Tam Boy Proteinin İfadesini Korurken mRNA'dan Bir İç Translasyonel Başlangıç Bölgesinin Çıkarılması
16 Mart 2022
Mevcut protokol, Gja1'de tam uzunlukta Connexin43 jenerasyonunu koruyan, ancak daha küçük GJA1-20k dahili olarak çevrilmiş izoformun translasyonunu önleyen tek bir M213L mutasyonunu tanımlamaktadır.
Tek bir kalıntı ikamesinin zorluğu, tek kalıntıdaki farklılığa rağmen hayvanları verimli bir şekilde genotiplemektir. Bir kısıtlama enziminin özel kullanımı, tipik PCR tabanlı genotiplemeye sadece tek, hızlı ve düşük maliyetli bir adım ekler. Bu protokol, hedef dizi genellikle böyle olan bir kısıtlama enzimi tarafından tanınırsa, mutasyon noktasına sahip başka herhangi bir fare modeline uygulanabilir.
Kuyruk ucunun bir ila üç milimetresini temiz makasla kesin ve 0,2 mililitrelik sekiz şeritli PCR tüpüne aktarın. Kuyruk örneğini el yazmasında açıklandığı gibi içerdikten sonra, ekstraksiyona kadar, yaklaşık bir haftaya kadar T-eksi 20 santigrat derecede saklayın. Tüp başına 100 mikrolitre doku lizis çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.200 kez G'de bir masa üstü minisantrifüj kullanarak spin-down yapın.
Kuyruk numunelerinin çözeltiye batırıldığından emin olun. Tüpleri, doku lizisi, inaktivasyon ve tutma parametrelerini programlayarak bir termal döngü setine ayarlayın. PCR hemen yapılamazsa doku lizatını dört santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın.
Beş mikrolitre nükleaz içermeyen su, 0.75 mikrolitre 10 mikromolar ileri ve geri primerler ve numune başına 7.5 mikrolitre PCR ana karışımı içeren bir PCR çözeltisini yeni bir PCR tüpüne hazırlayın. Önceden hazırlanmış doku lizatının bir mikrolitresini PCR çözeltisine ekleyin. PCR solüsyonunu iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.200 kez G'de bir masa üstü minisantrifüj ile aşağı doğru döndürün.
Tüpleri programlanmış bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, PCR ürünlerini bir ila iki ay boyunca dört santigrat derecede veya eksi 20 santigrat derecede yaklaşık bir yıl saklayın. Yedi mikrolitre nükleaz içermeyen su, 10X gücünde iki mikrolitre CutSmart tamponu ve bir mikrolitre NlaIII kısıtlama enzimi içeren enzim çözeltisini hazırlayın.
Birkaç örnek varsa, karışımı yapmak için her içeriği çarpın ve tüp başına 10 mikrolitre aliquot yapın. Daha önce elde edilen 10 mikrolitre PCR ürününü tüp başına enzim çözeltisine ekleyin. İyice karıştırın ve daha önce gösterildiği gibi masa üstü minisantrifüj ile aşağı doğru döndürün.
Tüpleri programlanmış bir termal döngü veya ısı bloğu üzerine ayarlayın. Ürünü inkübasyondan sonra soğuk koşullarda saklayın. 50 mililitre tek mukavemetli TAE tamponuna 0.75 gram agaroz ekleyin.
Agarozu mikrodalgada tamamen çözünene kadar karıştırın ve ısıtın. Soğuduktan sonra, beş mikrolitre DNA lekesi ekleyin ve yavaşça karıştırın. Agaroz jelinin 25 mililitresini jel kalıbına dökün ve jelin katılaşmasını bekleyin.
Kuyuya 10 mikrolitre sindirilmiş PCR ürünü yükleyin. Jeli 35 dakika boyunca 100 volt ile çalıştırın. Agaroz jelini ultraviyole ışık altında görüntüleyin.
Sindirilmiş PCR ürünü kullanılarak gerçekleştirilen agaroz elektroforezi, sırasıyla vahşi tipte iki, heterozigotta üç ve homozigotta bir bant ile her genotipte farklı boyutlarda birkaç bant ile sonuçlandı. Blastosist analizi ile test enjeksiyonu, donör oligoların mikrolitresi başına 50 nanogram enjekte edilmesinde% 76.9'luk bir başarı oranı ve aynı donör oligoların mikrolitresi başına 25 nanogram enjekte edilmesinde% 25'lik bir başarı oranı ile sonuçlandı. Son olarak, donör oligoların mikrolitresi başına 50 nanogramın etanol çökeltilmesi ile enjekte edilmesi, kurucu hayvanların% 50'lik bir başarı oranına sahip olmasını sağlamıştır.
