Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu
27 Temmuz 2018
Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.
Bu yöntem, sınırlı miktarda proteinin mevcut olduğu hassas proteinlerin hazırlanması gibi yapı biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, standart numune hazırlama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, sadece çok küçük miktarlarda numune gerekmesi ve sert kağıt lekeleme adımının söz konusu olmamasıdır. Bu tekniğin etkileri, görsel proteomik ile tek hücre analizine veya proteinle ilişkili hastalığın teşhisine kadar uzanır.
Bu yöntem için ilk fikri, sadece yaklaşık 100.000 ayrı parçacıkla yüksek çözünürlüklü yapıları çözebilecek teknolojiye sahip olduğumuzda ortaya çıktı. Başlamak için, örneği ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Ardından, etan kabını, kriyo kutusu tutucusunu ve örümceği birleştirin.
Ve kriyojen kabını ağzına kadar sıvı nitrojenle doldurun. Birkaç dakika sonra, fincan soğuyacak ve sıvı nitrojen içermeyecektir. Ardından etan gazı şişesini açın ve gazın yavaşça etan kabına akmasına izin verin.
Seviye üst kısmın iki ila üç milimetre altına gelene kadar bardağın sıvı etan ile dolmasına izin verin. Bu birkaç dakika sürecektir ve yaklaşık beş mililitre sıvı etan gerektirir. Örümceği çıkarın, polistirol kapağını üstüne yerleştirin ve kriyojen kabını kriyo yazıcıdaki yuvaya yerleştirin.
Kızdırma deşarj EM ızgarasını kriyo yazıcı cımbızla kavrayın, cımbızları elektromıknatıs üzerine düğümleyin ve ızgarayı sahnede düz bir şekilde, karbon film tarafı yukarı gelecek şekilde hizalamak için mikromanipülatörü vidalayın. Yazılıma geri dönün, grid_save üzerine çift tıklayın. Ardından mikrokılcal pozisyonu, uç ızgara yüzeyinin yaklaşık 10 mikrometre üzerinde olacak şekilde ayarlayın.
Mikrokılcal damarın herhangi bir yere dokunmadan ızgara boyunca serbestçe hareket edebildiğinden emin olun. Ve gerekirse, mikrokılcal damarı birkaç mikrometre geri çekin. Ardından ızgaranın ortasına geri getirin ve yeni konumu ızgara olarak kaydedin.
Mikrokılcal damarları ana konuma geri getirin. Daha sonra, mikrokılcal damarı birkaç on nanolitre sistem sıvısıyla yıkayın ve mikro kılcal damardan herhangi bir damlayı çıkarmak için tüy bırakmayan doku kullanın. Artık her şey hazır olduğunda, makro komut dosyasını başlatın.
Makro önce yerine hareket eder ve uçtaki hava kabarcıklarını gidermek için beş nanolitre sistem sıvısını dağıtır ve ardından numune konumuna geçer. Daha sonra, 65 nanolitre numuneyi aspire eder ve daha sonra beş nanolitreyi numune tüpüne geri verir. Bu, sistem tepkisini hesaba katar ve senkronize yazmaya izin verir.
Izgara konumuna hareket ettikten sonra, mikrokılcal damarın ızgara boyunca hareket etmesine ve aynı anda 45 nanolitre numune dağıtmasına neden olacak bir yazma modeli başlatır. Daha sonra mikrokılcal damarı ızgaranın merkezine geri hareket ettirir, 10 mikrometre daha indirir ve fazla numune sıvısını geri çeker. Son olarak, makro mikrokılcal damarı geri çeker ve elektromıknatısı kapatır, bu da daldırma dondurma mekanizmasını başlatır.
Mıknatıstan serbest bırakıldıktan sonra, manyetik adaptörü pistondan dikkatlice serbest bırakın ve ızgarayı etan kabından kriyo kutusunu içeren kriyojen kabına hızlı bir şekilde aktarın ve ızgarayı boş bir yuvaya yerleştirin. Başlamak için, hücreleri ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve indiyum kalay oksit slaytını mikroskop ekine monte edin. Sürgüyü alüminyum parçaya sabitlemek ve sürgünün indiyum kalay oksit kaplaması ile elektrikle topraklanmış alüminyum çerçeve arasında elektrik temasını sağlamak için iki vida kullanın.
Daha sonra hücre kültürü ortamını kuyudan çıkarın ve hücreleri 300 mikrolitre elektroporasyon tamponu ile iki kez yıkayın. Son yıkamanın ardından hücreleri elektroporasyon tamponunda tutun. Ardından, indiyum kalay oksit slaytını canlı hücre inkübatörü aşamasına tutan alüminyum eki kurulumun üzerine yerleştirin.
