Name: Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Keşfedin, iletim elektron mikroskobu için nanolitre hacimlerde kırılan numune hazırlama yöntemini. Bu teknik, kağıt emdirme adımı olmadan hassas proteinleri analiz ederek tek hücre lizatlarının görsel proteomik çalışmalarını mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar için destek, S. A. Müller için kritik tartışmaları ve dikkatle el yazması, A. Fecteau-LeFebvre EM, Ricardo Adaixo, Frank konusunda teknik yardım almak için okumak için Basel Üniversitesi Biozentrum atölye teşekkür etmek istiyorum Lehmann membran protein için test örnekleri (tüm C-Çin, Biozentrum, Basel Üniversitesi) ve A. Engel, onun ilham verici konuşmalar için Basel Üniversitesi onursal. Test örnekleri nazikçe P. Ringler, M. A. tarafından sağlanan Mahi ve T. Schwede (Biozentrum, Basel Üniversitesi), P. Leiman (Laboratuvar yapısal biyoloji ve Biyofizik, EPFL) ve R. Diaz-Avalos (New York yapısal biyoloji Merkezi, ABD). Proje İsviçre Nanobilim Enstitüsü (sni ile proje P1401, ARGOVIA proje MiPIS) ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNF, proje 200021_162521) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%3A+The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li>
<li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3043536">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).</li>
<li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li>
<li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1683435">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li>
<li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0968432894900264">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li>
<li>Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li>
<li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li>
<li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li>
<li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Cryo-EM+movie+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+cryo-EM+become%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li>
<li>Engel, A. in . <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642025969">Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology</a>. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).</li>
<li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094535">Connecting µ-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li>
<li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li>
<li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((openBEB%3A+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84(2014).</li>
<li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+interactome%3A+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li>
</ol>

Yazar Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg ve Thomas Braun aşağıdaki rakip finansal faiz beyan: cryoWriter kavramı PCT patent uygulamasının parçasıdır / EP2015/065398 ve EP16194230.

'CryoWriter' alet takımları ve örnek ızgaralar için NS - ve cryo-EM boyutlu nL toplam örnek birimlerden hazırlamak ve tamamen klasik kağıt kurutma adım önlemek için gerekli iletişim kurallarının sunulmaktadır. Mikrosıvısal ilke ve micromechanical sistem bu mümkün yapmak için cryoWriter içinde birleştirilir.
Bizim deneyim bu el yazması sunulan mini yöntemleri kullanıldığında, parametre alanı EM-kılavuz hazırlanması için klasik yöntemleri için ve sıkı Kullanıcı denetimi altında daha büyük olduğunu gösterir. Önemlisi, artan tekrarlanabilirlik elde gerçek deneme yapılmadan önce optimum parametreleri belirlemek için hazır test protein ile tamamlanmaktadır örnek arabellek sistemiyle ön ekran olanak sağlar. Bu örnek ilgi tüketimi için mutlak minimum tutar ve şiddetle tavsiye edilir. Her iki NS ve cryo EM kılavuz hazırlanması için kritik adımlar vardır: (i) emişli pompa sistemi; alt-nanoliter birimi dağıtımı için sistem sıvı (su) degassed olmalı ve ücretsiz kabarcık. (ii) kesin bir ışıma deşarj veya plazma adım temizlik denetim; EM ızgara yüzey özellikleri için tekrarlanabilir sonuçlar açısından büyük önem taşıyor. (iii) örnek Klima; Örneğin, NS, Merkezi Klima, için gereken süreyi ara bellek türü, tuz içeriği ve konsantrasyon (Şekil 3) yanı sıra microcapillary24meme geometrisini bağlıdır. (iv) buharlaşma oranlarını nicel EM NS-EM hazırlıkları için; kahve-ring etkisi kantitatif analiz NS-EM hazırlıkların yasaklayabilir ve yavaş buharlaşma oranlarını DP sahneyi tarafından kontrollü tarafından bastırılmış gerekir.
