Name: Tam Boy Proteinin İfadesini Korurken mRNAdan Bir İç Translasyonel Başlangıç Bölgesinin Çıkarılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Öğrenin, fare modellerinde Gja1 genindeki M213L mutasyonunu PCR ve restriksiyon enzimi kullanarak nasıl genotiplendireceğinizi. Bu yöntem, tam uzunluklu Connexin43 üretimini korurken GJA1-20k izoformunun translasyonunu engeller.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Proje, RMS'ye Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri (R01HL152691, R01HL138577 ve R01HL159983) tarafından desteklenmiştir.

"Tüm hayvan bakımı ve çalışma protokolleri, Cedars-Sinai Tıp Merkezi ve Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı. Deneyler için 8-9 haftalıkken ticari kaynaklardan elde edilen C57BL/6J dişi fareler (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
1. Gen hedefleme için hazırlık
<ol><li> CRISPOR web algoritması 4,9,10 kullanarak M213'ü kodlayan hedeflenen mutasyon bölgesi etrafındaki kılavuz hedef dizisini seçin (bkz. NOT: GJA1 kodlama dizisinin karşıt ipliğinde, mutasyona uğrayacak kodonun (ATG) 16 baz aşağısından sonra potansiyel bölünme bölgesinin bulunduğu MIT skoru11 ile 62 baz seçilen 20 tabanlı bir kılavuz dizisi (ATTCAGAGCGAGAGACACCA) seçilmiştir (Şekil 1; tüm crRNA dizisi Tablo 1'de gösterilmiştir).</li>
	<li>Cas9 ile etkileşime giren crRNA ve tracrRNA'yı kılavuz RNA12 olarak sentezleyin. NOT: Kılavuz RNA'nın MIT skoru 62 olmasına rağmen, PAM'dan 12 bazdan daha uzakta dört uyumsuzluk ile sadece bir potansiyel hedef dışı mutasyon vardır. Bu nedenle, bu kılavuz RNA güvenli olarak kabul edilir.</li>
	<li>Tek bir amino asit ikamesini tanıtmak için kılavuz dizisini tamamlayan bir donör oligo tasarlayın (ATG'den TTA'ya; M213L), sırasıyla 5'- ve 3'-side' 60 ve 48 baz homoloji kolları ile. NOT: Bu donör oligo, sessiz bir mutasyon (TCC'den TCG'ye; S217S) amaçlanan mutasyonların tanıtılması için CRISPR homolojisine yönelik onarımdan (HDR)13 sonra yeniden düzenlemeyi önlemek için (Şekil 1 ve Tablo 1).</li>
	<li>Pronükleer mikroenjeksiyon tamponuna tuz taşınmasını en aza indirmek için 10 μg oligoyu çökeltmek için NaCl (200 mM nihai konsantrasyon) kullanın (10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 0.1 mM EDTA ve spermin ve spermidin olmadan 100 mM NaCl14). NOT: DNA peletini %70 etanol ile yıkamayın, çünkü pelet çözelti içinde çözülebilir.</li>
	<li>Son hacim 20 μL'de CRISPR karışımı yapmak için 50 ng / μL donör oligo, 60 ng / μL crRNA / tracrRNA karışımı (1: 1 molar oran) (adım 1.2'den itibaren) ve 50 ng / μL eSpCas9 proteinini (bkz. Yüksek toksisite gözlenirse donör oligo konsantrasyonunu azaltın (örneğin, 25 ng / μL).</li>
</ol>2. Süperovülasyonun indüklenmesi, yumurtaların toplanması, CRISPR karışımının pronükleer mikroenjeksiyonu ve blastosist taraması
NOT: Bu yordam, daha önce yayımlanmış bir genel protokol14'ü izler.
<ol><li>100 μL steril suya 5 IU PMSG (hamile kısrak serumu gonadotropin) (bakınız Malzeme Tablosu) 8 haftalıkken 5-10 fareye yaklaşık 3: 00 p.m'de intraperitoneal bir yaklaşımla enjekte edin. (gün 1).</li>
	<li>PMSG enjeksiyonundan 46-48 saat sonra (3. gün) intraperitoneal bir yaklaşımla yumurta donörlerine 100 μL steril su içinde 5 IU hCG (insan koryonik gonadotropin) (bakınız Malzeme Tablosu) enjekte edin. Damızlık erkeklerle 1: 1 üreme ayarlayın.</li>
	<li>Döllenmiş yumurtaları hyaluronidaz ile M2 ortamında toplayın, 10:00 a.m civarında 100 μL M2 besiyumunda üç kez yıkayın, ardından mWM15 veya KSOM16 ortamında ( 4. gün) tutun (bkz.</li>
	<li>CRISPR karışımını (adım 1.3), öğleden sonra erken ila geç saatlerde kontrast arttırıcı bir optikle ters çevrilmiş bir mikroskop üzerinde plastik bir kapta parafin yağı ile kaplanmış 100 μL M2'de14 pronükleer mikroenjeksiyonla farelerden toplanan 1 hücreli aşama embriyolarına (Video 1) ekleyin. NOT: CRISPR karışımının pronükleer mikroenjeksiyonu, 14-16 saat postkoitumda 1 hücreli aşamadaki embriyolara gerçekleştirildi (p.c.). Enjekte edilen embriyolar birkaç saat boyunca% 5'lik bir CO2 inkübatöründe kültürlendi ve cerrahi olarak 18-20 saat p.c.'de aynı sabah çiftleşme tıkacı olan alıcı ICR farelerine transfer edildi.</li>
	<li>Rekombinant hayvanlar üretmek için her alıcıya 20-30 adet 2 hücreli embriyo aktarın. NOT: Genel protokol14'ü izleyin veya verimliliği doğrulamak ve toksisiteyi incelemek için bu embriyoları mWM veya KSOM ortamında 4 gün boyunca kültürleyin. CRISPR karışımının toksisitesi, enjekte edilen embriyoların en az üçte biri, aralarında birden fazla rekombinant bulunan tamamen genişlemiş blastosist aşamasına erken ulaştığında kabul edilebilir. Aynı zamanda, manipüle edilmemiş embriyoların% 90'ından fazlası paralel bir kültürde aynı blastosist aşamasına ulaşır. Blastkist taraması için 2.6-2.9 adımını takip edin, bu gerekli değildir, ancak HDR'nin başarı oranını ölçmek için tercih edilirse yapılabilir.</li>