Mikroskobu kullanarak hücre kültürünü bulun ve hücre olmayan bir alan seçin. Kaydırma yüzeyindeki mikro kılcal uca yaklaşın ve hafifçe dokunun. Ardından ucu 100 mikrometrede geri çekin ve konumu hücreler olarak kaydedin.
Şimdi hızlı bir şekilde hücre kültüründen çıkın ve mikrokılcal ucu birkaç on nanolitre sistem sıvısı ile yıkayın, ardından tekrar hücre kültürüne koyun. Uçta hava kabarcığı sıkışmadığından emin olmak için PDMS'ye daldırma sırasında birkaç nanolitre dağıtın. Hücrenin konumuna çift tıklayın ve indiyum kalay oksit slaytının yüzeyine yavaşça yaklaşın ve temas halinde ucu 10 mikrometre geri çekin.
Bu noktada, lizis için yakındaki bir hücreyi seçin. ve mikrokılcal damarın ucunu hedeflenen hücrenin üzerine yerleştirin. Ardından tek hücreli lizis için makro komut dosyasını başlatın.
Bir kez başlatıldığında, komut dosyası, bir hücre başarılı bir şekilde parçalandıktan sonra mikro kılcal damarın taşınması gereken bir konum isteyecektir. EM ızgarası için istenen konumu, örneğin ızgarayı girin. Makro daha sonra kullanıcı müdahalesi olmadan ilerleyecek ve mikroskobun hücre kültüründeki aşamasını 100 mikrometre sola hareket ettirerek başlayacak ve burada hedeflenen hücrenin anlık görüntüsünü alacaktır.
Daha sonra 15 nanolitre çift damıtılmış su, mikrokılcal tüpten dağılır, yüksek tuz tamponunun yerini alır ve seyreltir, hücreye ozmotik basınç uygular. Ardından, sahne alanı, ucu tekrar hedeflenen hücrenin üzerine yerleştirmek için geri hareket eder. Burada, önceden tanımlanmış bir voltaj patlaması uygulanır ve 500 milisaniye sonra, pompa sistemi dakikada iki mikrolitrelik bir akış hızında üç nanolitre numune aspire etmeye başlar.
Son olarak, sahne tekrar sola hareket eder ve bu da hücrenin incelenmesini sağlar. Kullanıcı girişi isteyen bir pencere açılır. Hücre başarılı olduysa, parçalanmış hücrenin anlık görüntüsünü almak için evet girin.
Daha sonra, mikrokılcal damar, rezervuar sıvısına daldırılmış endo konumuna hareket eder. Meme geometrisine bağlı olarak mikrokılcal damarı sekiz ila 12 dakika daldırılmış halde bırakın. Daha sonra, şartlandırılmış hücre lizatının beş nanolitresini ızgaraya dağıtın.
Mikrokılcal damarı geri çekin ve şartlandırılmış numunenin bir çiy noktası aşamasında yavaşça kurumasını bekleyin. Son olarak, ızgarayı sahneden çıkarın ve oda sıcaklığında bir ızgara kutusunda saklayın. Burada, açıklanan CryoWriter kurulumu kullanılarak donmuş numunelerin tipik kriyo görüntüleri gösterilmektedir.
Izgaraya genel bakışta, camsı buzun çevresi açıkça görülebilir. Camsı buz içeren delikli karbon film ile bir ızgara yuvasının daha yakından incelenmesi üzerine, tüm deliklerin numune tamponu ile doldurulmadığını gösteren beyaz delikler bulunabilir. Karbon delikleri içeren örneklerden birinde, bir bakteriyofajın kuyruğu ayrıntılı olarak açıkça görülebilir.
Tek hücreli görsel proteomik gerçekleştirmek için kurulan CryoWriter kullanılarak, tek tek proteinler, örneğin filamentli aktin ve bağlı proteinlere sahip zar yamaları gibi şeyler görülebilir. Panel 6b'de görebileceğiniz görüntü, bir organotungsten bileşiğine dayalı olarak %2'lik negatif bir leke ile negatif olarak boyanmıştır. Panel c, kriyo EM için hazırlanmış tek hücreli bir lizatı göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, nanolitre toplam protein numuneleri veya tek hücreli ekstraktlardan negatif leke veya kriyo EM ızgaralarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.
Sıvı etan ve nitrojen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygulayarak her zaman koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu makale, kağıt emen adımlarına ihtiyaç duymadan, iletim elektron mikroskobu için nanolitre ölçüsünde numune hacimlerinin hazırlanması için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, numune kaybını önemli ölçüde azaltır ve görsel proteomikler için tek hücreli lizatların analizini sağlar.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Yapısal Biyoloji
- Proteomiks
- Tek Hücre Analizi
Arka Plan
- Geleneksel numune hazırlama yöntemleri genellikle büyük miktarlarda numune gerektirir.
