Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Bu yöntem, birden fazla numunenin hızlı bir şekilde analiz edilmesine izin verirken, hücrelerdeki floresan sinyallerinin uzamsal dağılımının ve miktarının analizine izin veren yüksek çözünürlüklü görüntüleri hızla üretebilir. Hücreler, gelişmiş görüntüleme akışı sitometri sistemi kullanılarak ölçülür, hız, hassasiyet ve ayrıntılı tek hücreli görüntüleri, akışlar optometrisi veya mikroskopi tarafından sağlanamayan benzersiz veriler veren uzamsal bilgilerle birleştirir. Önemli bir tavsiye, cihaz ayarlarını oluşturmak için yeterli hücre sağlamaktır ve ölçümleri için hücreleri yüksek yoğunlukta askıya alırız.

Bunun dışında veri toplama basittir ve geleneksel akış sitometrisine benzer. İlk önce makalede açıklandığı gibi DLBCL hücre çizgilerini oluşturun. Daha sonra DLBCL hücre kültürüne bir ila 1000 oranında 10 milimolar EdU çözeltisi ekleyin ve plakayı hafifçe sallayarak karıştırdıktan sonra üç saat boyunca plakayı% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçkadan sonra plakayı çıkarın ve 75 mikromolar'lık bir son konsantrasyona 100 milimolar klorokin çözeltisi ekleyin. Hafifçe sallayarak karıştırın ve 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından, 20 mikromolar'lık son konsantrasyona 20 milimolar C12 FDG çözeltisi ekleyin.

Nazik karıştırmadan sonra, plakayı daha önce gösterildiği gibi bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, FSA beta-gal boyamasını durdurmak için bir ila 50 arasında 100 milimolar 2-feniletil-beta-d-tiyogalaktosid çözeltisi ekleyin. Ve karıştırmak için plakayı yavaşça döndürün.

Hücreleri 15 mililitrelik steril santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 100 kez G'de döndürün. Süpernatant atıldıktan sonra, hücreleri dört mililitre PBS ile yıkayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 100 kez G'de santrifüj yapın. Daha sonra hücre peletlerini% 4 paraformaldehit fiksasyon çözeltisinde 500 mikrolitre içinde tekrar askıya alın.

Oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyondan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri iki kez dört mililitre PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 100 kez G'de santrifüj yapın. Yıkadıktan sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini 200 mikrolitre saponin geçirgenlik tamponunda tekrar askıya alın.

Şimdi süspansiyonu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez G'de toplayın. Daha sonra hücreleri 200 mikrolitre birincil antikor çözeltisinde tekrar askıya alın ve karanlıkta gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve 100 mikrolitre saponin yıkama çözeltisi ile yıkayın. Hücreleri iki kez yıkadıktan sonra, süpernatantı atın ve hücre peletlerini 500 mikrolitre EdU algılama kokteylinde tekrar askıya alın.

Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve bir mililitre saponin yıkama çözeltisi ile yıkayın. Yıkamayı iki kez tekrarlayın, süpernatantı atın ve hücre peletlerini 20 ila 50 mikrolitre PBS içinde tekrar askıya alın.

Cihazı açmadan önce, atık sıvı şişesini boşaltın ve SpeedBeads, sterilizatör, temizleyici, kabarcık çözücü seviyelerini kontrol edin ve yeterli sıvıları kılıflayın. Cihazı ve görüntüleme yazılımını açtıktan sonra, akışkanları ve sistem kalibrasyonunu başlatmak için başlangıç düğmesine tıklayın. Büyütmeyi 40 kata ayarlayın ve akışkan hızını düşük olarak ayarlayın.

Lazerleri açtıktan sonra, EdU Pacific Blue'yu ölçmek için 405 nanometrelik bir lazeri, C12-FDG'yi ölçmek için 488 nanometreyi ve Alexa-Fluor-647-gama-H2AX'i ölçmek için 642 nanometreyi açın. Dağılım kanalı için altı kanalı, parlak alan için birinci kanalı ve dokuzuncu kanalı ayarlayın. Ardından, lazerlerin yoğunluğunu ayarlamak için en yüksek floresana sahip olması beklenen numune ile başlayın ve karıştırmak için numune tüpünü yavaşça çevirin.

