Name: Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Keşfedin, çok katmanlı biyolojik örnekleri tek katmana ayıran peel-blot tekniği ile kriyojenik elektron mikroskobisi numune hazırlama yöntemini. Bu yöntem, görüntü kalitesini artırır ve veri toplama verimliliğini yükseltir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmanın bir kısmı NIH hibesi HL090630 (ISK) tarafından desteklenmiştir.

1. Peel-blot tekniği için hazırlık adımları
NOT: Hazırlık, aşağıdaki öğelerin birbirine bitişik olarak yerleştirilmesini gerektirir.
<ol><li>İki parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı istifleyin (bkz.</li>
	<li>Filtre kağıdının bitişiğine, kağıt yukarı bakacak şekilde ~8 cm x 10 cm uzunluğunda bir parafin film yerleştirin.</li>
	<li>İki adet #4 filtre kağıdının üzerine bir parça mikron altı filtre kağıdı yerleştirin (Şekil 1-1).</li>
	<li>Anti-kılcal forsepsleri, bükülmüş bacak yukarı bakacak ve düz bacak aşağı bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, pürüzsüz/parlak tarafı yukarı bakacak şekilde 600 mesh ızgara seçin. Forsepsleri, temiz ızgaranın diğer öğelerle temasını önlemek için bir Petri kabına veya başka bir yükseltilmiş yüzeye yerleştirin.</li>
	<li>Kağıdı parafin filmden çıkarın ve küçük bir jant oluşturmak için kenarları (~ 5 mm) çekin. Pipet, parafin filmin kısa bir tarafından ~1-2 cm ve parafin filminde ~1 cm arayla% 4 trehaloz çözeltisinin iki 150 μL damlasıdır.</li>
	<li>Ayrı bir tezgahta veya zeminde, küçük bir polistiren köpük kaba sıvı azot dökün (bkz. DİKKAT: Donma ısırmasını önlemek için eldiven ve yüz siperliği kullanarak doğru kullanım için eğitim alın.</li>
	<li>Sıvı azotun içine küçük bir kriyo-EM ızgara kabı yerleştirin ve polistiren köpük kabı tüy bırakmayan mendillerle örtün.</li>
</ol>2. Karbon filmin ızgaraya yerleştirilmesi
<ol><li>Trehaloz çözeltisinin damlalarından birinde mikanın bir tarafına aşağı doğru hafif bir açıyla (~ 20 ° -40 °) dokunarak karbon filmini mikadan yüzdürmek için Dumont #5 forseps kullanın (bkz. Karbon film damlacığın yüzeyinde yüzdükten sonra mikayı serbest bırakın.</li>
	<li>Kırık şeklinde hasarlı karbon kullanmaktan kaçınmak için karbon filmi görsel olarak inceleyin.</li>
	<li>Anti-kılcal forseps tarafından bir açıyla (~ 20 ° -30 °) tutulan ızgarayı, karbon filme bitişik bir konumda bir trehaloz damlasına yerleştirin ve ardından karbon filmin altında ortalayın. Karbon filmi alın (Şekil 1-2).</li>
	<li>Izgarayı aynı yönde tutun ve ızgaranın kenarını kaba tarafa sarmış olabilecek gereksiz karbon filmi çıkarmak için damlanın yüzey gerilimini kırmadan ikinci trehaloz damlasının yüzeyine yavaşça indirin.</li>
</ol>3. Çok katmanlı 2D kristallerin tek katmanlara ayrılması
<ol><li>Anti-kılcal forsepsleri döndürün (bakınız Malzeme Tablosu) ve ızgaranın karbon tarafı aşağı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1-3).</li>
	<li>Pipetten 1.3 μL'lik numune ızgaranın üstündeki hafif trehaloz menisküsün içine alınır. Trehaloz ve numuneyi ızgaranın her iki tarafına karıştırmak ve dağıtmak için çözeltiyi ~ 8-10 kez pipetleyin.</li>
	<li>Çözeltiyi 1 dakika boyunca inkübe ederken, pipet parafin filmine bir veya daha fazla 1.7 μL trehaloz çözeltisi damlatın.</li>
	<li>Karbon filmi yukarı bakacak şekilde ızgarayı orijinal konumuna geri döndürün.</li>
	<li>Izgarayı mikron altı filtre kağıdına bastırmak için kılcal forseps kullanın (Şekil 1-4). Çözelti filtre kağıdı tarafından emildikten ve karbon film düz durduğunda, ızgarayı kaldırmadan ve dikey olarak 1.7 μL trehaloz çözeltisi damlasına hareket ettirmeden önce 3 saniye bekleyin (Şekil 1-5). NOT: Yüksek oranda yığılmış numuneler için bu adımı birden çok kez yineleyin veya sonraki adımlarda kılavuz vitrifikasyon için hazırlanır.</li>
	<li>Izgarayı iki filtre kağıdı parçası üzerine dökün ve ardından ızgarayı filtre kağıdından kaldırın (Şekil 1-6). Yaklaşık 13 sn sonra, neme ve numune tamponuna bağlı olarak, ızgarayı küçük strafor kaptaki sıvı azota daldırın ve ızgarayı kriyo-EM ızgara kabına yerleştirin veya kriyo-EM taraması veya veri toplama için doğrudan aktarın. NOT: Protokolü hızlı bir şekilde optimize etmek için, soyulmuş lekeli ızgarayı sıvı azota batırmak yerine bu adımda negatif olarak lekeleyin. Izgaraya 3 μL% 1 uranil asetat uygulayarak numuneyi negatif olarak lekeleyin, ızgarayı 30 s boyunca inkübe edin ve yırtık bir parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı ile lekeleyin. Trehaloz, tanen veya glikozda vitrifiye edilen 2D kristallerin ızgaraları, trehaloz, tanen ve glikoz, elle daldırma2 için kullanılan oranlarda kristalin buz oluşumunu önlediğinden, vitrifikasyon için rutin olarak elle daldırılır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Soyma lekesi, kriyo-EM veri toplama ve görüntü işleme için çok katmanlı 2D kristallerin ve benzeri numunelerin istiflenmesinin ve kalınlığının üstesinden gelmek için güçlü bir yöntemdir. Soyma lekesinin kullanımına ilişkin bir karar, numunenin biyolojik parametrelerine dayanacak ve ayrıca bir 3D kriyo-EM modeli mevcut olduğunda değerlendirme gerektirecektir. Temaslıların biyolojik önemi ve temas bölgelerinin potansiyel esnekliği bu değerlendirmede özellikle önemli olacaktır.
Soyulma lekelerini...