Sunulan ızgara hazırlama yöntemleri farklı yönlerini serbestçe belirli örnekleri için çok yönlü iletişim kuralları gelişimi sağlayan kombine edilebilir. Tipik örnekler Klima adım kılavuz hazırlık cryo-EM için önce yüksek çözünürlüklü EM, Örneğin, gliserol, engelleyen bir madde kaldırılması olacaktır; Arabulucu moleküllerin, Izgaralar hazır mısın önce Klima tarafından ligandlar, giriş; ya da tek hücre NS - veya cryo-EM tarafından (Şekil 6) lysate incelenmesi.
Havacilik ve sunulan yöntemler miktarlarda en az örnek kullanımı tamamen kağıt kurutma adımları gereksinimini ortadan kaldırır. Bunun büyük bir avantaj nedeni kağıt kurutma proteinler, potansiyel olarak istenmeyen iyonları ile örnek kirletici ve doğal olarak büyük örnek kaybı için önde gelen sert bir tedavidir. Öte yandan, cryoWriter kullanıldığında potansiyel olarak hava-su arabirimi cryo-EM örnekleri klasik şekilde hazırlanır zaman ince örnek film nedeniyle etkileri önlenmesini değil. Izgaralar cryo-EM için uygun örnek uygulama ve Vitrifiye (veri gösterilmez) arasında daha az 0.2 s bekleme süresi ile hazırlanabilir. Ancak, protein bir nanometre birkaç nanosaniye birkaç onda tarafından difüzyon seyahat gibi hala var. onları 100 nm kalın örnek film hava-su arayüzü ile birkaç kez çarpışmak yeterli zaman Ancak, hava-su arabirimine yapışmasını protein miktarı önemli ölçüde bu kısa sürede boşlukları tarafından azaltılmış olabilir ve proteini denatürasyon engelleyebilir veya kısıtlanmış parçacık yönlendirme. Hassas proteinler hava-su arabiriminden korumak olabilir başka bir umut verici yaklaşım düşük moleküler ağırlıklı yüzey-aktif maddeler maddeler tarafından örnek film karşılamaktır. Bu bileşiklerin hızla bir klima adım kılavuz hazırlık önce cryoWriter'tarafından tanıtıldı. Örnek potansiyel olarak belirsiz adsorpsiyon tarafından microcapillary yüzeye kayıp olabilir ve kantitatif analiz parçacık sayma tarafından rahatsız mikrosıvısal sistemlerinin yüksek yüzey hacim oranı cryoWriter daha fazla bir kısıtlamasıdır. Sorunu iki şekilde ele: ilk olarak, örnek microcapillary içinde uzun mesafelerde seyahat değil. Gerçekten de, nanoliter numune hacmi kapiler uç işleme boyunca kalır. İkinci olarak, hacim oranı yüzeye daha da microcapillaries nispeten büyük iç çapları, Örneğin, 180 µm. ile üçüncü kullanarak azalır, microcapillaries yüzeylerin kolayca gerekirse, düzgünleştirilecek onları tedavi tarafından Örneğin, piyasada bulunan polylysine etanol glikoller (PLL-PEG) ile.
