Name: Primer İnsan Burun Epitel Hücreleri: Hassas Tıp Bağlamında Biyobankacılık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Keşfedin primer insan burun epitel hücrelerinin izolasyonu, hava-sıvı arayüzünde farklılaşması ve kriyoprezervasyonu. Bu yöntem, kistik fibrozis için kişiselleştirilmiş tedavilerde CFTR fonksiyonunu değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışmaya katıldıkları için tüm hastalara ve ailelerine içtenlikle teşekkür ederiz. Bu çalışma Fransız Derneği Vaincre la Mucoviscidose'den gelen hibelerle desteklendi; Fransız Birliği ABCF 2 ve Vertex İlaç İnovasyon Ödülleri.

Tüm deneyler, Helsinki Deklarasyonu ve insan araştırma etiği ile ilgili Huriet-Serusclat yasası tarafından açıklanan kılavuz ilkeler ve düzenlemeler uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. Şişelerin ve farklı ortamların hazırlanması
<ol><li>Amplifikasyon, hava-sıvı ve dondurma ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
	<li>50 mg kolajenin% 0.2 buzul asetik asidin 100 mL'sinde çözündürülerek bir insan kollajen IV stok çözeltisi hazırlayın. Manyetik bir karıştırıcı üzerinde en az 1 saat karıştırın ve filtreleyerek çözeltiyi sterilize edin. Işıktan korunan bir cam şişede 6 aya kadar 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Stok çözeltisini çift damıtılmış suda 1:5 oranında seyrelterek çalışan bir kollajen IV çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Plastik hücre kültürü şişelerini veya transwell filtrelerini kollajen çalışma çözeltisi ile kaplayın. 0,33 cm2 transwell filtreler için 100 μL,25 cm2 şişeler için 500 μL ve şişenin tüm büyüme yüzeyine 75cm2 şişeler için 1 mL eşit olarak dağıtın. NOT: Bu, şişenin bir yandan diğer yana hafifçe eğilmesiyle sağlanabilir. Alternatif olarak, şişelerin kaplanmasını kolaylaştırmak için, artan bir hacim kullanılabilir ve tüm yüzey eşit şekilde kaplandığında, sadece belirtilen hacmi bırakmak için kollajen çözeltisi aspire edilir. Aspire edilmiş kollajen çözeltisi daha sonra bir sonraki şişeyi kaplamak için hemen kullanılabilir (yani, üç adet 75cm2 şişe için, ilk şişede 3 mL kollajen çözeltisini eşit olarak dağıtın, 2 mL'yi aspire edin, daha sonra bir sonraki şişe için kullanılır, vb.).</li>
	<li>Hücre kültürü şişelerini inkübatörde en az 2 saat veya bir gece boyunca bırakın. Kollajeni iyice aspire edin ve şişeleri inkübatörde veya kaputun altında en az 20 dakika veya gece boyunca kurumaya bırakın.</li>
	<li>10 mL Mg2 + - ve Ca2 + içermeyen DPBS ile yıkayın, inkübatörde kurumaya bırakın ve ışıktan korumak için alüminyum folyoda saklayın. Şişeleri oda sıcaklığında (RT) 6 aya kadar saklayın.</li>
</ol>2. Burun fırçalama
NOT: Burun fırçalamanın, katılımcının akut enfeksiyonu yokken yapıldığından emin olun. KF hastaları pulmoner enfeksiyon gösteriyorsa, hastanın antibiyogramına bakın ve amplifikasyon ortamına ek antibiyotikler ekleyin. İnsan burun epitel hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi F508del/F508del hastalarından burun fırçalama ile toplandı9.
<ol><li>Hastadan burnunu üflemesini isteyin, daha sonra naphazolin çözeltisi ile% 5 ksilokaine batırılmış pamuklu ağlar kullanarak her iki burun deliğinin mukozasını topikal olarak anestezi altına alın.</li>
	<li>Medial duvarı ve her iki burun deliğinin inferior konkasını bir sitoloji fırçası kullanarak nazikçe fırçalayın. Fırçayı, ticari olarak temin edilebilen 2 mL yıkama ortamına sahip 15 mL'lik bir tüpe batırın; hücreleri ayırmak için hafifçe sallayın. İkinci burun deliğinde fırçalamayı tekrarlayın.</li>
	<li>Yıkama ortamına aşağıdaki antibiyotikleri ekleyin: Penisilin (100 U / mL), Streptomisin (100 μg / mL), Tazosilin (10 μg / mL), Amfoterisin B (2.5 μg / mL) ve Kolimisin (16 μg / mL). NOT: Burun fırçalamaları RT'de genişleme ve kültür için özel laboratuvarlara gönderilebilir ve fırçalamadan sonra 72 saate kadar tohumlanabilir.</li>