Soyma lekesi tekniği, kriyo-EM 2D ve 3D veri toplama için uygun derecede ince numuneler elde etmek ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için istiflenmiş iki boyutlu membran proteinleri kristallerini tek katmanlara ayırmak için geliştirilmiştir1. Protokol, diğer çok katmanlı numune tipleri için ve ayrıca Z'deki kalınlığı arttırmadan ızgarada her iki numune tipinin de yüksek numune konsantrasyonlarına ulaşmak için benzer şekilde uygundur.
Numune katmanlarının bir katmana indirgenmesi, kılcal basınç ve kesme kuvvetlerinin bir kombinasyonunun, geri enjeksiyon yöntemi2'yi önemli ölçüde genişleten ve değiştiren bir protokolde uygulanmasıyla elde edilir. İlk lekeleme adımı, geri enjeksiyon yöntemindeki 20-25μm filtre kağıdı gözenek boyutu yerine mikron altı üzerinde lekeleme sırasında sıkı sandviçleme ve karbon filme ve çok katmanlı numunenin her iki tarafında bir ızgara çubuğuna yapışma ile sonuçlanır. Tek bir tabakanın ayrılması veya soyulması, ızgara bir trehaloz damlasına dikey olarak bastırıldıktan sonra sandviçlenmiş tabakaların ayrılmasının zorlanması üzerine gerçekleşir ve karbon filmi ızgara çubuğundan uzaklaştırır (Şekil 1). Karbon filmin ızgara çubuğu ile orijinal temas noktasından uzağa yeniden konumlandırılması, ızgara bir kez daha mikron altı filtre kağıdı üzerinde lekelendiğinde bir sonraki adımda gerçekleşir. Bu adımların yineleme sayısı belirli örnekler için en iyi duruma getirilebilir. Ayrıca, protokol, Z'de agregasyondan kaçınırken numune konsantrasyonlarını arttırmak için kullanılabilir. ızgara çubuğuna ve karbon filme yapışmanın yanı sıra güçlü ayırmaya bağlı olması nedeniyle, bu yaklaşım bazı hassas ve / veya kararsız proteinler ve protein kompleksleri gibi oldukça kırılgan moleküller için uygun olmayabilir.
Soyma lekesi tekniği ne özel ekipman ne de pahalı malzemeler gerektirir. Bununla birlikte, belirli numunelere uygulanabilirlik, biyolojik parametrelerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirecektir. Düzlüğü sağlamak için karbon filmi gerektiğinden, 2D kristaller için karar daha kolaydır, ancak soyma-leke tekniği ile manipülasyon, numunenin biyolojik bütünlüğünü veya kristalin sırasını etkileyebilir. Soyulma lekesi tekniğinin tek parçacıklara uygunluğu, karbon film gerektiren ve manipülasyona kararlı olanlarla sınırlıdır ve bunlar için test edilebilir. Katmanlar arasında kritik biyolojik etkileşime sahip örnekler, bu tür etkileşimlerin bozulması nedeniyle soyma-leke tekniği yardımıyla karakterizasyon için uygun olmayabilir.
Soyma-leke tekniği ("soyma-leke"), oda sıcaklığında TEM tarafından negatif lekeli veya lekesiz numunelerle test edilerek ve taranarak en hızlı şekilde optimize edilir. Optimum sayıda soyulma-leke yinelemesi belirlendikten sonra, vitrifikasyondan önce kalınlığı kontrol etme süresi belirlenebilir.