Proteinler tarafından EM içinde kullanılan tek parçacık yaklaşımı yüksek çözünürlüklü analiz sadece 100.000 bireysel protein parçacıkların bir kaç milyon resimlere gerektirir. Bu mikrosıvısal teknikleri yapısal soruşturma için yeterli protein kompleksleri sağlayabilir anlamına gelir. Protein kompleksleri (yaklaşık 1 saat) (yaklaşık 40.000 hücreleri) en az hücre tutarlardan hızlı yalıtım için bir mini IMMUNO-yağış yöntemi önceki28geliştirilmiştir. Bu yöntem artık doğrudan cryoWriter küçültülmüş örnek hazırlık aşaması için bağlanır. Nihai amaç az iki saat içinde tüm gerektiren ultra-hızlı protein yalıtım ve cryo-EM kılavuz hazırlanması için bir tümleşik mikrosıvısal boru hattı geliştirmektir. Ayrıca, Şekil 6, dakika tutar ve numune hazırlama ve neredeyse kayıpsız klima ve cryoWriter kullanılarak elde kılavuz hazırlama prosedür için gerekli malzemenin hacmi gösterildiği gibi protein çalışma olanak sağlar tek tek hücreleri kompleksleri. Birlikte, biz son zamanlarda Isı şok deneyler24için gösterildiği gibi minyatür IMMUNO-yağış yöntemi ve cryoWriter "tek hücre görsel proteomik" adlı yeni bir proteomik yöntemi temeli yatıyordu. "Görsel proteomik" görüntüleri analiz için tasarlanmış veri analizi algoritmaları şu anda test edilmektedir.

Donanım ve yazılım protein kompleksleri transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından yapısal analizi için ağır son yıllarda gelişmiş. Yapılan iyileştirmeler "çözünürlük devrimi"1,2 yol açtı ve temelde yapısal araştırma değişti. Radyasyon duyarlılık azaltılması ve önlenmesi ise hazırlık yakın fizyolojik koşullar altında Biyolojik örneklerin izin cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM)3,4, advent ile devrim başladı Transmisyon Elektron mikroskobu5örnek buharlaşma yüksek vakum. Takip eden yıllarda, artan teknolojik ilerleme yavaş yavaş ulaşılabilir çözünürlük artar. Bu yenilikler arasında uygulama alanı-emisyon silah6,7vardı ve daha yakın zamanlarda, geliştirilmiş veri analizi algoritmaları, maksimum olabilirlik yöntemleri8,9gibi. Doğrudan elektron dedektörü kameralar10,11,12,13, film-tarz görüntüleme ve eşlik eden yazılım gelişmeler14,15, 16 , 17, sağlanan tek parçacık analizi (için bir daha gözden geçirme bkz: Cheng, Grigorieff, vd tarafından biyolojik örnekler için atomik çözünürlük elde etmek için gerekli son atılım 18). cryo-EM önemini yakın zamanda üç pioneers kimya Nobel Ödülü Ödülü tarafından tanındı.
TEM tarafından biyolojik bir örnek görüntü için örnek (daha sonra "kılavuz hazırlık" anılacaktır) ile EM kılavuz yüklemek için kullanılan yöntemi elde edilen örnek katmanı (i) yeterince ince olduğundan emin olmalısınız (&lt; 100 nm) geniş sesini tarafından esnek olmayan önlemek ya da çarpmak için dağınık Elektron, (ii) dayanıklı elektron mikroskobu yüksek vakum ve (III) biomolecules radyasyon zararlardan korur. Bu perquisites yerine getirmek için iki ana yöntem kullanılır: negatif leke(NS)19,20 yordamları (Şekil 1A) örnek bir ince Karbon film için absorbe, amorf ağır metal biomolecules embed ve sonra havada kurumaya derleme izin. Bu basit ve hızlı, ve (daha sonra "örnek ızgaralar" da adlandırılır) yüklü EM ızgaralar basit-e doğru saklamak ve uzun bir süre için tutulabilir (genellikle yıl). TEM, ürünleri yüksek karşıtlık NS nedeniyle sergi ve yüksek elektron dozda cryo-hazırlıklar daha tahammül, ancak çözünürlük (Şekil 1B) istihdam delikli karbon destekler yaklaşık 20 Å. Cryo-EM yordamlar sınırlıdır. Örnek çözüm ince bir film delikleri arasında yayılmış ve EM kılavuz bir cryogen, genellikle sıvılaştırılmış etan-150 ° c altında hızla sakin, içine daldı Sonuç bir amorf, vitrifiye, 50-100 nm-kalın film çözüm destek delik. Bu ince, amorf film elektron mikroskobu yüksek vakum dayanmaktadır ve ideal durumda, yerel durumlarına biyolojik yapıları korur. Yordam, yüksek çözünürlüklü yansıması biyolojik örnekler verir. Ancak, örnek kılavuz aşağıdaki sıcaklıklarda-150 ° C devitrification önlemek için her zaman tutulmalıdır. Düşük sıcaklık ama karşıtlığı nedeniyle nispeten yüksek elektron dozlarda kullanılarak görüntüsü ve sinyal-gürültü oranı yine de düşük. Bu nedenle, ortalama teknikleri kontrastı arttırmak için istihdam edilmektedir ve sağlanan örnek--dan farklı açı görüntüsü, bir yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) harita yeniden olabilir. En sık kullanılan ve tek parçacık yaklaşım bugün itibariyle 3D yeniden inşası için son derece başarılı yöntemdir. Son bir reklam için Cheng al.18' e bakın.
