Name: Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Öğrenin, insan akciğer dokusundan bronşiyal epitel hücrelerini izole etme ve hava-sıvı arayüzünde iyi diferansiye kültürler oluşturma yöntemini. Bu teknik, solunum sağlığı ve hastalık mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu katkıda açıklanan modeli kullanan çalışmalar, Hollanda Akciğer Vakfı, Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Örgütü (ZonMw, COVID-19 MKMD hibesi), Hollanda Hayvan Testlerinin Değiştirilmesi Derneği (Stichting Proefdiervrij, hibe #114025007) ve Boehringer Ingelheim ve Galapagos gibi şirketlerden araştırma hibeleri de dahil olmak üzere çeşitli finansman kuruluşları tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Yazarlar, ilgili çıkar çatışmalarının olmadığını beyan ederler.

Burada sunulan protokol, insan bronşiyal epitel hücrelerinin rezeke edilmiş akciğer dokusundan izolasyonunu, farklılaşma potansiyeli kaybı olmadan hücrelerin optimal genişlemesi için bir yöntem, bir kriyoprezervasyon prosedürü ve iyi diferansiye ALI-PBEC kültürleri üretmek için bir prosedürü açıklamaktadır. Ayrıca, kalite kontrolün bir tanımının yanı sıra farklılaştırılmış ALI-PBEC'lerin izlenmesi ve değerlendirilmesi için talimatlar da verilmektedir.
Tarif edilen protokol, akciğer kanseri tanısı ile ilgili ameliyat geçiren hastalardan akciğer lobundan rezeke edilen makroskopik olarak normal, tümörsüz bir bronşiyal halka ile başlar. Bu nedenle, bu halkaların kesinlikle sağlıklı doku olarak kabul edilemeyeceğine ve bu nedenle hücre kültürü özelliklerini etkileyebileceğine dikkat edilmelidir. Bronşiyal epitel hücrelerini elde etmek için alternatif kaynaklar, bronşiyal biyopsilerin, bronşiyal fırçalamaların veya bir nakil donöründen veya alıcı akciğerlerden doku kullanılmasını içerir. Kaynağı ne olursa olsun, akciğer dokusu kullanılırken, mikrobiyal kontaminasyon riski göz önünde bulundurulmalıdır ve bu nedenle hücre kültürünün mikrobiyal kontaminasyon riskini azaltmak için farklı kültür ortamlarında antibiyotikler kullanılır. Özellikle, mikoplazma, hücre kültürü üzerindeki çok çeşitli etkileri, hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan antibiyotiklere direnci ve mikoplazma kontaminasyonunun sadece mikoplazma tespit testleri ile doğrulanabilmesi nedeniyle hücre kültüründe yüksek ve yaygın bir risktir. Bu nedenle, hücrelerin akciğer dokusundan izole edilmesini takiben hücre kültürünün ilk aşamasında, geniş spektrumlu antimikrobiyal formülasyon Primosin kullanılır ve kültür işlemi sırasında, rastgele seçilen örnekler mikoplazmanın varlığı için test edilir.
Bir bronşiyal halka ile başlayan izolasyon prosedürü, farklılaşma kapasitesinden ödün vermeden ALI'de kültürleri başlatmak için gereken bu birincil hücrelerin genişleme derecesine izin vermek için yeterli başlangıç materyali sağlar. Bununla birlikte, izole edilmiş epitel hücrelerinin sınırlı sayıda hücre ile genişlemesine başlanması, ALI kültürü için tohumlanabilecek yeterli sayıda hücreye sahip yeterli sayıda ekin elde edilmesinde sorunlara neden olabilir. Genişletilmiş kültür ve primer hücrelerin tekrar tekrar geçmesi, replikatif yaşlanmaya neden olabilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için çeşitli çözümler önerilmiştir. Horani ve ark., Rho kinaz inhibitörü (ROCK) Y-27632'nin bazal hücrelerin proliferasyonunu arttırdığını göstermiştir 30, Mou ve ark. farklılaşmış epitel hücre tabakası31'in özelliklerini korurken bazal kök hücreleri genişletmek için ikili Smad inhibisyonu kullanmışlardır ve Sachs ve ark. hava yolu epitel hücrelerini genişletmek ve çoklu pasajlar boyunca farklılaşma potansiyellerini korumak için kullanılabilecek bir hava yolu organoid sistemi geliştirmişlerdir 32. İkinci yöntem ayrıca, burada tarif edildiği gibi ALI kültürüne aktarılmadan önce, preterm bebeklerden (&lt;28 haftalık gebelik yaşı) trakeal aspiratlar (TA'lar) ve bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısı gibi çok düşük hücre sayısına sahip kaynaklardan hücreleri genişletmek için de kullanılmıştır33. BAL ve TA'lardan izole edilen hücrelerin, bronşiyal dokudan üretilen hücrelere benzer bir farklılaşma kapasitesi gösterdiği bulunmuştur, ancak farklılaşma, Çentik sinyal inhibisyonu veya Th2 sitokin IL-1333 kullanılarak daha siliyer veya daha fazla kadeh hücresi içeren kültürlere doğru çarpıtıldığında farklılıklar gözlenmiştir. Bu nedenle, ALI-PBEC'ler benzer yaklaşımlar kullanılarak düşük epitel hücre sayısına sahip bir başlangıç materyalinden kültürlenirse, protokolün 6. bölümünde tartışıldığı gibi, kültürleri her zaman temel kalite kriterleri açısından kontrol etmeleri önerilir. Önemli olarak, besleyici hücrelerin kullanımı, zamanın ve hücre numarasının gerekli olduğu nakledilebilir iskele mühendisliği için gerekli olan daha büyük hücre sayılarının elde edilmesine de yardımcı olabilir. Bu, otolog epitel hücrelerinin trakea hastalığı olan bir hastadan türetilen biyopsilerden kültürlendiği ve hücrelerin bir murin embriyonik besleyici tabakası (mitotik olarak inaktive edilmiş 3T3-J2 fibroblastları) ve yukarıda belirtilen Rho / ROCK yolunun inhibitörü (Y-27632) varlığında hızla genişlediği bir çalışma ile gösterilmiştir (Y-27632)34. Elde edilen hücre kültürünün, trakea iskelelerinin yeniden popülasyonu için yararlı olduğu bulundu ve bu nedenle bu, bir nakil modeli için uygun bir protokol olarak görülebilir.
