bu nedenle makyajın belirli bir hücre cihazı sistemi için optimize edilmesi gerekir. Teşekkürler.

screening-peptides-that-activate-mrgprx2-using-engineered-hek-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada hücre sağkalım teşvik gen hedefleri belirlemek için sıralama yöntemlerini bir insan LentiPlex toplanmış kütüphane ve geleneksel kullanın. Biz kurmak ve deconvolute bir LentiPlex ekran ve sonuçları doğrulamak nasıl göstermektedir.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

Biz geleneksel maya iki-hibrit taraması, protein etkileşimleri tanımlayan genetik etkili bir aracı olarak var. Bu değişiklik, sürecin belirgin kısaltır, iş yükünü azaltır ve en önemlisi, yanlış pozitiflerin sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Exosomes HIV-1 Nef salgılanmasını altında yatan mekanizmaları incelemek için teknikler tarif edilmiştir. Nef ve protein transfeksiyon elde edilen özel kısa peptitler yapısı, işlevi, ve Nef en Salgı Değişiklik Bölgesi bağlayıcı ortakları belirlemek için istismar edildi. Bu prosedürler birçok mekanik çalışmalar genel ilgisi var.

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Burada, yüksek verimde saf, tamamen glikosile edilmiş ve enzimatik olarak aktif proteaz üreten HEK293T hücreleri kullanan uygun maliyetli bir granzim ekspresyon sistemini açıklıyoruz.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

Biz bir küçük saç tokası RNA (shRNA) ve düzenleyiciler, x kromozomu inactivation ateş böceği luciferase ile bir fare hücre satırı tanımlamak için sonraki nesil sıralama tabanlı iletişim kuralı raporu ve hygromycin direnç genleri metil için erimiş CpG bağlayıcı protein 2) MeCP2) etkin olmayan X kromozomu üzerindeki gen.

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Burada, faj görüntüleme peptid kütüphanesi kullanarak FGFR2'ye bağlanan küçük peptidlerin taranması için ayrıntılı bir protokol sayılmiyoruz. Seçilen peptidlerin FGFR2 in vitro'ya olan yakınlığını ve hücre çoğalmasını bastırma yeteneğini daha da analiz ediyoruz.

Faj Görüntüleme Peptid Kütüphanesi Kullanılarak Fibroblast Büyüme Faktörü Reseptörü 2'yi Hedefleyen Küçük Peptidlerin Taranması ve Tanımlanması

Bu rapor, görsel GPCR, rodopsin ve mini-Goile karmaşık hazırlamak için farklı deterjanların tarama açıklar. Arınma sırasında kompleksin farklı aşamalarında kalitesini karakterize eden biyokimyasal yöntemler gösterilmiştir. Bu protokol gelecekteki yapısal çalışmaları için diğer membran protein komplekslerine genelleştirilebilir.

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Keşfedin MRGPRX2 reseptörünü aktive eden peptitleri taramak için tasarlanmış HEK hücreleri kullanarak yüksek verimli kalsiyum akışı analizi yöntemini. Bu protokol immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir platform sunar.

Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır

Daha fazla video keşfet