- Kağıt emmek hassas proteinleri olumsuz etkileyebilir.
- Bu yöntem, sınırlı protein miktarlarının analizini sağlar.
- Minimum numune ile yüksek çözünürlüklü yapılar çözülebilir.
Çalışmanın Amacı
- Hazırlama sırasında numune kaybını en aza indiren bir teknik geliştirmek.
- Tek hücreli lizatların analizini kolaylaştırmak.
- Görsel proteomikler yoluyla proteinle ilgili hastalıkların teşhisini iyileştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Numunelerin bir kriyojenik kapta hazırlanması.
- Hassas numune dağıtımı için mikrokapiler kullanımı.
- Otomatik numune işleme için bir makro betiğin uygulanması.
- Hücre lizisi için ozmotik basınç uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, numune kaybı olmadan nanolitre hacimlerini başarıyla hazırlar.
- Tek hücreli lizatlar etkili bir şekilde analiz edilebilir.
- Proteinlerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesine ulaşılabilir.
- Teknik, proteinle ilgili hastalıkların teşhisinde umut vericidir.
Sonuçlar
- Bu yenilikçi yöntem, hassas proteinlerin çalışmasını geliştirir.
- Proteomikte tek hücre analizi için yeni yollar açar.
- Kağıt emmenin yokluğu numune bütünlüğünü iyileştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in structural biology by enabling high-resolution protein analysis from nanoliter sample volumes, directly supporting target validation when protein availability is limited. By eliminating paper blotting and reducing sample loss, it enhances sample integrity and reproducibility—key factors for reliable assay development and mechanistic de-risking in early discovery. The capability to integrate with single-cell lysis opens pathways for visual proteomics, expanding the utility of cryo-EM in phenotypic screening and biomarker discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural characterization of low-abundance or sensitive protein targets that are difficult to isolate in sufficient quantities using conventional methods.
- Operational Value: Reduces sample consumption from microgram to nanogram scales, conserving precious material for downstream assays and minimizing waste in precious target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports confident target de-risking by providing high-fidelity structural data from minimal input, improving go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces vitrified samples suitable for single-particle cryo-EM, enabling quantitative structural readouts that can inform binding affinity and conformational dynamics in assay development.
- Operational Value: Uses a dispensing system with sub-nanoliter precision, ensuring reproducible sample deposition across grids and supporting assay standardization.
- Scalability: The macro-driven automation allows consistent processing of multiple samples, facilitating medium-throughput screening campaigns when integrated with robotic sample handling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables structural follow-up of biomarkers identified in phenotypic screens, linking target engagement to atomic-level mechanism.
- Mechanistic De-risking: Facilitates visualization of protein complexes, post-translational modifications, or mutation effects in disease-relevant systems without requiring large-scale protein production.
- Quantitative Readiness: The method’s ability to prepare “lossless” total sample supports accurate quantification of complex mixtures, aiding in biomarker validation and pharmacokinetic studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural insight and enabling progression to lead identification by reducing biological uncertainty in protein targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing high-resolution structural data on protein targets, clarifying binding sites and mechanistic function from limited samples.
- Screening: Delivers assay-ready grids with standardized sample thickness and ice quality, improving reliability in downstream screening and hit validation.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs such as particle distribution, ice thickness, and molecular occupancy, enabling objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing structural analysis of disease variants or biomarker candidates derived from patient samples or single-cell lysates.
- Enterprise Reuse: The automated macro script and temperature-controlled platform create a reusable infrastructure for structural proteomics across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target structure and function, reducing ambiguity in mechanistic interpretation.
- Operational Value: Eliminates variability introduced by manual blotting, improving reproducibility and throughput in grid preparation.
- Strategic Value: Lowers the barrier to studying challenging targets, enabling broader exploration of the proteome and reducing reliance on overexpression systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing structural evidence early in the discovery pipeline, de-risking investment in high-value targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM sample preparation, microfluidic handling, and macro-based automation systems.
- Dependent on specialized instrumentation including a cryogen container, ethane plunge system, temperature-controlled stage, and precision microcapillary dispenser.
- Necessitates standardization of environmental controls (humidity, temperature) to ensure consistent sample vitrification across runs.
- Adaptation to different sample types (e.g., membrane proteins, complexes) may require optimization of buffer conditions and blotting alternatives.
- Practical limitations include the need for hazardous material handling (liquid ethane, nitrogen) and initial setup complexity, though operational simplicity improves post-training.