<table><tbody><tr><td>600 gözenekli ızgaralar</td><td>SPI</td><td>2060-C-XA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-kılcal forseps</td><td>Ted Pella</td><td>510-5</td><td></td></tr><tr><td>Mika</td><td></td><td></td><td></td>kaplamak için</tr><tr><td>karbon Cryo-EM</td><td></td><td></td><td>Cryo-EM ızgaraları 120 kV veya 200 kV'da taranabilir. Yüksek çözünürlüklü veriler 300 kV'da toplanır.</td></tr><tr><td>Dumpont #5 forseps</td><td>Ted Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-EM depolama için ızgara kutusu</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Kim Mendil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mika</td><td>Ted Pella</td><td>56</td><td>Mika karbon kaplıdır ve bir TEM ızgarasından çok daha büyük kareler halinde kesilir. Karbon kalınlığı, birden fazla soyma lekesi üzerinde kolayca kırılan ince karbonu önlemek için optimizasyon gerektirebilir.</td></tr><tr><td>Negatif leke</td><td></td><td></td><td>%1-2 uranil asetat birçok numune için uygundur. Fosfotungstik asit gibi diğer lekeler ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polistiren kap</td><td></td><td></td><td>Soyma-leke ızgarasını vitrifiye etmek için kullanılır. Polistiren bir nakliye konteyneri bu amaç için geri dönüştürülebilir ve alüminyum folyo ile kaplanabilir.</td></tr><tr><td>Mikron altı filtre kağıdı</td><td>MilliporeSigma</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>80-120 kV'luk bir hızlanma geriliminde çalıştırılan herhangi bir TEM, negatif lekeli ızgaraların taranması için uygun olacaktır.</td></tr><tr><td>Trehaloz</td><td></td><td></td><td>% 4 trehaloz çözeltisi hazırlayın.</td></tr><tr><td>Whatman #4 filtre kağıdı</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1004150</td><td>Bu, 20-25 &mu'ya karşılık gelir; Protokolde m gözenek boyutu filtre kağıdı.</td></tr></tbody></table>

peel-blot tekniği: tek katmanları Çok katmanlı veya konsantre biyolojik numunelerden ayırmak için bir cryo-em numune hazırlama yöntemi

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Soyulmuş leke kriyo-EM ızgara hazırlama tekniği, çok katmanlı numunelerin katmanlarında bir azalma sağlamak amacıyla önemli ölçüde modifiye edilmiş bir geri enjeksiyon yöntemidir. Dalma donmasından önce katmanların bu şekilde çıkarılması, numune kalınlığının kriyo-EM veri toplama için uygun bir seviyeye düşürülmesine, numune düzlüğünün iyileştirilmesine ve görüntü işlemenin kolaylaştırılmasına yardımcı olabilir. Soyma lekesi tekniği, çok katmanlı membranların tek katmanlara, katmanlı 2D kristallerin tek kristallere ve çözünür proteinlerin istiflenmiş, tabaka benzeri yapılarının da aynı şekilde tek katmanlara ayrılmasına izin verir. Bu tür numunelerin yüksek numune kalınlığı, özellikle mikroskop aşamasının veri toplama için eğilmesi gerektiğinde, kriyo-EM veri toplama ve kriyo-EM görüntü işleme için sıklıkla aşılmaz sorunlar ortaya çıkarmaktadır. Ayrıca, bu numunelerden herhangi birinin yüksek konsantrasyonlu ızgaraları, ızgara hazırlamadan önce numune konsantrasyonu artırılabildiğinden ve soyma lekesi tekniği, tek katmanlı numunenin yoğun bir dağılımına neden olacak şekilde ayarlanabildiğinden, verimli veri toplama için hazırlanabilir.