	<li>Tek bir PCR tüplerine mikropipetleyici ile tıkanmış ince bir pipet ucu kullanarak 2 μL kültür ortamı ile tamamen genişlemiş blastosistleri tek tek erken alın (gün 8; Video 2).</li>
	<li>8 μL sindirim karışımında liz blastosistleri (adım 3.2 ile aynı; Malzeme Tablosuna bakınız) ve 10 dakika boyunca 75 ° C'de, 5 dakika boyunca 95 ° C'de işlenir, daha sonra depolama için 4 ° C'ye soğutulur. Toplam 15 μL PCR karışımında PCR için şablon olarak lizatın 2 μL'sini kullanın (adım 3).</li>
	<li>NlaIII ile kısıtlama sindirimini takiben PCR örneklerinin agaroz jel elektroforezi17 ile HDR'nin etkinliğini inceleyin (adım 3-5).</li>
	<li>Mutasyonun bütünlüğünü doğrulamak için kuruculardaki 668 bp amplikon17'yi ve sonraki soyları sıralayarak hedeflenen rekombinasyonun durumunu onaylayın.</li>
</ol>3. DNA ekstraksiyonu
NOT: Doğum sonrası 10. gündeki fareler, doğumdan yaklaşık 2-4 hafta sonra GJA1-20k nakavt faresinin ani ölümü nedeniyle bu deney için kullanıldı. Daha önce yayınlanan rapor18'i takiben daha genel bir protokol de uygulanabilir.
<ol><li>Ayak parmağı veya kuyruk ucunun 1-3 mm'sini temiz makasla kesin ve 0,2 mL 8 Şeritli PCR tüpüne aktarın. Ayak parmağı veya kuyruk numuneleri arasında kontaminasyonu önlemek için, önceden temizlenmiş makas veya fare başına bir bıçak kullanın veya her numuneden önce %70 etanol veya %10 ağartıcı kullanarak temizleyin. Kuyruk örnekleme sonrası kanarsa, kanamayı durdurmak için gazlı bezle kısa bir basınç uygulayın. Kuyruk örneklerini ekstraksiyona kadar yaklaşık bir haftaya kadar -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>100 μL/tüpe doku lizis çözeltisi (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve iyice karıştırın, ardından masa üstü mini santrifüj (oda sıcaklığında 10 s için 2.200 x g) ile spin-down yapın. Kuyruk numunelerinin çözeltiye batırıldığından emin olun.</li>
	<li>Tüpleri aşağıdaki program tarafından ayarlanan bir termal döngü üzerine ayarlayın; 10 dakika boyunca 75 °C (doku lizisi), 5 dakika için 95 °C (inaktivasyon) ve 4 °C (tutma). PCR'ler hemen yapılamazsa doku lizatını 4 ° C'de bir haftaya kadar saklayın.</li>
</ol>4. PCR ile DNA amplifikasyonu
<ol><li>Yeni PCR tüpüne numune başına 5 μL nükleaz içermeyen H2O, 0.75 μL 10 μM ileri ve geri Astarlar ve 7.5 μL PCR ana karışımı (bkz. Malzeme Tablosu) içeren bir PCR çözeltisi hazırlayın (primer dizileri için Tablo 1'e bakınız). Birkaç örnek varsa, içeriği tüp başına aliquot 14 μL'ye ölçeklendirin.</li>
	<li>Adım 3.1'de hazırlanan PCR çözeltisine 1 μL doku lizatı ekleyin. Kuyruğa dokunmamaya dikkat edin.</li>
	<li>İyice karıştırın ve masa üstü mini santrifüjle (oda sıcaklığında 10 s için 2.200 x g) aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Tüpleri aşağıda belirtilen program tarafından ayarlanan bir termal bisikletçi üzerine yerleştirin. PCR ürünlerini 4 °C'de 1-2 ay veya ~1 yıl -20 °C'de saklayın. NOT: 3 dakika boyunca 95 °C (adım 1, İlk Denatürasyon), 15 s için 95 °C (adım 2, Denatürasyon), 15 s için 60 °C (adım 2, Tavlama), 45 s için 72 °C (adım 2, Uzatma), 35 döngü için adım 2'yi tekrarlayın, 10 dakika boyunca 72 °C (adım 3, Son Uzatma) ve 4 °C (adım 4, Holding).</li>
</ol>5. Kısıtlama enzimi ile inkübasyon
<ol><li>7 μL nükleaz içermeyenH2O, 2 μL 10x CutSmart tamponu ve 1 μL NlaIII kısıtlama enzimi içeren enzim çözeltisini hazırlayın (bkz. Birkaç örnek varsa, karışımı yapmak için her içeriği çarpın ve tüp başına 10 μL aliquot yapın.</li>
	<li>Adım 3'te elde edilen 10 μL PCR ürününü tüp başına enzim çözeltisine ekleyin.</li>
	<li>İyice karıştırın ve masa üstü mini santrifüjle (oda sıcaklığında 10 s için 2.200 x g) aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Tüpleri aşağıda belirtilen program tarafından ayarlanan bir termal döngü veya ısı bloğuna yerleştirin. Kuluçkadan sonra ürünü 4 °C'de 1-2 ay veya -20 °C'de ~1 yıl saklayın. NOT: 16 saat boyunca 37 °C (en az 2 saat; kısa inkübasyon süresi yetersiz bölünmeye neden olabilir) ve tutma için 4 °C.</li>
</ol>6. DNA bandı tespiti
<ol><li>Elektroforez için DNA jel lekesi içeren% 1.5'lik bir agaroz jeli hazırlayın.<ol>
<li>50 mL'lik 1x TAE tamponuna 0.75 g agaroz ekleyin, ardından agaroz tamamen çözünene kadar mikrodalgada karıştırın ve ısıtın. Soğuduktan sonra, 5 μL DNA lekesi ekleyin ve yavaşça karıştırın.</li>
		<li>Jel kalıbına dökün (kalıp başına 25 mL) ve jelin katılaşmasına izin verin. Daha iyi çözünürlük ve separasyon elde etmek için, agaroz konsantrasyonunu gerektiğinde% 2.5 -% 4'e yükseltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 μL sindirilmiş PCR ürününü kuyuya yükleyin. Gerekirse 6x yükleme tamponunu karıştırın.</li>
	<li>Jeli 35 dakika boyunca 100 V ile çalıştırın. NOT: Bu parametrelerin optimizasyonu gerekebilir.</li>
	<li>UV ışığı altında görüntü (302 nm dalga boyu).</li>
</ol>