Yüksek karşıtlık gerek duyulduğunda veya örnek yalnızca sınırlı miktarda kullanılabilir olduğunda negatif leke TEM (NS-EM) tarama ve kalite kontrol için önemli (adsorpsiyon Karbon film genellikle yoğunlaşmaktadır örnek). Tek parçacık cryo-EM altın standart yöntem ise protein yapısının yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonu için amaçlanmıştır.
<img alt="Mikro manipülasyon teknikleri diyagramı; damlacık biriktirme, nanoyapı ekstraksiyonu ve transferini içerir." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Resim 1: TEM ilkeleri kılavuz hazırlanması ve klasik (panel A, B) ve bir mikrosıvısal yaklaşım (masası C, D) arasında karşılaştırma. A) klasik NS-EM kılavuz hazırlık: hakkında 3 µL örneği pipetted el ile (daha sonra bir 'NS-EM tablo' da adlandırılır) bir sürekli Karbon film ile kaplı bir EM ızgara üzerine (ı). Yaklaşık 10 için kuluçka sonra s, filtre kağıdı uzak adsorbed biomolecules bir ince su film bırakarak aşırı sıvı (II), taraftan leke için kullanılır. Daha sonra protein inkübe bir heavy metal tuz solüsyonu, Örneğin, 2 uranyl asetat s (III) ve tekrar sıvı filtre kağıdı (IV) kullanarak taraftan Blot tarafından kaldırılır. Son olarak, EM-grid havada kurumaya bırakılır. B) klasik cryo-EM kılavuz hazırlık: hakkında 3 µL örnek bir delikli Karbon film üzerine bir el tarafından pipetted. Bir ince örnek film oluşturmak için fazla sıvı kağıt kurutma görülen bir veya her iki taraftan da (II) tarafından kaldırılır. Son olarak, grid hızla Vitrifiye (III) için sıvı etan içine gömülür. C) cryoWriter kurulumu kullanarak NS-EM kılavuz hazırlık: A 5 nL birim bir microcapillary (i) kullanarak örnek stoktan Aspire. Merkezi Klima örnek için microcapillary ipucu Klima çözüm içine, Örneğin, %2 amonyum asetat batırılır. İyonları ile küçük moleküllerin difüzyon (II) tarafından değiştirilir. Microcapillary boyutları tüm süreç odaklı difüzyon olduğundan emin olun unutmayın. Protein çok daha düşük difüzyon sabitler Tuz iyonları daha sahiptir ve önemli ölçüde24kayıp değil. Son olarak, örnek kılavuz reçete ve (III) kuru izin. D) cryoWriter tabanlı yöntemi kullanma cryo-EM kılavuz hazırlama ilkeleri: delikli Karbon film ile kaplı bir EM kılavuz ısı kontrollü bir platform yüzeyine yerleştirilen ve cımbız tarafından düzenlenen. Platform sıcaklığını çiğ noktası sıcaklık ızgara çevrenin bir uzaklığındaki kontrol edilir. Kılavuz örnek içeren microcapillary göre taşınır ve bu kılavuz yukarıda birkaç mikrometre bitene microcapillary indirilir. Sahne bir sarmal Model taşındı iken daha sonra örnek bir kaç nanoliters ondan kalmaması sağlanmaktadır; aşırı sıvı yeniden emişli (i). EM kılavuz, priming sonra microcapillary içine kapanık ve (daha sonra çiğ noktası (DP) sahne da adlandırılır) sıcaklık kontrollü platform örnek buharlaşır için kontrollü bir miktar izin vermek kısa bir süre için kılavuz kalır. Buz gibi atılmak için kılavuz hızla cımbız (II) kullanarak sahne alanı'ndan geri 90 ° dikey pozisyona saygısız ve (daha sonra 'çekme ve dalma' mekanizması olarak da adlandırılır) cryogen banyo (III) daldı. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ne yazık ki, NS ve cryo-EM için kullanılan ızgara hazırlama yöntemleri önemli ölçüde geliştirilmiş onlar icat edildi bu yana değil. Yüksek örnek tüketimi (1 mg/mL protein yaklaşık 3 µL) geçerli sakıncaları vardır ve büyük miktarda örnek (&gt;

