Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Bu yöntem, sınırlı miktarda proteinin mevcut olduğu hassas proteinlerin hazırlanması gibi yapı biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, standart numune hazırlama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, sadece çok küçük miktarlarda numune gerekmesi ve sert kağıt lekeleme adımının söz konusu olmamasıdır. Bu tekniğin etkileri, görsel proteomik ile tek hücre analizine veya proteinle ilişkili hastalığın teşhisine kadar uzanır.

Bu yöntem için ilk fikri, sadece yaklaşık 100.000 ayrı parçacıkla yüksek çözünürlüklü yapıları çözebilecek teknolojiye sahip olduğumuzda ortaya çıktı. Başlamak için, örneği ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Ardından, etan kabını, kriyo kutusu tutucusunu ve örümceği birleştirin.

Ve kriyojen kabını ağzına kadar sıvı nitrojenle doldurun. Birkaç dakika sonra, fincan soğuyacak ve sıvı nitrojen içermeyecektir. Ardından etan gazı şişesini açın ve gazın yavaşça etan kabına akmasına izin verin.

Seviye üst kısmın iki ila üç milimetre altına gelene kadar bardağın sıvı etan ile dolmasına izin verin. Bu birkaç dakika sürecektir ve yaklaşık beş mililitre sıvı etan gerektirir. Örümceği çıkarın, polistirol kapağını üstüne yerleştirin ve kriyojen kabını kriyo yazıcıdaki yuvaya yerleştirin.

Kızdırma deşarj EM ızgarasını kriyo yazıcı cımbızla kavrayın, cımbızları elektromıknatıs üzerine düğümleyin ve ızgarayı sahnede düz bir şekilde, karbon film tarafı yukarı gelecek şekilde hizalamak için mikromanipülatörü vidalayın. Yazılıma geri dönün, grid_save üzerine çift tıklayın. Ardından mikrokılcal pozisyonu, uç ızgara yüzeyinin yaklaşık 10 mikrometre üzerinde olacak şekilde ayarlayın.

Mikrokılcal damarın herhangi bir yere dokunmadan ızgara boyunca serbestçe hareket edebildiğinden emin olun. Ve gerekirse, mikrokılcal damarı birkaç mikrometre geri çekin. Ardından ızgaranın ortasına geri getirin ve yeni konumu ızgara olarak kaydedin.

Mikrokılcal damarları ana konuma geri getirin. Daha sonra, mikrokılcal damarı birkaç on nanolitre sistem sıvısıyla yıkayın ve mikro kılcal damardan herhangi bir damlayı çıkarmak için tüy bırakmayan doku kullanın. Artık her şey hazır olduğunda, makro komut dosyasını başlatın.

Makro önce yerine hareket eder ve uçtaki hava kabarcıklarını gidermek için beş nanolitre sistem sıvısını dağıtır ve ardından numune konumuna geçer. Daha sonra, 65 nanolitre numuneyi aspire eder ve daha sonra beş nanolitreyi numune tüpüne geri verir. Bu, sistem tepkisini hesaba katar ve senkronize yazmaya izin verir.

Izgara konumuna hareket ettikten sonra, mikrokılcal damarın ızgara boyunca hareket etmesine ve aynı anda 45 nanolitre numune dağıtmasına neden olacak bir yazma modeli başlatır. Daha sonra mikrokılcal damarı ızgaranın merkezine geri hareket ettirir, 10 mikrometre daha indirir ve fazla numune sıvısını geri çeker. Son olarak, makro mikrokılcal damarı geri çeker ve elektromıknatısı kapatır, bu da daldırma dondurma mekanizmasını başlatır.

Mıknatıstan serbest bırakıldıktan sonra, manyetik adaptörü pistondan dikkatlice serbest bırakın ve ızgarayı etan kabından kriyo kutusunu içeren kriyojen kabına hızlı bir şekilde aktarın ve ızgarayı boş bir yuvaya yerleştirin. Başlamak için, hücreleri ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve indiyum kalay oksit slaytını mikroskop ekine monte edin. Sürgüyü alüminyum parçaya sabitlemek ve sürgünün indiyum kalay oksit kaplaması ile elektrikle topraklanmış alüminyum çerçeve arasında elektrik temasını sağlamak için iki vida kullanın.

Daha sonra hücre kültürü ortamını kuyudan çıkarın ve hücreleri 300 mikrolitre elektroporasyon tamponu ile iki kez yıkayın. Son yıkamanın ardından hücreleri elektroporasyon tamponunda tutun. Ardından, indiyum kalay oksit slaytını canlı hücre inkübatörü aşamasına tutan alüminyum eki kurulumun üzerine yerleştirin.