<ol><li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905(2017).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li>
<li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gels+to+chips%3A+%26%2334%3Bminisequencing%26%2334%3B+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">From gels to chips: &#34;minisequencing&#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li>
<li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+%28Medicago+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li>
<li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+%28db%2Fdb+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , (2014).</li>
<li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+sodium+lactate+in+Whitten%27s+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li>
<li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li>
<li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MRS+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , (2012).</li>
<li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments.+95%22%5BJournal%5D)">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879(2015).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503(2018).</li>
<li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keep+off-target+effects+in+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081(2018).</li>
<li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis%2C+metabolic+quiescence%2C+and+cardioprotection+against+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900(2018).</li>
<li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207(2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Gen modifiye edilmiş bir fare modeli, gen fonksiyonunu anlamak için yaygın bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, GJA1-20k dahili olarak çevrilmiş izoform, tam uzunluktaki Cx43 ile aynı Gja1 mRNA'sından çevrildiğinden, tam uzunlukta Cx43 ekspresyonunu korumak ancak GJA1-20k ekspresyonunu bastırmak için yaratıcı bir strateji geliştirilmiştir. Yaklaşım, GJA1-20k'nın iç başlangıç kodonunun mutasyonuna dayanmaktadır. Tek noktalı bir mutasyonla M213, GJA1-20k ekspresyonunu baskılamayı başaran, ancak tam uzunlukta Cx43 ek...