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Sıvı işleme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikro kılcal uç</td><td>Yeni Objektif</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>Silika Uçları 30 ve mikro; m uç kimliği, 100 ve mikro; 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>Silika Uçları 30 ve mikro; m uç kimliği, 150 ve mikro; m ID , sk. 20</td></tr><tr><td>İletken manşon</td><td>Yeni Objektif</td><td>CONGAS-1&nbsp;</td><td>HV kontağı için İletken Elastomer, 12" uzunluğunda</td></tr><tr><td>Erimiş silika boru</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Standart FS Boru, 150 & m ID, 363 ve mikro; m OD, 5 metre</td></tr><tr><td>PressFit Konnektör</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. PressFit Konektörü 0,25 ila 0,25 mm ID, sayfa 25&nbsp;</td></tr><tr><td>Şırınga 10 ve mikro; l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Luer Ucu (iğne dahil değildir)&nbsp;</td></tr><tr><td>Şırınga pompası kontrolörü</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>neMESYS kontrolörü</td></tr><tr><td>Şırınga pompası dozaj ünitesi</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>neMESYS dozaj ünitesi</td></tr><tr><td><güçlü>Sıcaklık kontrolü</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>çiy noktası sensörü</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>Nem/Sıcaklık sensörü, çiy noktası hesaplaması, USB ve gömülü DLL</td></tr><tr><td>Sıcaklığı sensör</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>Yüzeye monte edilebilir sıcaklık sensörü Pt1000</td></tr><tr><td>Peltier kontrol cihazı</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp;</td><td>Sabit voltaj çıkışlı Peltier tahrikli sistemlerin aktivasyonu için PID sıcaklık kontrolörü</td></tr><tr><td>Peltier</td><td>elemanı Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>Su soğutma bloğu</td> <td>-</td><td></td> <td>40x40 mm peltier elemanı için su soğutma bloğu, bakır taban</td></tr><tr><td>Su pompası</td><td>Digitec.ch 294877</td><td></td><td>XSPC X20 750 Çift 5.25 Bölmeli Rezervuar Pompası Siyah V4</td></tr><tr><td>Su ısı eşanjörü bloğu</td> <td>-</td><td></td> <td>Sirkülasyon suyunu soğutmak için 2 fanlı su ısı eşanjörü bloğu</td></tr><tr><td>Küçük su soğutucuları</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ram bakır baskı 2 adet</td></tr><tr><td>Küçük peltier elemanları</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 & C, 2 adet</td></tr> <tr><td>< güçlü > Mekanik< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Doğrusal aşama z ekseni</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>Yüksek yük hassas translasyon aşaması, 50 mm hareket aralığı, DC motor</td></tr><tr><td>Sahne kontrolörü</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Cıva Servo Kontrol</td></tr><tr><td>Cihazı Mikroskop xy ekseni aşaması</td><td>Önceki Bilimsel</td><td>H117EIL5</td><td>Zeiss Axiovert 200 için motorlu sahne ters mikroskop</td></tr><tr><td>Küçük kalıcı mıknatıslar</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Çubuk mıknatıs & Oslash; 5 mm, yükseklik 8,47 mm, neodimyum, N45, nikel kaplama, pk. 10</td></tr><tr><td>Küçük elektromıknatıs</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Elektromıknatıs 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Kontrol cihazı elektromıknatıs</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Elektromıknatıs kontrol PCB kartı</td></tr><tr><td>Solenoid