</ol>3. HNE izolasyonu
NOT: HNE sitoloji fırçasından izole edildi, Mg2 + ve Ca2 + içermeyen DPBS ile yıkandı,% 0.25 Tripsin ile ayrıştırıldı ve daha önce tarif edildiği gibi25 cm2 plastik şişe üzerine tohumlandı10.
<ol><li>Fırçayı tekrar tekrar 1000 μL'lik bir pipet konisinden geçirerek ve 2 mL Mg 2 +ve Ca 2 + içermeyen DPBS ile durulayarak hücreleri sitoloji fırçasından ayırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Hücreleri ayırmak için peleti% 0.25 Tripsin içinde 8-12 dakika boyunca yeniden askıya alın. 5 mL amplifikasyon ortamı ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peleti amplifikasyon ortamının 8 mL'sinde yeniden askıya alın ve 25 cm2 kollajen kaplı birşişeye tohumlayın. 37 °C'de ve% 5 CO2'de büyüyün. Bu, 0 numaralı pasaja karşılık gelir.</li>
	<li>Ertesi gün, ortamı 5 mL taze amplifikasyon ortamı ile değiştirin ve hücreleri günlük olarak bağlanma, morfoloji (hücreler yapışkan bir parke taşı görünümüne sahip olmalıdır) ve sayı açısından izleyin. NOT: İlk tohumlama yoğunluğu, burun fırçalamanın kalitesine ve epitel hücrelerinin oranına bağlı olarak değişir. Yeni izole edilmiş HNE hücreleri genellikle 3-10 gün içinde% 80-90 oranında akıcılığa ulaşır. Daha yavaş bir büyüme hızı, numunedeki yetersiz epitel hücrelerinin göstergesidir ve atılmalıdır.</li>
</ol>4. İnsan burun epitel hücrelerinin amplifikasyonu ve pasajı
<ol><li>İnsan burun epitel hücrelerini amplifikasyon ortamında 37 °C'de ve kollajen kaplı şişelerde% 80-90 akıcılığa kadar% 5 CO2'de büyütün, her 48-72 saatte bir ortam değiştirin. 25cm2 şişeler için 5 mL amplifikasyon ortamı ve 75cm2 şişeler için 10 mL kullanın.</li>
	<li>Hücreler% 80 -% 90 akıcılığa ulaştığında, hücreleri 10 mL Mg 2+ - ve Ca2 + içermeyen DPBS ile yıkayın, aspire edin ve atın.</li>
	<li>25 cm2'lik bir şişe için 1 mL%0.25 Tripsin (veya 75 cm2'lik bir şişe için 2 mL Tripsin) ekleyin ve 8-12 dakika boyunca inkübatöre (37 ° C, % 5 CO2) geri dönün.</li>
	<li>Hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için şişeye elinizin avucuyla sıkıca dokunun.</li>
	<li>Enzimatik reaksiyonu durdurmak için amplifikasyon ortamının 10 mL'sini ekleyin. Hücreleri durulamak ve ayırmak için amplifikasyon ortamını şişe yüzeyine çekmek ve dışarı atmak için 10 mL pipeti kullanarak şişeyi kuvvetlice durulayın.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Pelet, amplifikasyon ortamının 5-10 mL'sinde yeniden askıya alın.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. NOT: Hücreler bu noktada dondurulabilir (bkz. adım 5.1-5.3). Daha fazla amplifikasyon gerekirse, kollajen kaplı şişelere yeniden tohumlayın (25cm2'lik bir şişe üç adet 75cm2'lik şişeye genişletilebilir, daha büyük bir seyreltme önerilmez).</li>
</ol>5. Primer nazal epitel hücrelerinin kriyoprezervasyonu
NOT: Çözüldüğünde hücre büyümesini kolaylaştırmak için yeterli hücre elde etmek için biyobankacılıktan önce HNE hücrelerini 1. geçişe kadar büyütün. Bununla birlikte, biyobankacılık, ilk pasaj 0 veya pasaj 2'de mümkündür. Aşağıdaki kriyoprezervasyon adımları tüm pasajlara uyarlanmıştır.
<ol><li>Hücre sayımından sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı atın</li>
	<li>mL başına ve kriyov başına 3 x 10 6-5 x 10 6 hücre elde etmek için peleti zenginleştirilmiş dondurucu ortamda (Tablo 1) yeniden askıya alın.</li>
	<li>Sıcaklığı -80 ° C'de uygun bir kriyo-dondurma kabında dakikada ~ 1 ° C'de düşürerek hücreleri yavaşça dondurun. Ertesi gün, korunan numuneyi uzun süreli depolama için bir azot depolama kabına taşıyın (mevcut çalışma 17 aylık depolama ile sınırlıdır).</li>
</ol>6. Dondurulmuş güçlendirilmiş HNE hücrelerinin çözülmesi