Bu katkıda açıklanan protokolü kullanırken, aynı zamanda diğer kültür protokollerini kullanırken, kaçınılmaz olarak bir seçim yanlılığı ortaya çıkar. Kültürleri başlatmak için kullanılan hücrelerin kökeni, orta bileşim ve diğer protokol detayları gibi protokol detaylarındaki farklılıkların, kültürlerin hücresel bileşiminde değişikliklere ve dolayısıyla ALI kültürünün yanıtında değişikliklere yol açabileceğini anlamak önemlidir33,35. Ek olarak, hava yolu hücrelerini ayırt etmek için farklı ortamları karşılaştırırken hücre özelliklerinde farklılıklar da gözlenmiştir10,11. PneumaCult ve cBD besiyeri karşılaştırıldığında, kadeh hücresi ve kulüp hücresi mRNA belirteçleri, TEER değerleri ve hücre tabakası kalınlığında farklılıklar gözlendi. Bu gözlemlere dayanarak, istatistiksel dayanak eksikliğine rağmen, kullanılan donör sayısının düşük olması, ortam bileşiminin müşteriler tarafından bilinmemesi ve PneumaCult ortamının daha yüksek maliyetleri nedeniyle, laboratuvarımızda cBD ortamını kullanma kararı alınmıştır.
Tartışıldığı gibi, hücreler başlangıçta organoid kültür kullanılarak genişletilebilir ve daha sonra 2D ALI insert sistemine aktarılabilir. Bu önemlidir, çünkü hava yolu epitel organoidleri havadaki maddelere maruz kalmak için uygun değildir, oysa ALI 2D sisteminin kullanımı, sigara dumanı23,36 gibi havadaki maddelerin kültürlenmiş hava yolu epitel hücreleri üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine izin verir. ALI hava yolu epitel hücre kültürlerini oluşturmak için farklı bir yaklaşım, insan pluripotent kök hücrelerinin (hiPSC'ler) farklılaşmasıyla hava yolu epitel hücreleri üretmektir37. Bu tür protokollerde, proksimal hava yolu progenitörlerine farklılaşmadan sonra farklılaşma protokolünün son aşamasında, hücreler burada tarif edilenlere benzer prosedürler kullanılarak kültürle ALI'ye ayırt edilebilir.
Mevcut protokolde, cBD ortamı ALI'de kültür için kullanılmaktadır. cBD ortamı, Fulcher ve ark.38'den ve diğer çalışmalardan esinlenen farklı takviyelerin bir karışımı eklenerek hazırlanan serumsuz bir ortamdır. Ek çözelti 52 μg / mL sığır hipofiz ekstresi (BPE), 0.5 μg / mL hidrokortizon, 0.5 ng / mL insan EGF, 0.5 μg / mL epinefrin, 10 μg / mL transferrin, 5 μg / mL insülin, 6.5 ng / mL triiyodotironin ve 0.1 ng / mL RA39 içerir. BPE bir doku ekstresi olduğundan ve partiye göre varyasyona maruz kaldığından, ortam tam olarak tanımlanmış bir ortam olarak kabul edilemez ve hayvansız değildir. Tamamen tanımlanmış hücre kültürü ortamı, toplu işlemden partiye farklılıkları en aza indirmek için tercih edilir. Hayvansız araştırmaya geçiş göz önüne alındığında, hayvansal ürünler içermeyen ve bilimsel topluluk için uygun fiyatlı tanımlanmış medya üretmek için çaba gösterilmesi önemlidir.
Araştırma sorusuna bağlı olarak ALI modeline dayalı olarak çeşitli deney düzenekleri kullanılabilir. Örneğin, farklılaşma sürecini etkileyebilecek bileşiklerin etkisini araştırmak için, bu, batık kültürün farklı aşamalarında, farklılaşma sırasında veya iyi farklılaşmış aşamada bileşikleri kültüre ekleyerek ele alınabilir. ALI-PBEC kültürünün hücresel bileşimi, spesifik bileşiklerin eklenmesiyle etkilenebilir; Örneğin, IL-13 varlığında ALI-PBEC'leri ayırt etmek, daha fazla kadeh hücresi ve daha az siliye hücreli bir kültür üretirken, farklılaşma sırasında γ-sekretaz inhibitörü DAPT (Çentik sinyalini bloke etmek için kullanılır) ile tedavi, kadeh hücreleri pahasına daha siliyer hücrelere sahip bir kültürle sonuçlanır 23,40,41,42.
Ayrıca, hücreleri uyarmak veya belirli süreçleri bloke etmek için kullanılan ajanlar ya bazal bölmeye ya da (çok küçük bir hacimde) kültürün apikal bölmesine uygulanabilir. Hücreler ayrıca apikal taraftan havadaki maddelere de maruz kalabilir. Bu tür maruz kalma tasarımları, dizel egzozunun veya tam sigara dumanının PBEC'ler üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır 23,43,44. Ortam, bazal tarafta salgılanan proteinleri izlemek için ortam her değiştirildiğinde hasat edilebilir; aynısı, bazal ortamı yenilerken PBS ile yıkanan hücrelerin apikal tarafı için de geçerlidir. Apikal yıkama adı verilen yıkama hasat edilir ve kadeh hücreleri tarafından üretilen mukusun daha verimli bir şekilde ayrışması için isteğe bağlı ditiyoeritritol (DTE) eklenir. Hücre lizatları, toplam protein, RNA ve kromozomal ve mitokondriyal DNA'nın izolasyonu için elde edilebilir. Hücreler, polietilen tereftalat (PET) membranını plastik uçtan keserek ve bu zarı çoklu immünofloresan boyamaları için daha küçük parçalara ayırarak spesifik belirteçler için antikorlar kullanılarak daha fazla çalışılabilir45. Ayrıca, akış sitometrisi veya FACS, eklerdeki hücrelerin tripsinizasyonunu takiben de kullanılabilir. ALI aşamasında, hücresel bariyerin gelişimi, elektrik direncini ölçerek ve daha sonra elektrik direncinin membran ekinin yüzey alanıyla ters orantılı olduğu TEER'i hesaplayarak izlenebilir. Hesaplama, aşağıdaki formülü kullanarak Ohm yasasına dayanır: buradaRm, ölçülen elektrik direncidir, Rb, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65102/65102eq01.jpg" style="margin: auto;">kaplama ve hücreler içermeyen bir kesici ucun temel elektrik direncidir ve SA, kesici ucun zarının yüzey alanıdır. EVOM2 ve STX / çubuk elektrotları kullanarak elektrik direncini ölçmek basittir, ancak kuyuya sokulduğunda taşıma prosedürlerine büyük ölçüde bağlıdır. Ayrıca, elektrotun şeklinin, nispeten geniş yüzey alanının bariyer fonksiyonunun ölçümünü etkilediği öne sürülmüştür17.