Tam uzunluktaki Connexin 43 (Cx43) ve N-terminus kesilmiş izoform, GJA1-20k, aynı GJA1 mRNA tarafından kodlanır, ancak translasyonu başlatmak için farklı başlangıç kodonları1 kullanır. Cx43 çevirisi ilk AUG başlangıç kodonunda gerçekleşirken, GJA1-20k çevirisi AUG'da kalıntı 213'te başlar. Daha önce GJA1-20k'nın tam uzunlukta Cx43 kaçakçılığı, aktin stabilizasyonu ve mitokondriyal morfolojinin in vitro 1,2,3 düzenlenmesi için önemli rollere sahip olduğu bulunmuştur.
GJA1-20k'nın in vivo rolünü anlamak için, tam uzunlukta Cx43 oluşturma yeteneğini koruyan bir GJA1-20k "nakavt" fare modeli oluşturuldu. Yaklaşım, 213'teki tek kalıntıyı bir Metiyonin'den (M) bir Lösin (L) 'ye (Gja1 M213L / M213L) (Gja1M213L / M213L) 4 ikame etmek için CRISPR-Cas9 sistemini kullanmaktı. Bir iç M'den L'ye mutasyon, iç translasyonun meydana gelme olasılığını önemli ölçüde azaltır, ancak tam uzunlukta protein4'ün translasyonunu ve işlevini korur. Vahşi tip (WT) ve mutasyona uğramış alel aynı boyutlara ve neredeyse aynı mRNA ürünlerine sahip olduğundan, farelerde genotipi doğrulamada önemli zorluklar vardır. DNA dizilimi mutasyonu tanımlayabilir, ancak rutin kullanım için çok pahalı ve zaman alıcıdır. Genel olarak, Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR), minisekanslama-ligasyon, yüksek çözünürlüklü erime analizi ve tetra-primer amplifikasyon refrakter mutasyon sistemi PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8 gibi birkaç hızlı genotipleme yöntemi oluşturulmuştur. Yine de bu alternatif yöntemler, spesifik olmayan PCR ürünlerini indükleyebilecek birden fazla adım, benzersiz kaynaklar ve / veya birkaç spesifik primer seti gerektirir.
Bu protokol, tek bir amino asit mutasyonu oluşturmak için CRISPR-Cas9 tarafından ayrıntılı bir gen hedefleme ve düzenleme yaklaşımı sunar ve mutasyonu doğrulamak için hızlı genotipleme sunulur. Genotip tanımlama, hedef geni tanımlamak için sadece tek bir primer seti kullanan kısıtlama enzimlerinin yaratıcı kullanımını içerir. Okuyucular, hala tam uzunlukta protein üreten, ancak daha küçük bir dahili olarak çevrilmiş kesme izoformu üretemeyen bir kalıntıGja1 M213L / M213L ikame mutasyonunun neden olduğu ani kardiyak ölümün derin elektrofizyolojik etkisini gözlemlemek için Referans4'e yönlendirilmektedir. Bu protokol, diğer fare modellerinin, endojen tam uzunluktaki proteinin ekspresyonunu korurken, ilgilenilen bir izoformun iç translasyonunu azaltmak için bir nokta mutasyonu kullanmasına yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 8-Şerit PCR tüpü</td><td>Thomas Scientific</td><td>1148A28</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Pronükleer mikorenjeksiyon tamponu</td></tr><tr><td>için 10x CutSmart tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>NlaIII 1</td></tr><tr><td>M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>için sindirim tamponu Pronükleer mikorenjeksiyon tamponu</td></tr><tr><td>için 50x TAE Tampon</td><td>Invitrogen</td><td>24710-030</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Termal döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>Model # 9902</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>664</td><td>fare suşu</td></tr><tr><td>Chemidoc MP görüntüleme sistemi</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>302 nm UV ışığı</td>eSpCas9 proteini</tr> <tr><td></td><td>ile jel görüntüsü almak içinMilliporeSigma</td><td>ESPCAS9PRO-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Jel Lading Boya Mor (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>Elektroforez için yükleme tamponu</td></tr><tr><td>Eldivenler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG (insan koryonik gonadotropini)</td><td>MilliporeSigma</td><td>23-073-425G</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidaz</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3884-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü Laboratuvarı yazılımı</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Jel görüntüsünü analiz etmek için</td></tr><tr><td>PlasDIC ile ters çevrilmiş stereo mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert A1</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Fare Genotipleme Kitleri</td><td>Roche Diagnostics</td><td>KK7352</td><td>Doku veya hücre lizisi, DNA ekstraksiyonu ve PCR ana karışımı için</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>LifeGlobal</td><td>ZEKS-050</td><td>embriyo kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Lab coart</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M2 ortamı</td><td>MilliporeSigma</td><td>MR015D</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0125S</td><td>PCR ürününü sindirmek için</td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Reaktifleri seyreltmek için</td></tr><tr><td>Parafin yağı</td><td>Nacalai USA</td><td>2613785</td><td></td></tr><tr><td>Plugged, 20 & mu; L ince pipet ucu</td><td>FisherScientific</td><td>02-707-171</td><td>Blastositleri almak için</td></tr><tr><td>PMSG (hamile kısrak' s serum gonadotropin)</td><td>ProSpec-Tany</td><td>HOR-272</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td>Pronükleer mikorenjeksiyon tamponu</td></tr><tr><td>için SYBR güvenli DNA Jel Leke</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td> Jel tracrRNA'daki <td>bantları tespit etmek için</td></tr><tr><td></td><td>Dharmacon</td><td>U-002000-120</td><td>Guid RNA</td></tr></tbody></table>