<ol><li>Su banyosunu 37 ° C'ye ısıtın. Amplifikasyon ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın ve ortamı 37 ° C'ye ısıtın.</li>
	<li>Kriyovalleri azot depolama tankından çıkarın ve tüm şişeyi suya batırmamaya dikkat ederek hızlı bir şekilde su banyosuna yerleştirin. Sadece küçük bir donmuş damlacık kaldığında kriovialleri su banyosundan çıkarın. Şişeyi% 70 alkolle silin, kurutun ve kaputun altına yerleştirin.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak, çözülmüş hücreleri boş bir 15 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>Damla yönünde bir şekilde, 1 mL ılık amplifikasyon ortamı ekleyin. 1 dakika sonra, 1 mL amplifikasyon ortamı daha ekleyin ve bir dakika daha bekleyin.</li>
	<li>10 mL amplifikasyon ortamı ekleyin ve 500 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
	<li>Süper natantı aspire edin ve atın. Hücre peletini, en az 1 x 106 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için gereken bir amplifikasyon ortamında yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücreleri, amplifikasyon ortamını içeren kollajen kaplı bir şişeye tohumlayın.<ol>
<li>Kriyoval 4 x 106'dan fazla hücre içeriyorsa, amplifikasyon ortamının 10 mL'sinde 75cm2'lik bir şişeye tohumlayın.</li>
		<li>Kriyoval 4 x 106 hücreden daha azını içeriyorsa, tohum hücreleri, amplifikasyon ortamının 5 mL'sinde25 cm2'lik bir şişe üzerine yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C'de,% 5 CO 2'de inkübe edin ve önümüzdeki2-3 gün boyunca hücre genişlemesini görsel olarak gözlemleyin.</li>
	<li>Ardından, bölüm 4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hücre amplifikasyonu gerçekleştirin. NOT: Adım 4.7'de az sayıda hücre toplandıysa. (yani, genişlemeden önce 0 pasajında donuyorsa), adım 6.5. ve 6.6. atlanabilir ve hücreler santrifüjleme olmadan doğrudan 25cm2 kollajen kaplı şişeye ekilebilir. Daha sonra dimetil sülfoksiti (DMSO) çıkarmak için ortam ertesi gün değiştirilmelidir.</li>
</ol>7. İnsan burun epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüzünde farklılaşması
NOT: HNE hava-sıvı arayüzünde daha önce tarif edildiği gibi farklılaştırılmıştır10.
<ol><li>Hücreleri 0.33cm2 kollajen kaplı gözenekli filtreler üzerine 330.000 hücre / filtre yoğunluğunda tohumlayın ve apikal tarafta 300 μL amplifikasyon ortamı ve bazolateral tarafta 900 μL hava-sıvı ortam ile takviye edin.</li>
	<li>3 gün sonra, apikal ortamı aspire edin ve farklılaşmış bir epitel oluşturmak için hava-sıvı ortamdaki hücreleri hava-sıvı ortamında 3-4 hafta boyunca kültürleyin. Bazal ortamı her 48-72 saatte bir değiştirin.</li>
</ol>8. CFTR modülatörleri
<ol><li>CFTR modülatörleri içeren hava-sıvı ortam hazırlayın. VX-445, VX-661 ve VX-809'u 3 μM nihai konsantrasyonda ve VX-770'i 100 nM'de kullanın. 1 μM nihai konsantrasyonda düzeltici ABBV-2222 ve 10 μM'de güçlendirici ABBV-974 kullanın.</li>
	<li>Düzeltici ortamdakiyle aynı miktarda% 100 DMSO içeren hava-sıvı ortam hazırlayın.</li>
	<li>Ortam içeren ilaçları veya DMSO'yu bir hava-sıvı arayüzünde yetiştirilen polarize HNE hücrelerinin bazolateral tarafına ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2'de 24 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>24 saat sonra, ortamı aspire edin ve atın ve 8.1-8.2. adımlarında olduğu gibi hazırlanmış taze ortamla değiştirin ve 37 ° C'de% 5 CO 2'de24 saatlik bir süre boyunca inkübe edin.</li>
</ol>9. Ussing odası çalışmaları
<ol><li>Kısa devre akımı ölçümlerini (Isc) daha önce açıklandığı gibi voltaj kelepçesi koşulları altında ölçün9. NOT: Kültürlerin transepitelyal elektrik direnci (TEER) bir çubuk voltmetre ile ölçülmüştür ve aşağıdaki deneyler için sadece en az 200 Ω · cm2'ye ulaşan kültürler dikkate alınmıştır. Polarize HNE hücrelerinin filtreleri Ussing odalarına monte edildi ve voltaj kelepçesi koşulları altında kısa devre akım ölçümleri (Isc) ölçüldü.</li>