Doğru doku temsilini arttırmayı amaçlayan ALI hücre kültürü sistemindeki daha fazla gelişme, lökositler, fibroblastlar veya endotel hücreleri gibi ek hücre tiplerinin kokültürünü içerir46,47,48. ALI-PBEC'in granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) veya M-CSF farklılaşmış makrofajlarla birlikte kültürlenmesinin doğuştan gelen epitel yanıtlarını ve onarımını belirgin şekilde etkilediği gözlenmiştir48. Bu tür kokültür modellerinde, orta uyumluluğun bir sorun olabileceğine dikkat etmek önemlidir. Hava yolu epitel hücre kültürü için kullanılan ortam özellikle PBEC'ler için geliştirildiğinden ve diğer hücre tipleri için en uygun olmayabilir, optimizasyon gereklidir. İzole PBEC'lerin kullanılabileceği hava yolu biyolojisi alanında görülen bir diğer ilerleme türü, Çip Üzerinde Organlar (OoC) teknolojisinin kullanılmasıdır49,50. Bu teknolojiyi kullanarak, gerilme, hava ve orta akış gibi solunum ve kan akışının mekanik kuvvetlerinin etkisi incelenebilir 29.
Çeşitli donörlerden PBEC'ler kullanılırken donörler arası değişkenlik önemli olabilir ve bu nedenle epitel hücre kültürü çalışmalarında bu değişkenliği hesaba katmak için birkaç donörden alınan hücreleri kullanmayı düşünmek önemlidir. ALI-PBEC'lerin kültürü zaman alıcı olduğundan ve önemli maliyetlerle ilişkili olduğundan, farklı donörlerden gelen hücreleri tek bir hücre kültürü ekinde karıştırarak ALI-PBEC kültürleri oluşturma seçeneği incelenmiştir. Bu şekilde, pilot deneyler, çeşitli bireysel donörlerden türetilen kültürlerin tepkilerini analiz etmeden önce birincil hücreler kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Ek olarak, farklı özelliklere sahip donörler (örneğin, farklı yaş kategorisi veya cinsiyet) keşif çalışmaları için gruplandırılabilir. Donör karışımlarını kullanırken, bir donörün daha yüksek bir proliferasyon oranının bir sonucu olarak sonuçlara hakim olma olasılığını önlemek için farklı donörlerin eşit hücre sayılarının mevcut olduğundan emin olmak önemlidir. Bu nedenle, bireysel donörlerden gelen hücreler ayrı ayrı genişletilir ve ALI'ye geçişten önce ekteki çoğalmayı en aza indirmek için tek bir donörden gelen tohumlama hücrelerine kıyasla ekte daha yüksek bir yoğunlukta tohumlanır. Donör karışımlarının ve ilgili bireysel donörlerin yanıtları, SARS-CoV-2'nin enfeksiyon kinetiği incelenerek karşılaştırıldı. RT-qPCR ve immünofloresan boyama kullanılarak, donör karışımının, üretilen benzer sayıda virüs partikülünü ve benzer sayıda enfekte olmuş hücreyi göstererek çeşitli bireysel donörlerin iyi bir temsilini sağladığı gözlenmiştir28.
Hayvan modelleri için kabul edilebilir bir alternatif olmak için, kültürlenmiş bronşiyal epitel hücrelerinin gen düzenlemesi uygulanabilir olmalıdır51. ALI-PBEC'lerde küçük enterferan RNA'lar (siRNA'lar) kullanılarak RNA girişim teknolojisi incelenmiştir, ancak kültürün batık fazı sırasında hücrelerin siRNA ile transfekte edilmesi gerektiğinden, kültür sırasında siRNA transfeksiyonu sıklıkla tekrarlanmadığı sürece, uzun kültür süresi nedeniyle ALI kültürü sırasında nakavt yeterince sürdürülmemektedir52. Bununla birlikte, siRNA'lar batık bazal hücrelerde gen ekspresyonunu değiştirmek için başarıyla kullanılabilir. Diğerleri, ribonükleoprotein (RNP) dağıtımı 53 ile primer ALI hava yolu epitel hücre kültürlerinde gen düzenlemeyi başarmak için CRISPR / Cas9 teknolojisini başarıyla kullanmışlardır. Bu tür teknikleri kullanırken, hücrelerin tam farklılaşma kapasitelerini korumaları esastır. Primer hava yolu hücre kültürleri süresiz olarak geçilemediğinden, gen düzenlenmiş hücrelerin klonal genişlemesi kolay değildir ve transfekte hücreleri seçmek için ortamın eklenmesi zahmetlidir. Bu nedenle, tüm kültürlü hücrelerde istenen yıkımı elde etmek zordur. Nakavt klonları üretmenin bir alternatifi, hiPSC54'te nakavt stratejilerinin kullanılması ve bu hücrelerin hava yolu epitel hücreleri üretmek için kullanılmasıdır. Bir diğeri, optimal olmasa da, gen düzenlenmiş hücreleri klonal olarak genişletmek için ölümsüzleştirilmiş bir PBEC hattı oluşturmaktır55.
Burada sunulan protokol, iyi farklılaştırılmış bir psödostratifiye ALI-PBEC üretmenin bir yoludur, ancak diğer protokollerin de sunulan protokole kıyasla daha küçük ve daha büyük farklılıklarla böyle bir kültür oluşturduğu bulunmuştur. Bize göre, ALI-PBEC sisteminin ve hava yolu epitel hücrelerinin benzer kültür sistemlerinin hayvan deneyleri için geçerli bir alternatif haline gelmesi için kültür yöntemlerinin laboratuvar genelinde doğrulanması ve sıkı kalite kontrolü şarttır.

