Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

Soyma lekesi tekniği, kalınlığı azaltmak, konsantrasyonu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik kriyo-EM numunelerinin tek katmanlara ayrılmasını sağlar. Izgara hazırlamadan önce numune konsantrasyonları arttırılabilir ve soyma lekesi, yüksek verimli veri toplama için tek katmanlı numunelerin yoğun bir dağılımına neden olacak şekilde ayarlanabilir. Başlamak için, iki parça 20-25 mikrometre gözenek boyutunda filtre kağıdı istifleyin ve kağıt yukarı bakacak şekilde bitişik uzun bir parafin film yerleştirin.

İki ek filtre kağıdının üzerine bir parça mikron altı filtre kağıdı yerleştirin. Kılcal olmayan forsepsleri, bükülmüş bacak yukarı bakacak ve düz bacak aşağı bakacak şekilde konumlandırın ve pürüzsüz veya parlak tarafı yukarı bakacak şekilde 600 örgülü bir ızgara seçin. Forsepsleri, temiz ızgaranın diğer öğelerle temasını önlemek için bir Petri kabına veya başka bir yükseltilmiş yüzeye yerleştirin.

Kağıdı parafin filmden çıkarın ve küçük bir jant oluşturmak için kenarları çekin. Pipet iki 150 mikrolitre düşer, böylece parafin filmin kısa bir tarafından yaklaşık bir ila iki santimetrede% 4 trehaloz çözeltisi. İki damla yaklaşık bir santimetre uzakta olmalıdır.

Daha sonra, ayrı bir tezgahta veya zeminde, sıvı azotu küçük bir polistiren köpük kaba dökün ve sıvı azotun içine küçük bir kriyo-EM ızgara kabı yerleştirin. Polistiren köpük kabı tüy bırakmayan mendillerle örtün. Karbon filmi mikadan yüzdürmek için, Dumont 5 Forseps kullanın ve mikanın bir tarafına, trehaloz çözeltisinin damlalarından birinde aşağı doğru hafif bir açıyla dokunun.

Su geriliminin karbon filmini yavaşça kaldırmasına izin vermek için mikayı aşağı doğru hareket ettirin. Karbon film damlacığın yüzeyinde yüzdükten sonra mikayı serbest bırakın. Kırık şeklinde hasarlı karbon kullanmaktan kaçınmak için karbon filmi görsel olarak inceleyin.

Anti-kılcal forseps tarafından 20-30 derecelik bir açıyla tutulan ızgarayı, bitişik bir konumda bir trehaloz damlasına yerleştirin ve ardından ızgarayı karbon filmin altına ortalayın. Karbon filmi alın, ızgarayı aynı yönde tutun ve ızgarayı damlanın yüzey gerilimini kırmadan ikinci trehaloz damlasının yüzeyine yavaşça indirin. Bu, ızgaranın kenarının etrafına kaba tarafa sarılmış olabilecek gereksiz karbon filmi kaldıracaktır.

Anti-kılcal forsepsleri döndürün ve ızgaranın karbon tarafı aşağı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin. Pipetten 1.3 mikrolitre numune alınarak ızgara üstü hafif trehaloz menisküs içine alınır. Daha sonra, trehalozu ve numuneyi ızgaranın her iki tarafına karıştırmak ve dağıtmak için çözeltiyi yaklaşık 8-10 kez pipetleyin.

Bir veya daha fazla 1.7 mikrolitre trehaloz çözeltisini parafin filmine damlatarak, numune trehaloz çözeltisini ızgarada bir dakika boyunca inkübe edin. Karbon filmi yukarı bakacak şekilde ızgarayı orijinal konumuna geri döndürün ve kılcal önleyici forsepsleri kullanarak ızgarayı mikron altı filtre kağıdına bastırın. Çözelti filtre kağıdı tarafından emildikten ve karbon film düz durduğunda, ızgarayı kaldırmadan ve dikey olarak 1.7 mikrolitrelik trehaloz çözeltisi damlasına hareket ettirmeden önce üç saniye bekleyin.

Bu adımlar, örneğe bağlı olarak bir ila üç yineleme veya daha fazlası arasında tekrarlanabilir. Izgarayı iki filtre kağıdı parçası üzerine dökün ve ardından ızgarayı filtre kağıdından kaldırın. Yaklaşık 13 saniye sonra, neme ve numune tamponuna bağlı olarak, ızgarayı küçük strafor kaptaki sıvı azota daldırın ve kriyo-EM ızgara kabına yerleştirin veya kriyo-EM taraması veya veri toplama için doğrudan aktarın.

Soyma-leke yöntemine tabi tutulan insan lökotrien C4 sentazının 2D kristal örneği burada gösterilmiştir. Okun solundaki bölge, karbon film ile soyulmuş lekelenmiş ve daha sonra kaydırılmış ızgara çubuğu arasındaki bir temas bölgesinde büyük ölçüde tek katmanlı 2D kristallere indirgenmiştir. Okun sağındaki bölge soyulma lekesinden etkilenmedi.

Görüntünün alt yarısı, soyulma lekesinin uygulanmasından kaynaklanan büyük, çoğunlukla tek katmanlı fosfo lipid çift katmanlı bölgeleri temsil eder. Üst yarı, ızgara çubuğu ile karbon filmi arasında bir temas bölgesinde değildi ve bu nedenle iki fosfolipid çift katmanlı tam lipozomlar içeriyordu. 400 mesh ızgaranın ızgara karesi, ızgara çubuğunun ayak izini ve bunun sonucunda ortaya çıkan soyulmuş lekelenmiş bölgelerin yanı sıra bir ızgara çubuğuyla temas etmeyen veya daha az soyulma lekesi yinelemesine maruz kalan bölgeleri gösterir.

Bu görüntüler, çok ince karbon film kullanılarak mikron altı bir filtre kağıdı üzerine arka enjeksiyonla hazırlanan bir EM ızgarasının lekelenmesini gösterdi. Görüntüler, membranla ilk temasta, temastan 1.000 milisaniye sonra ve temastan 2.000 milisaniye sonra tek karelerdir. Ok, kılcal basıncın karbon filmi yırttığı ızgara karelerini gösterir.

Karbon filmindeki kırılmaları önlemek ve mikron altı filtre kağıdını emişe 1,7 mikrolitrelik trehaloz damlası ile birleştirmek ve daha sonra katmanları ayırmak önemli adımlardır. Soyulmuş lekelenmiş numuneler, yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri toplama için kullanılır, ardından yapı belirleme için görüntü işleme yapılır. Soyulma lekesi, daha önce kriyo-EM için çok kalın olan tek katmanlı protein 2D kristallerinin yapısal olarak belirlenmesine izin verir.

Ayrıca, çeşitli numuneleri karbon film üzerinde tek katmanlara yoğunlaştırabilir.