tam boy proteinin İfadesini korurken mrna'dan bir İç translasyonel başlangıç bölgesinin Çıkarılması

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Genom onarım mekanizmalarına dayanan CRISPR-Cas9 gen düzenleme sistemi, gen modifiye fare modellerinin geleneksel homolog rekombinasyona göre daha hızlı ve kolay bir şekilde üretilmesini sağlar. CRISPR-Cas9 sistemi, tek noktalı bir mutasyon istendiğinde özellikle çekicidir. Boşluk bağlantı proteini Connexin 43 (Cx43), tek bir kodlayan ekzona sahip olan ve eklenemeyen Gja1 geni tarafından kodlanır. Bununla birlikte, Gja1 sadece tam uzunlukta Cx43 proteini üretmekle kalmaz, aynı zamanda iç AUG (Metiyonin) başlangıç bölgelerinde ribozomal translasyonun başlatılmasının sonucu olan iç çeviri olarak bilinen bir işlemle altı N-terminus kesilmiş izoform üretir. GJA1-20k, Gja1 mRNA'nın 213 pozisyonunda AUG kodonunda başlatılan Cx43'ün en yaygın olarak üretilen kesilmiş izoformudur. Kalıntı 213, Cx43'ün son transmembran alanının sonunda meydana geldiğinden, GJA1-20k, bağımsız bir protein olarak Cx43'ün 20 kDa C-terminus kuyruğudur. Önceki araştırmacılar, hücrelerde, GJA1-20k'nın kritik bir rolünün, tam uzunlukta Cx43 boşluk bağlantı hemikanallarının plazma zarına ticaretini kolaylaştırmak olduğunu tespit ettiler. Bu fenomeni in vivo olarak incelemek için, kalıntı 213'teki ATG'yi (Metiyonin) TTA (Lösin, M213L mutasyonu) ile değiştiren Gja1 nokta mutasyonuna sahip mutant bir fare üretildi. M213L'nin sonucu, Gja1 mRNA ve tam uzunlukta Cx43'ün hala üretilmesidir, ancak Gja1-20k'nın translasyonu önemli ölçüde azalır. Bu rapor, bir amino asit mutasyona uğramış (Gja1M213L / M213L) fare modeli geliştirmek için kısıtlama enzim bölgesini seçmeye odaklanmaktadır. Bu protokol, CRISPR-Cas9 sistemi tarafından genetiği değiştirilmiş fareleri ve PCR ve restriksiyon enzim tedavilerini birleştirerek hızlı genotiplemeyi tanımlar.