Hava yolu epitelinin çeşitli akut ve kronik akciğer hastalıklarındaki rolü çeşitli derlemelerde tanımlanmıştır 1,2,3,4,5,6,7. Hava yolu epitel hücrelerinin iyi farklılaşmış kültürleri, hava yolu epitelinin rolünü çözmek için önemli bir araçtır. Hava-sıvı arayüzü (ALI) hava yolu epitel hücre kültürü, hava yolu bazal epitel hücrelerinin farklılaşmasını teşvik etmek ve böylece hava yolu epitelini in vitro 8,9 güvenilir bir şekilde incelemek için geniş çapta uygulanır. Geçtiğimiz yıllarda, COVID-19 pandemisi ile ilgili yeni araştırma girişimleri ve dünya çapında hayvansız araştırmalara geçişin bir sonucu olarak bu tür modellerin kullanımı daha da artmıştır. Bu nedenle, bu model hücre hattının artan kullanımı, sağlam sonuçlar elde etmek için prosedürlerin ve deneyimlerin paylaşılması ihtiyacını vurgulamaktadır. Bu aynı zamanda araştırma grupları arasında sonuçların karşılaştırılmasına da izin verecektir. Prosedürün sağlamlığı temel özelliktir ve bu nedenle kalite kontrolüne tabi tutulması gerekir. Birkaç laboratuvar, ALI'deki birincil hava yolu epitel hücrelerini kültürlemek için protokoller geliştirmeye yatırım yapmıştır. Bu prosedürler ayrıntılı olarak paylaşıldığında zaman, çaba ve gerekli bütçe azaltılabilir. Bu ayrıntılar, örneğin, çeşitli üreticiler tarafından sağlanan hücre kültürü plastikleri ve ortamlarının seçimini içerir, çünkü bunun elde edilen kültürlerin özelliklerini etkilediği bulunmuştur10,11,12. Bu, kültür prosedürlerinin deneyimlerinin ve ayrıntılarının paylaşılmasının önemini vurgulamaktadır, çünkü bu tür içgörülerin yokluğunda, sonuçlar etkilenebilir ve / veya çeşitli laboratuvarlardaki doğrulama çabaları engellenebilir.
İnsan akciğer epiteli, bazal hücreler, siliye hücreler, kadeh hücreleri ve kulüp hücreleri gibi ana tipler de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerini içerir. Epitel hücre tabakasını in vitro hava yollarında güvenilir bir şekilde taklit etmek için, bu hücre tiplerinin kültür modellerinde temsil edilmesi ve polarizasyonlarının ve işlevlerinin 13,14,15,16 olarak korunması gerekir. Donör özelliklerinin (hastalık durumu dahil) ve hücrelerin anatomik kökeninin (yani nazal, trakeal, büyük ve küçük hava yolları) hücre kültürünün hücresel kompozisyonunu ve fonksiyonel yanıtlarını etkileyebileceğinin anlaşılması da aynı derecede önemlidir. İlgili uzmanlık ve uygulama, primer hava yolu epitel hücrelerini başarılı bir şekilde kültürlemek ve kültürün kalitesini hem sezgisel olarak (kültür sırasında görsel muayene yoluyla) hem de nicel olarak değerlendirmek için bir ön koşuldur. Bu katkının amacı, trakeal ve küçük hava yolu epitel hücrelerinin kültürüne de uygulanabilen primer insan bronşiyal epitel hücrelerinin (PBEC'ler) izolasyonu ve kültürü için maliyet ve zaman açısından etkili bir yöntem sağlamaktır. Bu tür hücrelerin rezeke edilmiş akciğer dokusundan izole edilmesine yönelik bir yöntemin tanımlanmasına ek olarak, genişleme ve biyobankacılık için bir yöntem ve son olarak makul bir maliyet ve zaman dilimi içinde iyi farklılaşmış bir ALI kültürünün kurulması ve karakterizasyonu için bir yöntem sunulmakta ve tartışılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>1.000 ohm test direnci</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td>EVOM2 Epitelyal Voltohmmetreyi kalibre etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>4 - [2- (5,6,7,8-Tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalinil) -benzoik asit (EC 23)</td> <td>Tocris</td><td>4011</td><td>cBD ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>6 kuyulu Şeffaf TC ile muamele edilmiş Çok Kuyulu Plakalar</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Bronşlardan izole edilen hücreleri büyütmek için ilk adımda kullanılır yüzük&nbsp;</td></tr><tr><td>Havayolu Epitel Hücre Büyüme Ortamı Kiti</td><td>PromoCell</td><td>C-21160</td><td>cBD ortamı ile karşılaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Boncuk Banyosu 20 Litre</td><td>Lab Armor</td><td>74220-720</td><td>Hücre kültürü çözeltilerini önceden ısıtmak için kullanılır</td></tr><tr><td>BEGM Bronşiyal Epitel Hücre Büyüme Ortamı BulletKit</td><td>LONZA</td><td>CC-3170</td><td>cBD ortamı ile karşılaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Sığır albümin fraksiyonu V (BSA)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260037</td><td>Kaplama çözeltisinde kullanılır</td></tr><tr><td>Sığır hipofiz özü (BPE)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>c-KSFM</td></tr><tr><td>Bronşiyal epitel hücre büyüme takviyesinde (BEpiCGS)</td> kullanılır<td>. ScienCell Research Laboratories</td><td>3262</td><td>cBD ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Bronşiyal epitel hücre ortamında kullanılır bazal (BEpiCM-b)</td> <td>ScienCell Araştırma Laboratuvarları</td><td>SCC3211-b</td><td>cBD ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Hücre kültürü ekleri; 0.4 ve mikro ile 12 mm Transwell; m gözenekli polyester membran eki</td><td>Corning</td><td>3460</td><td>Protokolde kullanılan hücre kültürü</td></tr><tr><td>ekleri Hücre kültürü ekleri; 12 oyuklu ekler, 0.4 & SABEU tarafından üretilen m PET şeffaf</td><td>CellQART</td><td>9310412</td><td>Corning hücre kültürü ekleri ile karşılaştırmak için kullanılan hücre</td></tr><tr><td>kültürü ekleri Hücre kültürü ekleri; 12 oyuklu ThinCert Doku kültürü Ekleri</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-032</td><td>Corning hücre kültürü ekleri ile karşılaştırmak için kullanılan hücre kültürü ekleri</td></tr><tr><td>CELLSTAR şişesi, TC, PS, 250 ml, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td>Hücre sayısını genişletmek için kullanılır</td></tr><tr><td>CFX Maestro 1.0</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>CFX384 Sistemi ile oluşturulan qPCR verilerini analiz etmek için yazılım programı</td></tr><tr><td>CFX384 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1855484</td><td>qPCR algılama sistemi</td></tr><tr><td>Çubuk elektrot seti Dünya</td><td>Hassas Aletler</td><td>STX2</td> ALI-PBEC CO2-İnkübatör <td>PHCbi'de elektrik direncini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td>Mikplazma serbest hücre kültürleri için kullanılan hücre kültürü inkübatörü</td></tr><tr><td>CO2-İnkübatör</td><td>Hereaus</td><td>Heracell 150</td><td>Muhtemelen mikplazma ile enfekte hücre kültürleri için kullanılan hücre kültürü inkübatörü</td></tr><tr><td>Coolcell Konteyner</td><td>Corning</td><td>432006</td><td>-80 °C'de hücreleri kriyoprezervasyon yapmak için kullanılır; Sıvıya aktarmadan önce C N2</td></tr><tr><td>Kontes 3 Otomatik hücre sayacı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>Hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Nalgene</td><td>479-3224</td> D-Glucose Avantor VWR