Mikroskobu kullanarak hücre kültürünü bulun ve hücre olmayan bir alan seçin. Kaydırma yüzeyindeki mikro kılcal uca yaklaşın ve hafifçe dokunun. Ardından ucu 100 mikrometrede geri çekin ve konumu hücreler olarak kaydedin.

Şimdi hızlı bir şekilde hücre kültüründen çıkın ve mikrokılcal ucu birkaç on nanolitre sistem sıvısı ile yıkayın, ardından tekrar hücre kültürüne koyun. Uçta hava kabarcığı sıkışmadığından emin olmak için PDMS'ye daldırma sırasında birkaç nanolitre dağıtın. Hücrenin konumuna çift tıklayın ve indiyum kalay oksit slaytının yüzeyine yavaşça yaklaşın ve temas halinde ucu 10 mikrometre geri çekin.

Bu noktada, lizis için yakındaki bir hücreyi seçin. ve mikrokılcal damarın ucunu hedeflenen hücrenin üzerine yerleştirin. Ardından tek hücreli lizis için makro komut dosyasını başlatın.

Bir kez başlatıldığında, komut dosyası, bir hücre başarılı bir şekilde parçalandıktan sonra mikro kılcal damarın taşınması gereken bir konum isteyecektir. EM ızgarası için istenen konumu, örneğin ızgarayı girin. Makro daha sonra kullanıcı müdahalesi olmadan ilerleyecek ve mikroskobun hücre kültüründeki aşamasını 100 mikrometre sola hareket ettirerek başlayacak ve burada hedeflenen hücrenin anlık görüntüsünü alacaktır.

Daha sonra 15 nanolitre çift damıtılmış su, mikrokılcal tüpten dağılır, yüksek tuz tamponunun yerini alır ve seyreltir, hücreye ozmotik basınç uygular. Ardından, sahne alanı, ucu tekrar hedeflenen hücrenin üzerine yerleştirmek için geri hareket eder. Burada, önceden tanımlanmış bir voltaj patlaması uygulanır ve 500 milisaniye sonra, pompa sistemi dakikada iki mikrolitrelik bir akış hızında üç nanolitre numune aspire etmeye başlar.

Son olarak, sahne tekrar sola hareket eder ve bu da hücrenin incelenmesini sağlar. Kullanıcı girişi isteyen bir pencere açılır. Hücre başarılı olduysa, parçalanmış hücrenin anlık görüntüsünü almak için evet girin.

Daha sonra, mikrokılcal damar, rezervuar sıvısına daldırılmış endo konumuna hareket eder. Meme geometrisine bağlı olarak mikrokılcal damarı sekiz ila 12 dakika daldırılmış halde bırakın. Daha sonra, şartlandırılmış hücre lizatının beş nanolitresini ızgaraya dağıtın.

Mikrokılcal damarı geri çekin ve şartlandırılmış numunenin bir çiy noktası aşamasında yavaşça kurumasını bekleyin. Son olarak, ızgarayı sahneden çıkarın ve oda sıcaklığında bir ızgara kutusunda saklayın. Burada, açıklanan CryoWriter kurulumu kullanılarak donmuş numunelerin tipik kriyo görüntüleri gösterilmektedir.

Izgaraya genel bakışta, camsı buzun çevresi açıkça görülebilir. Camsı buz içeren delikli karbon film ile bir ızgara yuvasının daha yakından incelenmesi üzerine, tüm deliklerin numune tamponu ile doldurulmadığını gösteren beyaz delikler bulunabilir. Karbon delikleri içeren örneklerden birinde, bir bakteriyofajın kuyruğu ayrıntılı olarak açıkça görülebilir.

Tek hücreli görsel proteomik gerçekleştirmek için kurulan CryoWriter kullanılarak, tek tek proteinler, örneğin filamentli aktin ve bağlı proteinlere sahip zar yamaları gibi şeyler görülebilir. Panel 6b'de görebileceğiniz görüntü, bir organotungsten bileşiğine dayalı olarak %2'lik negatif bir leke ile negatif olarak boyanmıştır. Panel c, kriyo EM için hazırlanmış tek hücreli bir lizatı göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, nanolitre toplam protein numuneleri veya tek hücreli ekstraktlardan negatif leke veya kriyo EM ızgaralarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Sıvı etan ve nitrojen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygulayarak her zaman koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.