Başarılı bir soyma lekesi deneyi, genellikle yüksek konsantrasyonlarda tek bir numune katmanı ile sonuçlanacaktır. Çoğu ızgara karesindeki bazı bölgelerin, özellikle soyulma lekesi adımlarının daha az sayıda yinelemesinde, hala birden fazla katman içermesi beklenir. Bununla birlikte, ızgara karelerinin çoğunluğu, insan lökotrienC4 sentazının (Şekil 2) ve lipozomların (adım 3.2, Şekil 3'te eklenmiştir) 2D kristalleri için gözlemlendiği gibi, tek katman...

Soyma-leke tekniği, kalınlığı azaltmak, numune konsantrasyonunu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik numunelerin tek katmanlara ayrılmasını sağlayan bir kriyo-EM ızgara hazırlama yöntemidir.

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Soyma lekesi tekniği, kalınlığı azaltmak, konsantrasyonu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik kriyo-EM numunelerinin tek katmanlara ayrılmasını sağlar. Izgara hazırlamadan önce numune konsantrasyonları arttırılabilir ve soyma lekesi, yüksek verimli veri toplama için tek katmanlı numunelerin yoğun bir dağılımına neden olacak şekilde ayarlanabilir. Başlamak için, iki parça 20-25 mikrometre gözenek boyutunda filtre kağıdı istifleyin ve kağıt yukarı bakacak şekilde bitişik uzun bir parafin film yerleştirin.İki ek filtre kağıdının üzerine bir parça mikron altı filtre kağıdı yerleştirin. Kılcal olmayan forsepsleri, bükülmüş bacak yukarı bakacak ve düz bacak aşağı bakacak şekilde konumlandırın ve pürüzsüz veya parlak tarafı yukarı bakacak şekilde 600 örgülü bir ızgara seçin. Forsepsleri, temiz ızgaranın diğer öğelerle temasını önlemek için bir Petri kabına veya başka bir yükseltilmiş yüzeye yerleştirin.Kağıdı parafin filmden çıkarın ve küçük bir jant oluşturmak için kenarları çekin. Pipet iki 150 mikrolitre düşer, böylece parafin filmin kısa bir tarafından yaklaşık bir ila iki santimetrede% 4 trehaloz çözeltisi. İki damla yaklaşık bir santimetre uzakta olmalıdır.Daha sonra, ayrı bir tezgahta veya zeminde, sıvı azotu küçük bir polistiren köpük kaba dökün ve sıvı azotun içine küçük bir kriyo-EM ızgara kabı yerleştirin. Polistiren köpük kabı tüy bırakmayan mendillerle örtün. Karbon filmi mikadan yüzdürmek için, Dumont 5 Forseps kullanın ve mikanın bir tarafına, trehaloz çözeltisinin damlalarından birinde aşağı doğru hafif bir açıyla dokunun.Su geriliminin karbon filmini yavaşça kaldırmasına izin vermek için mikayı aşağı doğru hareket ettirin. Karbon film damlacığın yüzeyinde yüzdükten sonra mikayı serbest bırakın. Kırık şeklinde hasarlı karbon kullanmaktan kaçınmak için karbon filmi görsel olarak inceleyin.Anti-kılcal forseps tarafından 20-30 derecelik bir açıyla tutulan ızgarayı, bitişik bir konumda bir trehaloz damlasına yerleştirin ve ardından ızgarayı karbon filmin altına ortalayın. Karbon filmi alın, ızgarayı aynı yönde tutun ve ızgarayı damlanın yüzey gerilimini kırmadan ikinci trehaloz damlasının yüzeyine yavaşça indirin. Bu, ızgaranın kenarının etrafına kaba tarafa sarılmış olabilecek gereksiz karbon filmi kaldıracaktır.Anti-kılcal forsepsleri döndürün ve ızgaranın karbon tarafı aşağı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin. Pipetten 1.3 mikrolitre numune alınarak ızgara üstü hafif trehaloz menisküs içine alınır. Daha sonra, trehalozu ve numuneyi ızgaranın her iki tarafına karıştırmak ve dağıtmak için çözeltiyi yaklaşık 8-10 kez pipetleyin.Bir veya daha fazla 1.7 mikrolitre trehaloz çözeltisini parafin filmine damlatarak, numune trehaloz çözeltisini ızgarada bir dakika boyunca inkübe edin. Karbon filmi yukarı bakacak şekilde ızgarayı orijinal konumuna geri döndürün ve kılcal önleyici forsepsleri kullanarak ızgarayı mikron altı filtre kağıdına bastırın. Çözelti filtre kağıdı tarafından emildikten ve karbon film düz durduğunda, ızgarayı kaldırmadan ve dikey olarak 1.7 mikrolitrelik trehaloz çözeltisi damlasına hareket ettirmeden önce üç saniye bekleyin.Bu adımlar, örneğe bağlı olarak bir ila üç yineleme veya daha fazlası arasında tekrarlanabilir. Izgarayı iki filtre kağıdı parçası üzerine dökün ve ardından ızgarayı filtre kağıdından kaldırın. Yaklaşık 13 saniye sonra, neme ve numune tamponuna bağlı olarak, ızgarayı küçük strafor kaptaki sıvı azota daldırın ve kriyo-EM ızgara kabına yerleştirin veya kriyo-EM taraması veya veri toplama için doğrudan aktarın.Soyma-leke yöntemine tabi tutulan insan lökotrien C4 sentazının 2D kristal örneği burada gösterilmiştir. Okun solundaki bölge, karbon film ile soyulmuş lekelenmiş ve daha sonra kaydırılmış ızgara çubuğu arasındaki bir temas bölgesinde büyük ölçüde tek katmanlı 2D kristallere indirgenmiştir. Okun sağındaki bölge soyulma lekesinden etkilenmedi.Görüntünün alt yarısı, soyulma lekesinin uygulanmasından kaynaklanan büyük, çoğunlukla tek katmanlı fosfo lipid çift katmanlı bölgeleri temsil eder. Üst yarı, ızgara çubuğu ile karbon filmi arasında bir temas bölgesinde değildi ve bu nedenle iki fosfolipid çift katmanlı tam lipozomlar içeriyordu. 400 mesh ızgaranın ızgara karesi, ızgara çubuğunun ayak izini ve bunun sonucunda ortaya çıkan soyulmuş lekelenmiş bölgelerin yanı sıra bir ızgara çubuğuyla temas etmeyen veya daha az soyulma lekesi yinelemesine maruz kalan bölgeleri gösterir.Bu görüntüler, çok ince karbon film kullanılarak mikron altı bir filtre kağıdı üzerine arka enjeksiyonla hazırlanan bir EM ızgarasının lekelenmesini gösterdi. Görüntüler, membranla ilk temasta, temastan 1.000 milisaniye sonra ve temastan 2.000 milisaniye sonra tek karelerdir. Ok, kılcal basıncın karbon filmi yırttığı ızgara karelerini gösterir.Karbon filmindeki kırılmaları önlemek ve mikron altı filtre kağıdını emişe 1,7 mikrolitrelik trehaloz damlası ile birleştirmek ve daha sonra katmanları ayırmak önemli adımlardır. Soyulmuş lekelenmiş numuneler, yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri toplama için kullanılır, ardından yapı belirleme için görüntü işleme yapılır. Soyulma lekesi, daha önce kriyo-EM için çok kalın olan tek katmanlı protein 2D kristallerinin yapısal olarak belirlenmesine izin verir.Ayrıca, çeşitli numuneleri karbon film üzerinde tek katmanlara yoğunlaştırabilir.