BDH CHEMICALS 101174Y'deki <td>hücreleri kriyoprezerve etmek için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Yumuşak tripsin</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Avantor VWR</td><td>0231'de</td> <td>kullanılırHücre dondurma ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>dNTP (10 mM)</td> <td>Promega</td><td>U1515</td><td>cDNA sentezinde kullanılır</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) + 4500 mg / l D-Glikoz</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>36250</td><td>cBD ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM) l-glutamin</td><td>LONZA</td><td>LOBE12-604F</td> <td>ile 4.5 g / l glikozDiğer üreticilerin DMEM ile karşılaştırmak için cBD ortamında kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM), yüksek glikoz, piruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966029</td><td>Diğer üreticilerin DMEM ile karşılaştırmak için cBD ortamında kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü (EGF)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>c-KSFM'de kullanılır</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>443885J</td><td>Yumuşak tripsin</td></tr><tr><td>EVOM2 Epitelyal Voltohmmetre</td><td>Dünyasında kullanılır Hassas Aletler</td><td>91799</td> ALI-PBEC Fibronektin <td>çözeltisindeki elektrik direncini ölçmek için çubuk elektrot seti ile birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>, İnsan&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-43060</td><td>Kaplama solüsyonunda kullanılan</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>CBD ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0313</td><td>Proteaz XIV'ü çözmek için kullanılır;</td></tr><tr><td>IQ SYBR Green Super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170887</td><td>qPCR reaktifi</td></tr><tr><td>İzoproterenol hidroklorür, (-) -</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6504</td><td>c-KSFM</td></tr><tr><td>Keratinosit-SFM'de (KSFM)</td> kullanılır <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>c-KSFM</td></tr><tr><td>Maxwell RSC Cihazında</td> kullanılır <td>Promega</td><td>AS4500</td><td>Otomatik RNA izolasyon sistemi</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA Doku Kiti</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td>Maxwell RSC Cihazı M-MLV ile toplam RNA'yı izole etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Ters transkriptaz</td><td>Promega</td><td>M5301</td><td>cDNA sentezinde kullanılır</td></tr><tr><td>M-MLV Ters transkriptaz 5X reaksiyon tamponu</td><td>Promega</td><td>M531A</td><td>cDNA sentezinde kullanılır</td></tr><tr><td>MycoStrip</td><td>InvivoGen</td><td>rep-mys-10</td><td>Hücre kültürü örneklerinde mikoplazma varlığını tespit etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td>cBD ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Oligo (dT) 15 </td><td>Qiagen</td><td>79237</td><td>cDNA sentezinde kullanılır</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin çözeltisi (Pen / Strep)</td> <td>ScienCell Araştırma Laboratuvarları</td><td>SCC0513</td><td>c-KSFM ve cBD ortamında antibiyotik olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>LUMC eczane</td><td>N/A</td><td>Protokolün farklı aşamalarında kullanılır</td></tr><tr><td>Pneumacult-ALI Medium</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>05002</td><td>cBD ortamı ile karşılaştırmak için farklılaşma aşamasında hücreleri büyütmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Pneumacult-Ex Plus Medium</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>05040</td><td>cBD ortamı ile karşılaştırmak için batık aşamada hücreleri büyütmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B, ileri</td><td>Entegre DNA Teknolojiler</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: TCACCCAGGCTGGTTCAGA</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B, ters</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, ileri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: GGAGGGGACGTAAATCCCTA</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, ters</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC</td></tr><tr><td>Astar, MUC5AC, ileri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: CCTTCGACGGACAGAGCTAC</td></tr><tr><td>Primer, MUC5AC, ters</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: TCTCGGTGACAACACGAAAG</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, ileri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: GGGCTTTGACAAGAGAGT</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, ters</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: AGGATGGTCGTGTTGATGCG Primer</td></tr><tr><td>, RPL13A, ileri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG</td></tr><tr><td>Primer, RPL13A, ters</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, ileri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>Yok</td><td>Nükleotid dizisi: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, ters</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA</td></tr><tr><td>Primer, TP63, ileri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: CCACCTGGACGTATTCCACTG</td></tr><tr><td>Primer, TP63, ters</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>N/A</td><td>Nükleotid dizisi: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>c-KSFM ortamında bakteri, mikoplazma ve mantarlara karşı antimikrobiyal ajan olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Proteaz XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>Bronşiyal halka</td></tr><tr><td>RNAsin Rekombinant Ribonükleaz inhibitörünün</td> enzimatik tedavisi için kullanılır <td>Promega</td><td>N2515</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>Soya fasulyesi tripsin inhibitörünün sentezinde kullanılır ( SBTI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td> Yumuşak tripsin T100 Termal Döngüleyici Bio-Rad'ın <td>etkisini inhibe etmek için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td>1861096</td><td>cDNA sentezinde kullanılır</td></tr><tr><td>. DokuSAFE artı</td><td>MILESTONE MEDICAL</td><td>N/A</td><td>Biyolojik örnekler için vakum transfer sistemi</td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Canlı ve ölü hücreleri saymak için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsin 1:250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250-018</td><td>Yumuşak tripsin</td></tr><tr><td>Tip I kollajen çözeltisinde kullanılır (PureCol)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>Kaplama solüsyonunda kullanılır</td></tr><tr><td>Üniversal kap, PP, PE vidalı kapaklı</td><td>Avantor VWR</td><td>216-2053</td><td>Bronş halkasının Proteaz XIV tedavisi için protokolde kullanılır</td></tr></tbody></table>

