Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır

Bugün, MRGPRX2 reseptörü olarak da bilinen Mas ile ilgili G protein reseptörü X2 olan yakın zamanda keşfedilen bir ana reseptöre karşı bir peptit kütüphanesini taramak için bir yöntem göstereceğiz. Mast hücreleri bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçasıdır ve hem doğuştan gelen hem de adaptif immün yanıtlarda çok önemli bir rol oynar. Mast hücreleri antijene bağlı Fc epsilon R1 reseptörü veya yakın zamanda keşfedilen X2 reseptörü tarafından aktive edilir.

Yüzeye bağlı X2 reseptörün aktivasyonu, birkaç immünolojik ve iltihaplı hastalıkla bağlantılıdır ve bu nedenle, bu reseptörün ligandlarına bağlanma mekanizmasını anlamak önemlidir. Bunu yapmak için, küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane geliştirdik ve bunları heksi üzerinde aşırı ifade edilen X2 reseptörlerine karşı taradık. Çalışmada, Alanine tarama ve amino asit kesilmelerinin basit ve çok yönlü teknikleri kullanılarak bir peptit kütüphanesi inşa edilmiştir.

Heck293, peptitlerle aktive edildiğinde X2 reseptörlerini ifade ettiğini ve kontrol olarak geniş tip heksi kullanıldığını söylüyor. Etkinleştirme üzerine kesilme serbest bırakma X2 tabanlı aktivasyonu incelemek için izlendi. Deneysel olarak, Fura-2 Kalsiyuma Duyarlı Boya 340 ve 380 nanometrelerde heyecanlanırken, emisyon 510 nanometrede kaydedilir.

Kalsiyum bağlanması üzerine, 340'taki floresan yoğunluğu artarken, 380 nanometre azalır. Boya daha sonra 340'taki floresan yoğunluğunun 380 nanometreye oranında biriktirilir. 380 oranının 340'ı hücre içi kalsiyumla orantılıdır, değeri Grynkiewicz Denklemi ile hesaplanabilir.

İki floresan yoğunluğunun sekme oranı, seyreltme, fotobleaching, boya kaçağı ve koku yoğunlukları gibi deneysel faktörlerin etkisi tespit edilir. Daha fazla gecikmeden deneye başlayalım. Pam-12 yanlış orantısızlığının N-terminali, C terminali ve N+C-terminal amino asitlerini keserek, mast hücresi MRGPR X2 reseptörü, jeneratör N-Truncated, C-Truncated ve N+C-Truncated peptit kütüphanesinin ligandlarını tanımlamak için.

Peptitleri sentezlemek için katı fazlı peptit sentezi kullanın. Bitiş terminalini ayarlanmış bir gelgit grubuna ve C-terminalini amid grubuna değiştirin. Üretin ve alaninler, Pam-12'nin ilgili amino asitlerini Alanine tarafından teker teker değiştirerek peptid kütüphanesini kullanabilir.

Uç terminali bir setide grubuna ve C-terminalini amid grubuna değiştirin. Yüksek glikoz DMEM'i% 10 fetal sığır serumu, iki milimolar L-Glutamin, ml penisilin başına yüz birim ve streptomisinin ml'si başına yüz mikrogram ile destekleyerek kültür ortamını hazırlayın. Tee sue kültüründeki hücrelerin yanı sıra, 37 santigrat derecede 375 kültür şişesi, % 5 CO2, 75 ila% 80 birleştiğinde.

%75 birleştiğinde, hücreleri yıkayın ve hücreleri ayırmak için iki ila üç ml Proof-C ekleyin. Hücreler ayrıldıktan sonra, hücreleri Proof-C'de toplayın. Altı ila dokuz ml taze orta ekleyin.

1620g'daki hücreleri üç ila beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, peletin toplanması için süpernatantı atın. Hücreleri taze kültür ortamında yeniden biriktirin.

İstenilen konsantrasyona göre hücreleri seyreltin. 200.000 hücre konsantrasyonuna sahip hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresinde, kuyu başına 40.000 hücre aramak için ambonu her kuyuya dökün. Hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat koruyun, %5 CO2 inkübatörü.

Deney için Fura-2 boyasını kullanın. Fura-2 boyasının bir milimolar stark çözeltisini hazırlamak için 50 mikrogram Fura-2 AM'de 50 mikrolitre DMSO ekleyin. Bir mikromoler boya konsantrasyonunun seyreltici ortamını hazırlamak için taze ortamın ml'si başına bir milimoler Fura-2 boyadan bir mikrolitre ekleyin.

96 kuyu plakasını inkübatörden çıkarın ve ortamı atın. Ortamı taze seyreltme ortamı ile değiştirin. Her kuyuya 200 mikrolitre seyreltme ortamı ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derecede 30-40 dakika kuluçkaya bırakın, % 5 CO2 inkübatör. Hücreler inkübe edilirken plaka okuyucuyu ayarlayın. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Ayarlarda Flex'i seçin. Okuma Modunu Floresan ve Alt Okuma olarak ayarlayın. Dalga Boylarında dalga boylarının sayısını ikiye ayarlayın.