hub</td><td>Distrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini cımbız</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Tip 5 mini, süper ince uçlar</td></tr><tr><td>Çeşitli optomekanik parçalar</td><td>Thorlabs</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Çeşitli mekanik parçalar</td><td>Atölye Biozentrum, University Basel-Özel</td><td></td> <td>tasarlanmış adaptör plakaları, tutucular vb. ekteki CAD dosyalarına bakın</td></tr><tr><td><güçlü > Optik< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>lazer diyot</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm lazer diyot modülü 2,5 mW</td></tr><tr><td>Fotoğraf dedektörü</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si Değiştirilebilir Kazanç Dedektörü, 320-1100 nm, 2,4 MHz Siyah Beyaz, 100 mm2</td></tr><tr><td><güçlü>EM ızgaralar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FİLM TEM</td><td></td> <td>emsdiasum.comDTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN ve ticaret; TEM için silisyum nitrür membranlar, 5'li paket</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers / Neg. leke</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp; SIGMA</td><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu NanoVan</td></tr><tr><td>%2</td> <td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negatif leke vanadyum bazlı</td></tr><tr><td>NanoW %2</td> <td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negatif leke tungsten bazlı</td></tr> <tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>openBEB 2 çerçevesi istek üzerine mevcuttur, sürüm 3 indirilebilir olacaktır</td></tr><tr><td>CryoWriter kontrolü yazılım (openBEB eklentisi)İstek</td><td></td> <td>üzerine mevcuttur, 3. taraf sürücü yazılımı için ekstra ücret uygulanabilir.</td><td></td></tr></tbody></table>

kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Son teknolojik ilerleme nedeniyle cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) hızla protein kompleksleri atomik çözünürlükte yapısal analizi için standart bir yöntem haline geliyor. Ancak, protein yalıtım teknikleri ve örnek hazırlama yöntemleri için EM bir darboğaz kalır. Bireysel protein parçacıklar nispeten az sayıda (100,000 birkaç milyon) proteinler yüksek çözünürlüklü analiz için tek parçacık EM yaklaşım, kırılan örnek işleme teknikleri ve mikrosıvısal ilkeleri yapım tarafından yansıması gereken uygulanabilir.
Örnek ön Klima, EM kılavuz astar ve yalnızca nanoliter-örnek hacimleri tüketir işlem sonrası için bir minyatür, kağıt-Blot ücretsiz EM kılavuz hazırlama yöntemi gösterilir. Yöntem bir dağıtım sistemi kontrol sıvı alımı ve EM kılavuz astar, bir platform için alt-nanoliter hassasiyetle böylece belirleme bağıl nem EM kılavuz ve çekme-ve-dalma-için bir mekanizma örnek yukarıda kılavuz sıcaklık denetlemek için kullanır Vitrifiye. Cryo-EM, EM kılavuz ısı kontrollü sahnede yer alıyor ve örnek bir kılcal damar Aspire. Kapiler uç ızgara yüzeyi bir mesafede konumlandırılmış, kılavuz ile örnek yüklenir ve aşırı microcapillary yeniden emişli. Daha sonra örnek film stabilize ve biraz platformu sıcaklık çiğ noktası göreli uzaklığı tarafından kontrollü su buharlaşma ile inceltilerek. Belirli bir noktada hızla içine sıvı etan örnek vitrifikasyon için astarlanmalıdır EM kılavuz aktarma çekme ve dalma mekanizma tetiklenir. Alternatif olarak, örnek-Klima yöntemleri örnek nanoliter boyutlu birimleri negatif leke (NS) EM hazırlamak kullanılabilir.