</ol>10. İmmünositokimya
<ol><li>Daha önce tarif edildiği gibi İmmüno-tespiti gerçekleştirin9. NOT: CFTR immüno-tespiti, anti-CFTR C-terminali (24-1) monoklonal antikoru kullanılarak gece boyunca 1/100 seyreltmede gerçekleştirildi. Zona-oklüdenler-1 (ZO-1) (1/500 seyreltme), alfa-tübülin (1/300 seyreltme), Muc 5AC (1/250 seyreltme) ve sitokeratin 8 (1/250 seyreltme) boyama ek filtrelerde yapıldı. PBS-Triton-X100% 0.1 ile yıkandıktan sonra,% 10 keçi serumunda Alexa 488 veya 594'e konjuge edilmiş keçi sekonder antikorları% 10 keçi serumunda (1/1000 seyreltme) 30 dakika boyunca ilave edildi. Son bir yıkamadan sonra, filtreler destekten kesildi ve DAPI içeren Vectashield montaj ortamı ile monte edildi. ImageJ yazılımı ile analiz edilen görüntüleri yakalamak için bir konfokal mikroskop (63x/1.4 yağ diferansiyel girişim kontrastı λ mavi PL APO hedefi) kullanıldı.</li>
</ol>11. İstatistiksel analiz
<ol><li>Uygun yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın. NOT: İstatistiksel analiz S.A.S yazılımı kullanılarak yapılmıştır. Hasta başına ve duruma göre birkaç HNE filtresi elde edildiğinden, kantitatif parametreler hasta başına medyan değerler (± SEM) olarak ifade edildi. Karşılaştırmalar (ortalama ± SD) Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler işaretli sıralama testi veya eşlenmemiş t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201(2012).</li>
<li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR%3A+folding%2C+misfolding+and+correcting+the+%CE%94F508+conformational+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+elexacaftor%2Ftezacaftor%2Fivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles%3A+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li>
<li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li>
<li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137(2020).</li>
<li>Bukowy-Bieryłło, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures%3A+how+far+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%3A+CCS%22%5BJournal%5D)">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375(2017).</li>
<li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl%E2%88%92+currents+in+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385(2018).</li>
<li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li>
<li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li>
<li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li>
<li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li>
<li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%3A+Official+Journal+of+the+European+Cystic+Fibrosis+Society%22%5BJournal%5D)">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li>
<li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550(2016).</li>
<li>Schögler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215(2017).</li>
<li>Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646(2013).</li>
<li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492(2018).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li>
<li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li>
<li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+%28CRC%29-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+%28Trikafta%29+combination%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983(2020).</li>
<li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free%2C+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor%2Btezacaftor%2Bivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774(2021).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li>
<li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li>
</ol>