bronşiyal epitel hücrelerinin biyobankacılık için rezeke akciğer dokusundan İzole edilmesi ve İyi diferansiye hava-sıvı arayüz kültürlerinin oluşturulması

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

Hava yolu epitel hücre tabakası, akciğer dokusu ile dış çevre arasındaki ilk bariyeri oluşturur ve böylece enfeksiyöz ajanlar ve hava kirleticileri de dahil olmak üzere sürekli olarak solunan maddelere maruz kalır. Hava yolu epitel tabakası çok çeşitli akut ve kronik akciğer hastalıklarında merkezi bir rol oynar ve bu epiteli hedef alan çeşitli tedaviler inhalasyon yoluyla uygulanır. Patogenezde epitelin rolünün ve tedavi için nasıl hedeflenebileceğinin anlaşılması sağlam ve temsili modeller gerektirir. İn vitro epitel kültürü modelleri giderek daha fazla kullanılmaktadır ve kontrollü bir ortamda deneyler yapmanın, hücreleri farklı uyaranlara, toksik maddelere veya enfeksiyöz ajanlara maruz bırakmanın avantajını sunmaktadır. Ölümsüzleştirilmiş veya tümör hücre hatları yerine birincil hücrelerin kullanılması, bu hücrelerin kültürde, hücre hatlarına kıyasla epitelin daha iyi bir temsili ile psödostratifiye polarize epitel hücre tabakasına farklılaşması avantajına sahiptir.
Burada, hava yolu epitel hücrelerinin akciğer dokusundan izolasyonu ve kültürü için son on yılda optimize edilmiş sağlam bir protokol sunulmaktadır. Bu prosedür, hava-sıvı arayüzünde (ALI) kültürlenerek primer bronşiyal epitel hücrelerinin (PBEC'ler) başarılı bir şekilde izole edilmesine, genişlemesine, kültürüne ve mukosiliyer farklılaşmasına izin verir ve biyobankacılık için bir protokol içerir. Ayrıca, bu kültürlerin hücreye özgü belirteç genleri kullanılarak karakterizasyonu tanımlanmıştır. Bu ALI-PBEC kültürleri, tüm sigara dumanına veya enflamatuar mediatörlere maruz kalma ve virüs veya bakterilerle ko-kültür / enfeksiyon dahil olmak üzere bir dizi uygulama için kullanılabilir. 
Bu makalede verilen ve prosedürü adım adım gösteren protokolün, bu tür kültür sistemlerini laboratuvarlarında uygulamak veya uyarlamak isteyenler için bir temel ve / veya referans sağlaması beklenmektedir.

Batık kültürü kullanarak genişletme Burada sunulan yöntemi kullanarak, sıvı azotta uzun süreli depolama için bir 6 delikli plakadan 400.000 hücre/kriyoviyal içeren ortalama sekiz kriyoyal elde edilebilir (Şekil 2A). Bunu başarmak için, izole PBEC'ler, mikrobiyal (özellikle mikoplazma) kontaminasyonu dışlamak için Primosin varlığında en az 7 gün ve en fazla 14 gün boyunca 6 kuyucuklu plakalarda kültürlenir (Şekil 2B). Şekil 2A, B, çeşitli donörlerden farklı izolasyonlar arasında elde edilen hücre sayıları ve gerekli kültür süresi hakkında fikir vermektedir. Hücreleri sıvı azotta depolanmak üzere tripsinizasyon yoluyla toplamadan önce, akıcılık% 80'in üzerinde olmalıdır. Bu 14 gün içinde sağlanamazsa, hücreler kriyoprezerve edilmemelidir. Önemli olarak, depolama ve geçiş için hasat yaparken, hücre tabakasının akıcılığı ~% 95'i geçmemelidir (Şekil 2C). Sıvı azotta depolandıktan sonra, hücreler ALI kültürleri için yeterli hücre sayısı elde edilene kadar genişleme için çözülebilir ve kültürlenebilir. Bu aşamada hücrelerin genişlemesi için kullanılan ortam, bronşiyal halka18'den hasadı takip eden ilk kültürde olduğu gibi c-KSFM'dir. Bununla birlikte, bu aşamada Primosin'e gerek yoktur, çünkü akciğer dokusundan kaynaklanan ek mikrobiyal kontaminasyon riski yoktur ve bu nedenle Primosin, penisilin / streptomisin için değiştirilebilir. Bu ortam, epitel hücrelerini fibroblastlara göre tercih eder ve bu nedenle fibroblastları daha hızlı çoğaltarak kültürün olası aşırı büyümesini önler 19,20,21. c-KSFM ortamı kullanılarak, hücreler şişeye yayılır ve birbirlerine bağlanmaz, bu da bu aşamada cBD ortamına batırılmış kültürlenmiş hücrelerin morfolojisinden belirgin şekilde farklıdır (Şekil 2D, E). Çözülmüş hücrelerin bir T75 şişesinde kültürlenmesinden 5 veya 6 gün sonra, hücre tabakası% 80 -% 95 oranında birleşik olmalıdır, bu da toplamda yaklaşık 3 x 106 hücreye karşılık gelir (Şekil 2F). Bundan, ALI kültürü için yaklaşık 75 kesici uç (12 delikli plaka boyutu) üretilebilir.
Bu katkıda açıklanan izolasyon ve kültür yöntemi, başlangıç materyali olarak bronşiyal biyopsiler veya bronşiyal fırçalarla kullanılmak üzere de uyarlanabilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig02.jpg"> Şekil 2: Kriyoprezervasyon öncesi ve sonrası bazal hücre genişlemesi. Hücreler tarif edilen protokole göre izole edildi ve c-KSFM kullanılarak kültürlendi. Donör başına üretilen hücre sayısı izlendi, canlı hücre sayımları otomatik bir hücre sayacı kullanılarak gerçekleştirildi (A) 6 kuyucuklu plakalardan geçiş 0 (P0) hücrelerini toplarken (protokolün 2. adımı), n = 123 donör, hücre sayısı kuyu başına toplanan hücre sayısı olarak sunuldu; Her nokta bir donörü temsil eder ve medyan yatay bir çubukla gösterilir. (B<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig02large.jpg" target="_blank"></a> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig06large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank"></a>

Burada, uzun süreli biyobankacılık için primer bronşiyal epitel hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesi ve hava-sıvı arayüzünde kültür yoluyla farklılaşmış epitel hücrelerinin üretilmesi için tekrarlanabilir, uygun fiyatlı ve sağlam bir yöntem sunulmaktadır.

Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

Bu protokol, hava yolu epitel hücrelerinin sağlık ve hastalıktaki işlevi ve rolü ile ilgili çeşitli araştırma sorularını ele almak için kullanılabilecek sağlam ve uygun maliyetli bir yöntem içindir. Bu tekniğin temel avantajı, mukus üretimi ve siliyer aktivite de dahil olmak üzere insan epitel hücre tabakasının iyi bir temsili olan bir hücre tabakası ile sonuçlanmasıdır. Bu teknik çok yönlüdür ve hastalıkla ilgili hakaretleri veya terapileri incelemek için kullanılabilir.Başlamak için, insan akciğer dokusundan izole edilen bronşiyal halkayı 10 mililitre steril PBS ile 10 santimetrelik bir Petri kabında durulayın. Halkayı cımbızla tutarken, fazla bağ dokusunu ve kan kalıntılarını çıkarmak için küçük makas kullanın. Halkayı ikiye bölün ve iki yarıyı kapalı steril bir kapta Primocin içeren HBSS'de 10 mililitre önceden ısıtılmış Proteaz 14 çözeltisine batırın.Bronşiyal halka parçalarını iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, parçaları 10 mililitre ılık PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve bükülmüş cımbız kullanarak, bir hücre çözeltisi elde etmek için halkanın içini kazıyın. Yüzüğü atın.Hücre çözeltisini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 50 mililitrelik son bir hacim elde etmek için ılık PBS ekleyin. Hücre çözeltisini santrifüj edin ve peleti 10 mililitre ılık PBS'de yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edin. PBS ile hacmi 50 mililitreye çıkarın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.Pelet, Primosin içeren ılık komple KSFM'de tekrar askıya alın. Daha sonra, kaplama çözeltisini altı delikli plakadan, kuyu başına iki mililitre hücre süspansiyonu ile değiştirin. % 80 ila% 90 akıcılığa ulaşılana kadar hücrelerin büyümesine izin verinaklılık, PBEC'lerin kriyoprezervasyonu için, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve hücreleri bir kez kuyu başına iki mililitre sıcak PBS ile yıkayın.Kuyu başına 500 mikrolitre yumuşak tripsin ekleyerek hücreleri deneyin ve 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin. Tripsin çözeltisini döndürün ve plakaya hafifçe dokunarak hücreleri serbest bırakın. Ayrılan hücreleri, soya fasulyesi tripsin inhibitörü içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Süspansiyonu santrifüj edin ve peleti penisilin ve streptomisin içeren 10 mililitre KSFM'de yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. Hücreleri otomatik bir hücre sayacında saydıktan sonra, hücreleri dondurucu bir ortamda mililitre başına 400.000 hücrelik bir konsantrasyona yeniden askıya alın ve bu süspansiyonun bir mililitresini bir kriyoviyal içine ekleyin. Şişeleri serin bir hücre kabına aktarın ve eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin.24 saat sonra, şişeleri uzun süreli depolama için eksi 196 santigrat derece sıvı azota aktarın. Bir T75 hücre kültürü şişesini kaplamak için, PBS'ye 10 mililitre kaplama çözeltisi ekleyin ve şişeyi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirmeden önce kapağı sıkıca kapatın. Ertesi gün, kaplama çözeltisini şişeden 10 mililitre tam KSFM ile değiştirin.İnkübatörün havaya girmesine izin vermek için ortamın inkübatörde hafifçe açılmış bir kapakla 37 santigrat dereceye kadar ısınmasına izin verin. Kriyokorunmuş PBEC'leri 37 santigrat derece boncuk banyosunda hızla çözün. Tüm içeriği kriyoviyal için önceden ısıtılmış T75 şişesine ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtın.Hücrelerin sıkıca bağlandığından emin olduktan sonra, ortamı 10 mililitre taze ve ılık tam KSFM ile değiştirin ve% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşana kadar büyütün. Kesici uç başına 400 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyerek hücre kültürü eklerini kaplayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İki mililitre yumuşak tripsin ekleyerek şişedeki PBEC'leri deneyin ve beş ila 10 dakika inkübe edin.Şişeyi döndürerek ve hafifçe hafifçe dokunarak hücre ayrılmasını kolaylaştırın. Daha sonra, şişeye dört mililitre soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin ve hücre süspansiyonunu 25 mililitrelik bir tüpe aktarın. Süspansiyonu santrifüj edin ve peletleri altı mililitre komple BD ortamında yeniden askıya alın.Otomatik hücre sayacındaki hücreleri sayın. Kaplamadan sonra, kaplama çözeltisini eklerden çıkarın. Hücre süspansiyonunu bir nanomol EC 23 ile desteklenmiş tam BD ortamı ile seyreltin ve eklerin zarının üstüne 500 mikrolitre ekleyin.Kesici ucun altındaki kuyucuğa 1,5 mililitre komple BD ortamı ekleyin. Hücreler Hava-Sıvı Arayüzüne veya ALI'ye aktarılmaya hazır olduğunda, ortamı eklerden ve kuyudan çıkarın ve sadece kuyuya 50 nanomolar EC 23 ile desteklenmiş yeni komple BD ortamı ekleyin. Kuyulardaki ortamı haftada üç kez değiştirin.Fazla mukus ve hücresel kalıntıları gidermek için, kesici ucun içindeki hücre tabakasının apikal tarafına yavaşça 200 mikrolitre ılık PBS ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, aşırı mukus ve hücresel enkaz içeren PBS'yi aspire edin. TEER, ALI PBEC kültürlerinin kalitesini değerlendirmek için ölçüldü.Yedi günde, hücre tabakasının 300 ohm'dan yüksek elektrik direnci başarılı bir kültür olarak kabul edilir. Ayrıca, elektriksel dirençteki donörler arası değişkenlik, Hava-Sıvı Arayüzündeki kültürün yedinci günü ile 14. günü arasında zamanla azalmıştır ve kullanılan DMEM'in kökeninden belirgin şekilde etkilenmiştir. Bazal, siliyer, kadeh ve kulüp hücreleri gibi tüm ana farklı hücre tipleri, 14 günlük ALI kültüründe gözlendi ve ekspresyon seviyeleri donöre bağımlıydı.Test edilen EC 23'ün farklı konsantrasyonları arasında, 50 nanomolar'da maksimum TEER gözlenmiştir. Retinoik asit ve sentetik analoğu EC 23'ün karşılaştırılması, siliyer ve kadeh hücreleri için belirteçlerin gen ekspresyonunun 50 nanomolar EC 23 ve retinoik asit arasında benzer olduğunu doğrulamaktadır. Farklı tedarikçilerden gelen ortamların kullanılması, hücresel bileşimde önemli farklılıklara neden olurken, TEER'deki farklılıklar daha az belirgindi.Öte yandan, farklı tedarikçilerden kesici uçların kullanılması, hücresel ayrışmada önemli farklılıklara neden olmamıştır. Ayrıca, ALI PBEC ve PneumaCult ortamının TEER değerlerinde ve hücresel bileşiminde tam BD ortamına kıyasla bir fark gözlenmiştir. Hücreler ALI'ye transfer olmaya hazır olduğunda, EC 23 konsantrasyonlarını arttırın.Ayrıca, çözüldükten sonra hücreleri santrifüj etmeyin ve SBTI ekledikten sonra hücreleri hücre kültürü plastiklerinden hızlı bir şekilde çıkarın. Hava yolu epitel hücrelerinin kültürlerini bu protokolde sağlanan şekilde kullanarak, örneğin hava yolu epitel hücrelerinin işlevine, gen ekspresyonuna, aracılık üretimine bakmak için çeşitli analiz yöntemleri kullanarak bunu takip edebilir ve böylece, örneğin, örneğin sigara dumanına maruz kalmanın sonuçları hakkında fikir edinebilirsiniz. Bu hücre kültürü protokolü için bir sonraki adım, bağışıklık hücreleri veya vasküler hücreler gibi ek hücre tiplerinin entegrasyonudur ve bu, doku temsilini arttırmaya yardımcı olacaktır.