Heyecanlandırmayı 340 nanometre ve 380 nanometre olarak ayarlayın. Emisyonu 510 nanometre olarak ayarlayın. Duyarlılığı Varsayılan olarak bırakın.

Zamanlama'da aralığı 3,9 saniye olarak ayarlayın. 25 Okuma Sayısı almak için Çalışma Süresini 94 saniye olarak ayarlayın. Ardından, Test Plakası türünü seçin.

Ardından, Okunacak Kuyular'ı seçin. Bileşik Aktarım'da aktarımları bire, Başlangıç Hacmini yüz mikrolitreye ayarlayın. Pipet Yüksekliğini yüz mikrolitreye, Hacmi 50 mikrolitreye ve Zaman Noktasını bileşiği eklemek ve okumaya bakmak için 36 saniyeye ayarlayın.

Ardından, Bileşik Kaynak plaka türünü seçin. Triturate'i kullanılmaması için bırakın. İpuçları ve Pipet İpuçları Düzeni'ni seçin.

Bileşik ve Uç Sütunları için bileşik, bileşik plakanın birinci sütununda transfer edilecektir. İpucu Sütununu bire, Bileşik Sütunu bir olarak ayarlayın. Otomatik Hesapla'yı Açık olarak bırakın.Tamam'ı tıklatın. 40 dakika kuluçkadan sonra ortamı çıkarın.

Hücreleri XDB arabelleğiyle yıkayın. Floresan okuma için yüz mikrolitre XDB tamponu ekleyin. Floresan okuma için tabağı alın.

Pritchett 37 santigrat dereceye ulaştığında, test plakasını floresan plaka okuyucusuna koymak için okuma odasına basın. Bileşik plakayı koymak için kaynağa basın. X çözümlerini çevirmek için 200 mikrolitre saygın peptit iyonomisin ve EGTA ekleyerek bileşik plakayı hazırlayın.

Uç kutusunu koymak için uç pratt'e basın. Uç otofluoresansını önlemek için siyah uç kullanın. Plakalar tutulduktan sonra ve yazılımın ayarlarını kullanırsanız ve Oku'ya basın.

Grynkiewicz Denklemi ile Floresan Oranından Kalsiyum Konsantrasyonu'nu belirleyin. Pam iyi peptidin floresan verileri gösterilmiştir. Görüldüğü gibi, 36 saniyede peptit ilavesi yaptıktan sonra, 340 nanometrede floresan, 380 nanometre rekoru ile artar.

Veriler, 340'ın 380 sinyaline oranı olarak temsil edilir. Peptit ilavesi sonrası sinyallerin arttığını gösterirler. Bu rakam, aktive edici bir peptit için temsili verilerdir.

Şekil A, aktive edici bir peptit için floresan sinyallerini gösterir. Temsili veriler cram12 Peptide'e karşılık gelir, ado tarafından gösterildiği gibi, ihale döngüleri için bir taban çizgisi oluşturduktan sonra eklendi. Şekil B, 340 nanometrede ekscitasyondan sonra floresan emisyonunun, 380 nanometrede ekscitasyondan sonra floresan emisyonunun oranını göstermektedir.

Bu rakam, boş için Temsili verilerdir. Şekil A, boşluk için floresan sinyallerini gösterir. HTB, ado tarafından gösterildiği gibi 10 besleme döngüsü için bir taban çizgisi seyreltildikten sonra eklendi.

Şekil B, 340 nanometrede 340 nanometrede flüoresan emisyonunun 380 nanometrede ekscitasyondan sonra floresan emisyonunun rasyonunu göstermektedir. Bu şekil, boya kalibrasyonu standartları için Temsili verilerdir. Şekil A, 10.

EGPA Triton X yüz, minimum sinyal alan ado tarafından gösterildiği gibi 20 okumadan sonra eklendi. Şekil B, 340 nanometrede fıskiye sonrası floresan emisyonunun 380 nanometrede flütasyon sonrası oranı göstermektedir. Bu değerler, hücre içi konsantrasyon önbelleğini elde etmek için Grynkiewicz Denklemi'ne daha da konur.

Bu şekil, Diziyi ve Saflığı Onaylamak için Temsili Peptit Nitelemeyi gösterir. Şekil A, temsili peptit dizisi WNK WAL'un dikey kütlesinin 857.90 boya inceltme olduğunu göstermektedir. Kütle Spektroskopisinde N üzerinde Zed oranı ile gösterilmiştir.

Şekil B, HPLC tarafından onaylanan% 99'luk bir peptit saflığı göstermektedir. Bu peptit N+C kesilmiş peptit kütüphanesine aittir. Sonuç olarak, burada açıklanan yöntem, son ölçekli kalsiyum bazlı tarama için verimli ve parlak olabilen kolay ve çok yönlü bir yöntemdir.

Bununla birlikte, verilerin kalitesini belirleyen çeşitli faktörler vardır ve bu nedenle makyajın belirli bir hücre cihazı sistemi için optimize edilmesi gerekir. Teşekkürler.