Yazarlar, bu yayın veya bilimsel video prodüksiyonu ile ilgili hiçbir rakip finansal çıkar bildirmemektedir.

Kişiselleştirilmiş tıp bağlamında CFTR aktivitesini ölçmek için insan bronşiyal epitel (HBE) hücreleri için vekil olarak hasta kaynaklı nazal epitel hücrelerinin kullanılması, HNE üreme hücrelerinin kültür 9,11'deki özellikleri olarak önerilmiştir. HNE'nin HBE hücre kültürlerine göre güçlü avantajı, kolayca ve invaziv olmayan bir şekilde örneklenmeleridir. HNE hücre kültürlerinde kısa devre akım ölçümleri, epitel boyunca CFTR'ye bağımlı Cl- transportun...

Kistik Fibrozis (KF), Epitel 1,2'nin apikal yüzeyinde bulunan bir anyon kanalı olan CFTR proteininin yokluğuna veya işlev bozukluğuna yol açan Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) genindeki mutasyonlardan kaynaklanan otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. CFTR tedavisindeki son gelişmeler hastalığın prognozunu iyileştirmiş ve CFTR düzelticileri ile CFTR güçlendiricilerini birleştiren son onaylanmış ilaçlar, en sık görülen p.Phe508del mutasyonu (F508del)3,4 mutasyonunu taşıyan KF hastalarında akciğer fonksiyonlarında ve yaşam kalitesinde önemli iyileşmelere yol açmıştır. Bu umut verici terapötik ilerlemeye rağmen, KF hastalarının yaklaşık% 10'u, bu CFTR modülatörleri tarafından kurtarılamayan mutasyonlar taşıdıkları için uygun değildir. Bu hastalar için, spesifik mutasyonlar için en etkili kombinasyonu bulmak için diğer ilaçları veya ilaç kombinasyonlarını test etmeye ihtiyaç vardır ve kişiselleştirilmiş tedavilerin önemini vurgulamaktadır.
İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır ve CFTR fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl−) transportunun nicelleştirilmesine izin verir. HNE hücreleri, insan hava yolunun doğru bir modelini verir, ancak ömürleri kültürde sınırlıdır. Kültür tekniklerinin optimizasyonu sayesinde, hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Rho ile ilişkili kinaz inhibitörü (ROCKi) ile şartlı olarak yeniden programlanabilir, çoğaltılabilir ve mikro gözenekli filtrelerüzerindeki hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarında psödo-tabakalaşmış bir epitel haline getirilebilir 5,6. HNE kültürü için çok sayıda kültür protokolü mevcuttur (ticari olarak temin edilebilir, serumsuz, "ev yapımı", besleyici hücrelerle ortak kültür, vb.) ve büyümeyi, hücre popülasyonu farklılaşmasını ve epitel fonksiyonunu etkileyecek şekilde medya ve kültür koşullarının seçimi tanımlanmıştır 7,8. Buradaki protokol, CFTR fonksiyon tahlilleri için ALI'de farklılaştırılan çok sayıda HNE hücresinin başarılı bir şekilde elde edilmesini sağlayan basitleştirilmiş, besleyicisiz, ROCKi amplifikasyon yöntemi sunar.
Diferansiye HNE hücrelerinde, CFTR modülatörleri ile 48 saatlik bir tedavinin, CFTR'ye bağımlı Cl- akımının elektrofizyolojik düzeltmesini indüklemek için yeterli olduğunu ve in vitro olarak gözlenen düzeltmenin hastanın klinik iyileşmesi ile ilişkili olabileceğini gösterdik9. Bu nedenle HNE hücreleri, sadece temel KF araştırmaları için değil, hastaya özgü KFTR modülatör testi ile klinik öncesi çalışmalar için de uygun bir modeli temsil etmektedir. Bu kişiselleştirilmiş tedavi bağlamında, protokolün amacı, koşullarımızda yetiştirilen KF hastalarından kriyokorunmuş HNE hücrelerinin CFTR düzeltme çalışmaları için uygun bir model olduğunu doğrulamaktı ve taze ve dondurulmuş çözülmüş hücrelerden CFTR'ye bağımlı Cl-transportunu karşılaştırırken benzer sonuçlar beklenebilirdi. Çalışma ayrıca ikili ve üçlü tedaviler kullanırken farklı CFTR modülatörlerinin etkinliğini de değerlendirdi.

<table><tbody><tr><td>ABBV-2222</td><td>Selleckchem</td><td>S8535</td><td></td></tr><tr><td>ABBV-974</td><td>Selleckchem</td><td>S8698</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F-12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 keçi ikincil antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594 keçi ikincil antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-tubulin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab80779</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CFTR monoklonal antikoru (24-1)</td><td>R& D Systems</td><td>MAB25031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-sitokeratin 8 antikoru</td><td>Progen</td><td>61038</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Muc5AC antikoru</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-20118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ZO-1 antikoru</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-10804</td><td></td></tr><tr><td>Necker Hastanesi Eczanesi</td><td></td>tarafından sağlanan<td>Siprofloksasin</td><td></td></tr><tr><td>Kolimisin</td><td>Sanofi</td><td>Necker tarafından sağlanmıştır Hastane Eczanesi</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen tip IV</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>C-7521</td><td></td></tr><tr><td>sitoloji fırçası</td><td>Laboratuvar GYNEAS</td><td>02.104</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Epinefrin</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>E4375</td><td></td></tr><tr><td>F12-Besin Karışımı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Ferticult</td><td>Fertipro NV</td><td>FLUSH020</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler 25</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.367</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler 75</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.499</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>SLCJ0893</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Mg2+ ve Ca2+ içermeyen DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Necker Hastanesi Eczanesi</td><td></td>Transwell Filtreleri tarafından sağlanan Tazosilin <td>Mylan</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin %0,25Yaşam Teknolojileri</td><td></td> <td>25200056</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ile Vectashield montaj ortamıVX-445</td><td>Selleckchem</td><td>S8851</td><td></td></tr><tr><td>VX-661</td><td>Selleckchem</td><td>S7059</td><td></td></tr><tr><td>VX-770</td><td>Selleckchem</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>VX-809</td><td>Selleckchem</td><td>S1565</td><td></td></tr><tr><td>Ksilokain nafazolin %5</td> <td>Aspen, Fransa</td><td>Necker Hastanesi Eczanesi</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr> tarafından sağlanmıştır</tbody></table>