the-peel-blot-technique-cryo-em-sample-preparation-method-to-separate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yerli yakın eyalette bakteri hücrelerinin ultrastrüktür çalışma elektron cryotomography (EKT) nasıl kullanılacağı "makromoleküler" (~ 4 nm) çözünürlük, burada göstermektedir.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Burada donarak kırılmış bitki dokularını incelemek için bir prosedürü açıklıyoruz. Yüksek basınçlı donmuş yaprak numuneleri, dondurularak kırılır ve çift katmanlı kaplanır, bu da minimum ışın hasarı ile yüksek büyütmelerde kriyo-taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenen iyi korunmuş donmuş hidratlı numuneler verir.

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.

Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi

Bu yöntem, in situ hücresel kriyotomografi ve korelasyon ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için elektron mikroskobu (EM) ızgaralarının hazırlanması için erişilebilir ve esnek bir protokol sağlar.

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

Burada, elektron mikroskobu ızgaralarına tek bir tek katmanlı grafen uygulamak için bir protokol ve bunların kriyoEM yapı belirlemede kullanılmak üzere nasıl hazırlanacağını açıklıyoruz.

Kriyoelektron mikroskobu için tek katmanlı grafen kaplı ızgaraların imalatı

Keşfedin, çok katmanlı biyolojik örnekleri tek katmana ayıran peel-blot tekniği ile kriyojenik elektron mikroskobisi numune hazırlama yöntemini. Bu yöntem, görüntü kalitesini artırır ve veri toplama verimliliğini yükseltir.

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi (Video) | JoVE Journal

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

Daha fazla video keşfet