Tüp kapağını açtıktan sonra, numune tüpünü rıhtıma yerleştirin. Bir dağılım grafiğini başlatmak ve açmak için Yükle'ye tıklayın. Ardından, Özellikler alanını seçin, sırasıyla X ve Y eksenleri için MO1'in altını çizin ve en boy oranı MO1'in altını çizin.

Aşağıdaki ve sağ taraftaki çiftleri ve hücre toplamlarını ve sol taraftaki SpeedBead popülasyonunu hariç tutmak için 0,5 en boy oranının üzerinde bir kapı ayarlayın. Şimdi, Histogram Grafiği'ni açın ve X ekseni için bir maskenin ve kanal birin unsur gradyan kökü ortalama karesini seçin. Tekli popülasyonu seçin ve odaklanmış hücreler için seçilecek kapıyı ayarlayın.

Bir histogram grafiği açın ve X ekseni kanal iki, yedi ve 11 için ham maksimum piksel yoğunluklarını seçin. Ardından, sırasıyla kanal iki, yedi ve 11 için 488 nanometre, 405 nanometre ve 642 nanometre lazerlerin lazer güçlerini ayarlayın, böylece her florokromun aşırı doygunluğu önlemek için 100 ila 4.000 arasında ham maksimum piksel değeri vardır. Kaydedilecek odaklanmış popülasyonu seçin ve DLBCL örneklerini tutarlı ayarlarla ölçmek için Al'a tıklayın.

Numuneleri ölçüm için değiştirirken, numune tüpünü kurtarmak için geri dön'e tıklayın. Örneği atmak için Yükle'ye basın. Tüm numuneler ölçüldükten sonra, parlak alan ve saçılma lazerini kapatın.

Bir ücret matrisi oluşturmak için tek renk kontrol örneklerini ölçün. Görüntüleme sistemini kapatmak için Kapat'a tıklayın. Görüntü analiz yazılımındaki verileri analiz edin.

Nükleer gama H2AX odaklarını ve canlı hücre görüntülerini otomatik olarak saymak ve ölçmek için görüntü analiz yazılımının Spot Sihirbazı aracını kullanın. Nokta Sihirbazı'nı daha fazla otomatik nokta sayımı analizi için eğitmek üzere biri yüksek, diğeri düşük nokta sayısına sahip iki hücre popülasyonu seçin. Tek hücreli görüntülerde akım sitometri yönteminde artmış C12-FDG pozitif, EdU negatif, gama H2AX pozitif, yaşlanmış popülasyon ve KARPAS422 görüldü.

WSU-DLCL2 ve OCI-LY1 hücreleri, ancak SU-DHL6 hücrelerinde değil. Görüntüleme tabanlı analiz, SU-DHL6 hücrelerinde değil, önemli ölçüde daha yüksek sayıda gama H2AX odağı ve KARPAS422, WSU-DLCL2 ve OCI-LY1 sundu. Benzer sonuçlar frekans ve niceleme verileri ile temsil edildi.

Hücre süspansiyonuna saponin eklenmesi çok önemlidir, aksi takdirde antikorlar hücre iç antijenlerine ulaşamaz ve sert deterjanlar C12-FTG sinyalinin kaybına neden olur Görüntüleme sitometrisi, belirli uyaranlara yanıt olarak bir transkripsiyon faktörünün çekirdeğe translokasyonu gibi belirteç lokalizasyonundaki değişiklikleri analiz etmek için idealdir. Böyle bir analiz protokolümüzle de sağlanabilir. Bu yöntem, bireysel sinyallerin varlığını, yoğunluğunu ve lokalizasyonunu tespit etmeye yardımcı olan tek hücre seviyesinde çoklu floresan belirteçlerin görselleştirilmesine izin verir.