primer İnsan burun epitel hücreleri: hassas tıp bağlamında biyobankacılık

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır. Hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl-) taşınımını ölçmek için hava-sıvı arayüz koşullarında psödo-tabakalı bir epitel haline getirilebilir ve farklılaştırılabilir. Burun fırçalama kalitesi ve kriyoprezervasyonda hücre yoğunluğu gibi kritik adımlar verimli bir şekilde gerçekleştirilirse, HNE hücreleri başarılı bir şekilde biyobankaya yatırılabilir. Ayrıca, kısa devre akım çalışmaları, donarak çözülmenin HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve CFTR modülatörlerine tepkisini önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir. Bu çalışmada kullanılan kültür koşullarında, kriyov başına 2 x 106'dan az hücre dondurulduğunda, başarısızlık oranı çok yüksektir. Kriyov başına en az 3 x 106 hücre dondurmanızı öneririz. Bir CFTR düzelticisini bir CFTR güçlendiricisi ile birleştiren ikili tedavilerin, F508del-homozigot HNE hücrelerinde CFTR aktivitesi için karşılaştırılabilir bir düzeltme etkinliğine sahip olduğunu gösteriyoruz. Üçlü terapi VX-445 + VX-661 + VX-770, ikili terapi VX-809 + VX-770'e kıyasla CFTR aktivitesinin düzeltilmesini önemli ölçüde arttırmıştır. HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin ölçülmesi, CFTR modülatör tedavisine rehberlik etmek için yararlı olan umut verici bir klinik öncesi biyobelirteçtir.

Hava-sıvı arayüzünde kültürlenen taze HNE hücreleri, immün boyama ile değerlendirildiği gibi polarize ve diferansiye solunum epitelinin tipik özelliklerini göstermektedir (Şekil 1). HNE hücreleri, siliyer (pozitif alfa-tübülin boyaması) ve siliye olmayan mukus üreten goblet hücrelerinden (pozitif Muc5Ac immün boyama) oluşan psödo-tabakalaşmış bir solunum epitelinin in vivo durumunu taklit eden heterojen bir epitel hücresi tabakasına (pozitif keratin 8 immünoboyama) yeniden farklılaş...

Burada, hava-sıvı arayüzünde primer insan nazal epitel (HNE) hücrelerinin izolasyonu, amplifikasyonu ve farklılaşması ve güçlendirilmiş HNE'nin başarılı bir şekilde dondurulmasına ve daha sonra çözülmesine izin veren bir biyobankacılık protokolü açıklanmaktadır. Protokol, farklılaşmış HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve farklı modülatör tedavileri üzerine CFTR ile ilişkili klorür sekresyon düzeltmesini analiz eder.