CRISPR / Cas9 gen düzenleme sistemi, sırasıyla 56.264.279 ila 56.264.281 ve fare kromozomu 10'da 56.264.291 ila 56.264.293 veya Gja1 mRNA'da 869 ila 871 ve 881 ila 883'te bir ATG'den TTA'ya mutasyon ve TCG mutasyonuna sessiz bir TCC üretir. Bu mutasyonlar, GJA1 proteini üzerinde bir Metiyonin 213 ila Lösin (M213L) mutasyonu ile sonuçlanır ve TTC'den TTG'ye mutasyon, istenmeyen gen baskısını önlemek için yakındaki bir PAM dizisini bozar (Şekil 1). Mutasyonun ayrıntıları önceki bir rapor<sup c...

Mevcut protokol, Gja1'de tam uzunlukta Connexin43 jenerasyonunu koruyan, ancak daha küçük GJA1-20k dahili olarak çevrilmiş izoformun translasyonunu önleyen tek bir M213L mutasyonunu tanımlamaktadır.

Tam Boy Proteinin İfadesini Korurken mRNA'dan Bir İç Translasyonel Başlangıç Bölgesinin Çıkarılması

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

Tek bir kalıntı ikamesinin zorluğu, tek kalıntıdaki farklılığa rağmen hayvanları verimli bir şekilde genotiplemektir. Bir kısıtlama enziminin özel kullanımı, tipik PCR tabanlı genotiplemeye sadece tek, hızlı ve düşük maliyetli bir adım ekler. Bu protokol, hedef dizi genellikle böyle olan bir kısıtlama enzimi tarafından tanınırsa, mutasyon noktasına sahip başka herhangi bir fare modeline uygulanabilir.Kuyruk ucunun bir ila üç milimetresini temiz makasla kesin ve 0,2 mililitrelik sekiz şeritli PCR tüpüne aktarın. Kuyruk örneğini el yazmasında açıklandığı gibi içerdikten sonra, ekstraksiyona kadar, yaklaşık bir haftaya kadar T-eksi 20 santigrat derecede saklayın. Tüp başına 100 mikrolitre doku lizis çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.200 kez G'de bir masa üstü minisantrifüj kullanarak spin-down yapın.Kuyruk numunelerinin çözeltiye batırıldığından emin olun. Tüpleri, doku lizisi, inaktivasyon ve tutma parametrelerini programlayarak bir termal döngü setine ayarlayın. PCR hemen yapılamazsa doku lizatını dört santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın.Beş mikrolitre nükleaz içermeyen su, 0.75 mikrolitre 10 mikromolar ileri ve geri primerler ve numune başına 7.5 mikrolitre PCR ana karışımı içeren bir PCR çözeltisini yeni bir PCR tüpüne hazırlayın. Önceden hazırlanmış doku lizatının bir mikrolitresini PCR çözeltisine ekleyin. PCR solüsyonunu iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.200 kez G'de bir masa üstü minisantrifüj ile aşağı doğru döndürün.Tüpleri programlanmış bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, PCR ürünlerini bir ila iki ay boyunca dört santigrat derecede veya eksi 20 santigrat derecede yaklaşık bir yıl saklayın. Yedi mikrolitre nükleaz içermeyen su, 10X gücünde iki mikrolitre CutSmart tamponu ve bir mikrolitre NlaIII kısıtlama enzimi içeren enzim çözeltisini hazırlayın.Birkaç örnek varsa, karışımı yapmak için her içeriği çarpın ve tüp başına 10 mikrolitre aliquot yapın. Daha önce elde edilen 10 mikrolitre PCR ürününü tüp başına enzim çözeltisine ekleyin. İyice karıştırın ve daha önce gösterildiği gibi masa üstü minisantrifüj ile aşağı doğru döndürün.Tüpleri programlanmış bir termal döngü veya ısı bloğu üzerine ayarlayın. Ürünü inkübasyondan sonra soğuk koşullarda saklayın. 50 mililitre tek mukavemetli TAE tamponuna 0.75 gram agaroz ekleyin.Agarozu mikrodalgada tamamen çözünene kadar karıştırın ve ısıtın. Soğuduktan sonra, beş mikrolitre DNA lekesi ekleyin ve yavaşça karıştırın. Agaroz jelinin 25 mililitresini jel kalıbına dökün ve jelin katılaşmasını bekleyin.Kuyuya 10 mikrolitre sindirilmiş PCR ürünü yükleyin. Jeli 35 dakika boyunca 100 volt ile çalıştırın. Agaroz jelini ultraviyole ışık altında görüntüleyin.Sindirilmiş PCR ürünü kullanılarak gerçekleştirilen agaroz elektroforezi, sırasıyla vahşi tipte iki, heterozigotta üç ve homozigotta bir bant ile her genotipte farklı boyutlarda birkaç bant ile sonuçlandı. Blastosist analizi ile test enjeksiyonu, donör oligoların mikrolitresi başına 50 nanogram enjekte edilmesinde% 76.9'luk bir başarı oranı ve aynı donör oligoların mikrolitresi başına 25 nanogram enjekte edilmesinde% 25'lik bir başarı oranı ile sonuçlandı. Son olarak, donör oligoların mikrolitresi başına 50 nanogramın etanol çökeltilmesi ile enjekte edilmesi, kurucu hayvanların% 50'lik bir başarı oranına sahip olmasını sağlamıştır.Oligo donörlerinin etanol çökeltme ile saflaştırılması, yüksek genom düzenleme verimliliğini korurken toksisiteyi azaltmıştır. Dikkatli kullanım ve düşük miktarda reaktif eklenmesi çok önemlidir. Doğru şekilde eklendiğinden ve iyice karıştırıldığından emin olun.