isolating-bronchial-epithelial-cells-from-resected-lung-tissue-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada bir hava-sıvı arayüzü farklılaştırılmış büyüme de dahil olmak üzere insan bronşiyal solunum yolu doku eksplantlar birincil insan bronşiyal epitel hücreleri büyümek için detaylı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, insan akciğer sağlığı ve hastalıkları, solunum yolu epitel rolünü araştırmak için birincil hücreleri bol miktarda kaynak sağlar.

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Bu videoda, enfekte bronşiolar doku üzerinde ex vivo domuz akciğeri bakteriyel biyofilm modeli geliştirme protokolü açıklanmaktadır. Biyofilmler, bir yüzeye yapışık bir matris içine gömülü bakteri agregalarıdır. Bu model, biyofilm oluşumunun farklı aşamalarında bakterilerin antibiyotik duyarlılığını incelemek için kullanılır.

Ex vivo Domuz Akciğer Biyofilm Modeli: Domuz Bronşiolar Dokusu Üzerinde Bakteriyel Biyofilmleri İncelemek İçin Akciğer Modeli Geliştirme Tekniği

Bu makalede deneysel koşullar altında sığır bronkoskopik teknikler, yani bronkoskopik güdümlü aşılama, bronkoalveoler lavaj, bronş fırçalama ve transbronşiyal akciğer biyopsisi açıklanır.

Biyomedikal Araştırma Sığır Akciğer: Görme Kılavuzlu Bronkoskopi, intrabronşiyal Aşılama ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Örnekleme Teknikleri

Burada, biyolojik ve biyomedikal çalışmalarda 3D akciğer doku kültürleri modeli insan akciğer hastalıkları için oluşturmak için uygun özel dolu insan hassas kesim akciğer dilimleri rezeke hasta dokusundan hazırlanması için bir iletişim kuralı mevcut.

Hastalık modelleme için insan 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) nesil

Tanımlanan, toksisite testi için parçacıklara gerçekçi, tekrarlanan inhalasyon maruziyeti için bir in vitro bronş modelinin hücre kültürü ve maruz kalma yöntemidir.

Toksisite Testi için Havadaki Parçacıklara Gerçekçi, Tekrarlanan Soluma Maruziyeti için Hava Sıvısı Arayüzü Bronşiyal Epitel Modeli

Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Protokol, endojen epitelin sıçan trakeasından seçici olarak çıkarılmasına ve lümen yüzeyindeki eksojen hücrelerin homojen dağılımına izin veren, ardından hücre dokusu yapısının uzun süreli in vitro kültürüne izin veren görüntüleme özellikli bir biyoreaktörü tanımlar.

Biyomühendislik hava yolu dokusu üretmek için görüntüleme kılavuzlu biyoreaktör

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşma protokollerindeki son gelişmeler, organa özgü hücre tiplerinin kademeli olarak türetilmesine izin vermektedir. Burada, iPSC türevi hava yolu bazal hücrelerinin bakımı ve genişlemesi ve hava-sıvı arayüz kültürlerinde mukosiliyer bir epitel halinde farklılaşması için ayrıntılı adımlar sunuyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Hava-sıvı arayüz kültürü, akciğer hava yolunun apikal tarafını taklit eden primer normal insan bronşiyal epitel hücrelerini farklılaştırarak psödostratifiye hava yolu epiteli geliştirmek için yaygın olarak kullanılır. Burada, siliyer fonksiyon ve membran bütünlüğü gibi biyofiziksel özelliklerini izleyerek kalitesini belirlemek için kolay bir protokol açıklıyoruz.

Psödostratifiye Akciğer Hava Yolu Epitelinin Siliyer Fonksiyonunun ve Membran Geçirimsizliğinin Belirlenmesi

Bu makale, bir hava-sıvı arayüz kültüründe indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi akciğer epiteli, mezenşim, endotel hücreleri ve makrofajlardan oluşan karmaşık, çok hücreli bir hava yolu bariyer modelinin oluşturulmasını açıklamaktadır.

Akciğer Sağlığı ve Hastalığında Hava Yolu Bariyeri Bütünlüğünü Modellemek için iPSC'den Türetilmiş Epitelyal, Mezenkimal ve İmmün Hücre Ko-Kültürü

Öğrenin, insan akciğer dokusundan bronşiyal epitel hücrelerini izole etme ve hava-sıvı arayüzünde iyi diferansiye kültürler oluşturma yöntemini. Bu teknik, solunum sağlığı ve hastalık mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması (Video) | JoVE Journal

Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Daha fazla video keşfet