Primer İnsan Burun Epitel Hücreleri: Hassas Tıp Bağlamında Biyobankacılık

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Bu protokol, primer nazal epitel hücrelerinin çoğaltılması, farklılaştırılması ve kriyopreservasyonunun temel adımlarını vurgulamaktadır. Kültür koşullarımızda primer nazal epitel hücreleri akciğer epitelini taklit eder. Bu, hasta kaynaklı kültürlere ve taze veya biyobankalı hücrelerden kişiselleştirilmiş tıp çalışmalarına izin verir.Hasta kaynaklı nazal epitel kültürleri, KFTR aktivitesini değerlendirmek ve hastanın yeni tedavilere bireysel yanıtını değerlendirerek kistik fibroz tedavisine yardımcı olmak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir mühendis olan Aurelie Hatton olacak. Başlamak için, 10 mililitre amplifikasyon ortamında nazal epitel veya HNE hücrelerini büyütün.75 santimetrekarelik kollajen kaplı bir şişede% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşana kadar 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ortamı her 48 ila 72 saatte bir değiştirin. Daha sonra, hücreleri 10 mililitre magnezyum ve kalsiyum içermeyen DPBS ile yıkayın.Tuzlu suyu aspire edin ve atın. İki mililitre% 0.25 tripsin eklemeden ve şişeyi sekiz ila 12 dakika boyunca inkübatöre geri döndürmeden önce. Daha sonra, hücrenin ayrılmasına yardımcı olmak için şişeye bir avuç içi ile sıkıca dokunun.Enzimatik reaksiyonu durdurmak için amplifikasyon ortamının 10 mililitresini ekleyin. Hücreleri durulamak ve ayırmak ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplamak için amplifikasyon ortamını şişe yüzeyine çekmek ve dışarı atmak için şişeyi 10 mililitrelik bir pipet kullanarak kuvvetlice durulayın. Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.Peleti beş ila 10 mililitre amplifikasyon ortamında tekrar askıya alın. Sonra bir hemositometredeki hücreleri sayın. Hücre sayımından sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.Daha sonra, mililitre başına altı hücreye üç ila beş kez 10 elde etmek ve bir kriyo şişesine yerleştirmek için peleti zenginleştirilmiş dondurucu ortamda tekrar askıya alın. Sıcaklığı dakikada yaklaşık bir santigrat derece düşürerek hücreleri eksi 80 santigrat derecede uygun bir kriyodondurucu kapta yavaşça dondurun. Ertesi gün, uzun süreli depolama için korunan numuneyi bir azot depolama kabına taşıyın.Taze hazırlanmış amplifikasyon ortamını 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda ısıtın. Kriyotik şişeleri azot depolama tankından çıkarın ve tüm şişeyi suya batırmamaya dikkat ederek hızlı bir şekilde su banyosuna yerleştirin. Sadece küçük bir donmuş damlacık kaldığında kriyo şişelerini su banyosundan çıkarın.Şişeleri% 70 alkol ile silin ve kaputun altına yerleştirin. Bir mililitrelik pipet kullanarak, çözülmüş hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, damla yönünde bir mililitre ılık amplifikasyon ortamı ekleyin.Bir dakika sonra, bir mililitre amplifikasyon ortamı daha ekleyin ve bir dakika bekleyin. 10 mililitre amplifikasyon ortamı ekleyin ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın. Süper natantı aspire edin ve atın.Pelet, mililitre başına altı hücreye bir kez 10 hücre yoğunluğu elde etmek için gereken bir amplifikasyon ortamı hacminde yeniden askıya alın. Hücreleri, amplifikasyon ortamı içeren 25 santimetrekarelik kollajen kaplı bir şişeye tohumladıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha önce gösterildiği gibi hücre amplifikasyonunu gerçekleştirmeden önce iki ila üç gün boyunca hücre genişlemesini görsel olarak gözlemleyin.Hücreleri filtre başına 3.3 kat 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda, apikal tarafta 300 mikrolitre amplifikasyon ortamı ve bazolateral tarafta 900 mikrolitre hava sıvı ortamı ile desteklenmiş 0.33 santimetrekare kollajen kaplı gözenekli filtrelerde tohumlayın. Üç gün sonra, apikal ortamı aspire edin ve farklılaşmış bir epitel oluşturmak için hava-sıvı ortamındaki hücreleri hava-sıvı ortamında üç ila dört hafta boyunca kültürleyin. Bazal ortamı her 48 ila 72 saatte bir değiştirin.Hava-sıvı arayüzünde kültürlenen taze HNE hücreleri, polarize ve farklılaşmış solunum epitelinin tipik bir özelliğini sergiledi. 78 HNE hücre örneğinde, hemen ve bir ila yedi günlük bir yıkama ortamında taşındıktan sonra tohumlanan burun fırçalamada başarı oranları karşılaştırıldı. Başarılı kültürlerin ilk ortalama yüzdesi% 82 idi ve sıfır ila beş gün arasında tohumlanan örneklerde% 87'ye ulaştı.Taze koşullarda başarılı bir şekilde farklılaşan örneklerin %83'ü kriyokorunmuş örneklerde de başarılı olmuştur. Benzer şekilde, taze koşullarda farklılaşamayan örneklerde,% 71'i donma-çözülme koşullarında da başarısız olmuştur. Dahası, kriyo şişe başına altı hücreye iki ila üç kez 10 arasında dondurulmuş örneklerin% 50'si çözüldüğünde büyüyemedi ve altı hücreye iki kez 10'un altında% 80'e ulaştı.Forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişimi ve DMSO ile muamele edilmiş HNE hücrelerinde CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak kısa devre akımı değişimi için, taze veya dondurulmuş çözülmüş HNE arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Tedavi üzerine, her iki hücre tipi de forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişiminde bir artış ve CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak kısa devre akımı değişiminde bir azalma ile önemli bir düzeltme göstermiştir. CFTR fonksiyonlu ikili tedavilerin düzeltici yanıtı, DMSO ile tedavi edilen HNE hücrelerinin forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişimine kıyasla değerlendirildi ve CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak hem VX-809 artı VX-770 hem de VX-661 artı VX-770 ile anlamlı derecede iyileşti.HNE'de altı F508del homozigot hastadan üç farklı CFTR modülatör tedavisi karşılaştırıldı. Bir CFTR düzeltici ve güçlendirici, hem köşe hem de CFTR modülatörleri ile birlikte kullanıldığında, forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişimini ve CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak kısa devre akımı değişimini benzer ölçüde düzeltir. HNE hücrelerini dondururken, çözülme üzerine iyi bir sonuç alma şansını artırmak için kriyo şişe başına en az 3 milyon hücreye sahip olmak önemlidir.HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin, kistik fibrozda kişiselleştirilmiş tedavileri değerlendirmek ve ayarlamak için iyi bir prediktif model olduğu gösterilmiştir.

primary-human-nasal-epithelial-cells-biobanking-context-precision

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz burada, sıçan ve insan burun boşlukları olfaktör mukoza biyopsi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu biyopsiler, beyin hastalıkları moleküler anomaliler tespit edilmesi ya da beyin travması / hastalık hayvan modellerinde hücre nakli için kullanılabilir multipotent yetişkin kök hücreleri izole ya için de kullanılabilir.