removal-an-internal-translational-start-site-from-mrna-while

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

MRNA üzerindeki translasyonel duraklama siteleri tanımlamak için bir teknik tarif edilmiştir. Bu prosedür bir denatüre jel elektroforez ile olgunlaşmamış zincirlerinin boyutu analizi ve ardından bir hedef mRNA in vitro için, içerisinde sırasında ribozom üzerinde biriken olgunlaşmamış polipeptidlerin izolasyonu dayanmaktadır.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

Biz burada artık rutin stabil bağlı ribozom doğmakta olan zincir kompleksleri (RNCs) izole etmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Bu teknik bir 17 amino asit uzunluğunda SECM "tutuklama" dizisi bir prokaryotik çeviri uzama durdurmak olduğunu keşif yararlanır...

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA'ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici...

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

Mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri dış membran ile ilişkilidir. Biz ilişkili mRNA'lardan ve ribozomlarla maya mitokondri izolasyonu amaçlayan bir hücre altı bölme prosedürü tarif. Bu protokol, mRNA lokalizasyonu mekanizmaları ve mitokondri yakın olarak lokalize çeviri ortaya çıkarmak için çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler uygulanabilir.

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Vitro becerisini ölçmek için Toeprinting amaçları için formu çeviri başlatma kompleksleri ile ribozomlara koşulları çeşitli altında RNA transkripsiyonu. Bu iletişim kuralı toeprinting memeli RNA için bir yöntem açıklanır ve kap-bağımlı ve IRES uygulamalı çeviri çalışma için kullanılabilir.

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Önceden monte edilmiş Cas9/guide RNA ribonükleoprotein komplekslerinin doğrudan teslimi hematopoetik hücrelerde genom düzenleme için hızlı ve etkili bir araçtır. Burada, bir RUNX1 intronic susturucu silmek ve OCI-AML3 lökemik hücrelerde transkripsiyonel yanıtları incelemek için bu yaklaşımı kullanır.

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Burada temel yerine plazmid kullanarak standart reaktifleri tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Öğrenin, fare modellerinde Gja1 genindeki M213L mutasyonunu PCR ve restriksiyon enzimi kullanarak nasıl genotiplendireceğinizi. Bu yöntem, tam uzunluklu Connexin43 üretimini korurken GJA1-20k izoformunun translasyonunu engeller.

Tam Boy Proteinin İfadesini Korurken mRNA'dan Bir İç Translasyonel Başlangıç Bölgesinin Çıkarılması

Daha fazla video keşfet