Oligo donörlerinin etanol çökeltme ile saflaştırılması, yüksek genom düzenleme verimliliğini korurken toksisiteyi azaltmıştır. Dikkatli kullanım ve düşük miktarda reaktif eklenmesi çok önemlidir. Doğru şekilde eklendiğinden ve iyice karıştırıldığından emin olun.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, Gja1 geninde, tam uzunluktaki Connexin43 üretimine yol açarken daha küçük olan GJA1-20k izoformunun çevirisini önleyen tek bir M213L mutasyonuna sahip hayvanların genotiplemesi için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, PCR tabanlı genotipleme ile birlikte restriksiyon enzimlerinin kullanımının verimliliğini ve maliyet etkinliğini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Genetik
- Moleküler Biyoloji
- Hayvan Modelleri
Arka Plan
- Genetik mutasyonların tanımlanmasının önemi
- Tek kalıntı değişimlerinin yarattığı zorluklar
- Genotiplendirmede restriksiyon enzimlerinin uygulaması
Kullanılan Yöntemler
- PCR tabanlı genotipleme
- Nokta mutasyonlu fare modelleri
- DNA analizi için agaroz jel elektroforezi
Ana Sonuçlar
- Belirgin bant modellerine sahip genotiplerin başarılı şekilde tanımlanması
- Kurucu hayvanların üretilmesinde yüksek başarı oranları
- Genetik analiz için tanımlanan yöntemlerin doğrulanmış verimliliği
Sonuçlar
- Bu çalışma, fare modellerindeki mutasyonların genotiplendirilmesi için verimli bir protokol sunmaktadır.
- Gelişimsel biyolojideki genetik araştırmalar için değerli metodolojilere katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu protokol, izoform spesifik protein ekspresyonunun detaylıca incelenmesi gereken hedef doğrulama çalışmalarını destekleyerek, fare modellerindeki nokta mutasyonlarının hassas bir şekilde genotiplendirilmesini sağlar. Tam uzunluktaki protein fonksiyonunu korurken, kafa karıştırıcı trunke izoformları ortadan kaldırarak erken keşif aşamasındaki mekanistik risk azaltma süreçlerini geliştirir. Bu yaklaşım, Connexin 43 biyolojisi ve ilgili gap junction yolaklarını içeren terapötik hipotezler için öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tam uzunluktaki Cx43'ün fonksiyonel katkısını, N-terminali kırpılmış izoformlardan izole ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Büyük kohortlarda yabani tip, heterozigot ve homozigot mutant alelleri ayırt etmek için ölçeklenebilir bir genotipleme yöntemi sağlar.
- Öngörüsel Değer: Gözlemlenen fenotiplerin tam uzunluktaki protein kaybından mı yoksa izoforma özgü mekanizmalardan mı kaynaklandığını açıklığa kavuşturarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek kapasiteli tarama iş akışlarına uygun restriksiyon fragman paternlerine sahip DNA örnekleri üretir.
- Kantitatif Çıktı: PCR-restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi analizi aracılığıyla alele özgü kantifikasyona olanak tanır.
- Tekrarlanabilirlik: Mevcut PCR protokollerine eklenen düşük maliyetli, tek bir enzim kullanımıyla laboratuvarlar arası genotiplendirmeyi standartlaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Cx43 taşınmasının ve gap junction oluşumunun kardiyak, nöral veya onkolojik bozukluklarla ilişkili olduğu preklinik modelleri kolaylaştırır.
- Translasyonel Süreklilik: GJA1-20k'yı azaltırken tam uzunluktaki Cx43 ekspresyonunu koruyarak moleküler genotipi fenotipik sonuçla ilişkilendirir.
- Risk Ayarlı Kararlar: İzofom ekspresyon seviyelerinin in vivo fonksiyonel sonuçlarla korelasyonuna olanak tanıyarak go/no-go kriterlerini bilgilendirir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle izoforma özgü protein fonksiyonlarının çözümlenmesi gerektiğinde, erken hedef doğrulamadan preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Tam uzunluktaki protein fonksiyonu ile kısaltılmış izoform aktivitesini ayırt eden genetik modeller sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: CRISPR doğrulaması veya üretim kolonisi yönetimi gibi alt uygulamalar için analize hazır genomik DNA sunar.
- Analitikler: Agaroz jel üzerinde, dizileme yapmadan hızlı genotip atamasına olanak tanıyan net ve skorlanabilir bant modelleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Cx43 membran lokalizasyonu ve hücreler arası iletişimin temel mekanistik son noktalar olduğu preklinik çalışmalara imkan tanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Bir restriksiyon bölgesinin oluşturulabildiği veya bozulabildiği herhangi bir nokta mutasyonuna uyarlanabilir, yeniden kullanılabilir bir genotipleme platformu sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İzoform spesifik katkıları izole ederek hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tek bir PCR sonrası restriksiyon sindirimi adımı aracılığıyla işlem hacmini artırır ve örnek başına maliyeti düşürür.
- Stratejik Değer: Genotip-fenotip ilişkilerini netleştirerek öncü bileşik optimizasyonundaki karar güvenilirliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Cx43 bağımlı yolakları hedefleyen adayların risk ayarlı ilerlemesini sağlar.
Uygulama Hususları
- PCR primeri tasarımı ve restriksiyon enzimi seçimi konusunda moleküler biyoloji uzmanlığı gerektirir.
- Termal döngüleyicilere, agaroz jel elektroforez sistemlerine ve UV görüntüleme ekipmanlarına erişime bağlıdır.
- Tutarlı sonuçlar için doku lizisi ve PCR koşullarının kullanıcılar arasında standartlaştırılması gereklidir.
- Alternatif model sistemlere adaptasyon, sekans bağlamına ve restriksiyon enzimi uyumluluğuna bağlıdır.
- Yalnızca bir restriksiyon enzimi tanıma bölgesini değiştiren veya oluşturan mutasyonlarla sınırlıdır; sessiz mutasyonlar alternatif stratejiler gerektirebilir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