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

Insan gönüllülerin yüzeysel sıyrık biyopsi yoluyla elde edilen nazal epitel hücreleri, doku kültürü ekler üzerine genişletilmiş ve aktarılır. Ortak akışkanlığa eriştikten sonra hücreler, kirpikli olmayan silli hücre kültürleri, sonuçta hava sıvı arayüzü yetiştirilir. Farklılaşmış nazal epitel hücre kültürleri solunum mukozasını eğitim için uygun deneysel modeller sunar.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

Bu yayın, çocuklardan nazal epitel mukozasının başarılı bir şekilde örneklenmesi ve kültürlenmesi ve bu hücrelerin indüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için yöntemleri göstermektedir.

Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

Kutanöz tümörler genellikle Mohs mikrografik ameliyattan sonra atılır. Klinik destek personelinin klinik operasyonlara müdahale etmeden, aşağısındaki laboratuvar uygulamaları için kutanöz tümörün ( örn., Skuamöz hücreli karsinoma, bazal hücreli karsinoma ve melanom) örneklerini etkili bir şekilde işleyip saklayabilmesini sağlayan bir protokol açıklanmaktadır.

Kliniğe Dayalı Biyorepositoryum Kurulması

Burada insan nazal epitel hücreleri kültürleri üç boyutlu küresel oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Pulcuklarının sonra sürücüye Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) teşvik-bağımlı iyon ve CFTR işlevi için bir proxy gibi küresel luminal boyutunda değişiklik miktarının sıvı salgılanması.

İnsan nazal epitel hücre pulcuklarının nesil bireyselleştirilmiş Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatör çalışma için

Burada insan burun epitel hücrelerinden in vitro organoid modeli tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Protokol, standart laboratuvar ekipmanı gerektiren ölçümler için seçeneklere ve özel ekipman ve yazılımlar için ek olanaklara sahiptir.

İnsan Nazal Epitel Organoidlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Bu protokol, nazal epitel hücresi toplanmasını, genişlemesini ve organotipik hava yolu epitel hücre modellerine farklılaşmasını ve canlı hücre görüntüleme ve özel yapım senaryolar yoluyla kirpik vuruş sıklığının nicelleştirilmesini açıklar.

Primer İnsan Nazal Epitel Hücre Modellerinin Silia Beat Sıklığının Ölçülmesi İçin Toplanması, Genleştirilmesi ve Farklılaştırılması

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşma protokollerindeki son gelişmeler, organa özgü hücre tiplerinin kademeli olarak türetilmesine izin vermektedir. Burada, iPSC türevi hava yolu bazal hücrelerinin bakımı ve genişlemesi ve hava-sıvı arayüz kültürlerinde mukosiliyer bir epitel halinde farklılaşması için ayrıntılı adımlar sunuyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Nazal epitel, tüm solunum yolu patojenlerinin karşılaştığı birincil bariyer bölgesidir. Burada, fizyolojik olarak ilgili bir sistemde insan koronavirüs-konakçı etkileşimlerini karakterize etmek için hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri olarak büyütülen birincil nazal epitel hücrelerini kullanma yöntemlerini özetliyoruz.

İnsan Koronavirüs-Konakçı Etkileşimlerini Karakterize Etmek için Hava-Sıvı Arayüzünde Büyütülen Primer Nazal Epitel Hücrelerinin Enfeksiyonu

Burada, uzun süreli biyobankacılık için primer bronşiyal epitel hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesi ve hava-sıvı arayüzünde kültür yoluyla farklılaşmış epitel hücrelerinin üretilmesi için tekrarlanabilir, uygun fiyatlı ve sağlam bir yöntem sunulmaktadır.

Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Keşfedin primer insan burun epitel hücrelerinin izolasyonu, hava-sıvı arayüzünde farklılaşması ve kriyoprezervasyonu. Bu yöntem, kistik fibrozis için kişiselleştirilmiş tedavilerde CFTR fonksiyonunu değerlendirmeye olanak tanır.

Primer İnsan Burun Epitel Hücreleri: Hassas Tıp Bağlamında Biyobankacılık

Daha fazla video keşfet