Metodolojisi büyük ölçüde örnek tüketimini azaltmak ve filtre kağıdı kurutma geleneksel yöntemlerde kullanılan gibi yaklaşımlar zararlı proteinler, kaçının. Ayrıca, gerekli örnek küçük miktarda gibi hızlı örnek tek hücre lizis için "görsel proteomik" or "kayıpsız" Toplam numune hazırlama Nicel analiz ile Merkezi Klima, roman deneysel stratejileri sağlar karmaşık örnekleri.

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Bu yöntem, sınırlı miktarda proteinin mevcut olduğu hassas proteinlerin hazırlanması gibi yapı biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, standart numune hazırlama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, sadece çok küçük miktarlarda numune gerekmesi ve sert kağıt lekeleme adımının söz konusu olmamasıdır. Bu tekniğin etkileri, görsel proteomik ile tek hücre analizine veya proteinle ilişkili hastalığın teşhisine kadar uzanır.Bu yöntem için ilk fikri, sadece yaklaşık 100.000 ayrı parçacıkla yüksek çözünürlüklü yapıları çözebilecek teknolojiye sahip olduğumuzda ortaya çıktı. Başlamak için, örneği ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Ardından, etan kabını, kriyo kutusu tutucusunu ve örümceği birleştirin.Ve kriyojen kabını ağzına kadar sıvı nitrojenle doldurun. Birkaç dakika sonra, fincan soğuyacak ve sıvı nitrojen içermeyecektir. Ardından etan gazı şişesini açın ve gazın yavaşça etan kabına akmasına izin verin.Seviye üst kısmın iki ila üç milimetre altına gelene kadar bardağın sıvı etan ile dolmasına izin verin. Bu birkaç dakika sürecektir ve yaklaşık beş mililitre sıvı etan gerektirir. Örümceği çıkarın, polistirol kapağını üstüne yerleştirin ve kriyojen kabını kriyo yazıcıdaki yuvaya yerleştirin.Kızdırma deşarj EM ızgarasını kriyo yazıcı cımbızla kavrayın, cımbızları elektromıknatıs üzerine düğümleyin ve ızgarayı sahnede düz bir şekilde, karbon film tarafı yukarı gelecek şekilde hizalamak için mikromanipülatörü vidalayın. Yazılıma geri dönün, grid_save üzerine çift tıklayın. Ardından mikrokılcal pozisyonu, uç ızgara yüzeyinin yaklaşık 10 mikrometre üzerinde olacak şekilde ayarlayın.Mikrokılcal damarın herhangi bir yere dokunmadan ızgara boyunca serbestçe hareket edebildiğinden emin olun. Ve gerekirse, mikrokılcal damarı birkaç mikrometre geri çekin. Ardından ızgaranın ortasına geri getirin ve yeni konumu ızgara olarak kaydedin.Mikrokılcal damarları ana konuma geri getirin. Daha sonra, mikrokılcal damarı birkaç on nanolitre sistem sıvısıyla yıkayın ve mikro kılcal damardan herhangi bir damlayı çıkarmak için tüy bırakmayan doku kullanın. Artık her şey hazır olduğunda, makro komut dosyasını başlatın.Makro önce yerine hareket eder ve uçtaki hava kabarcıklarını gidermek için beş nanolitre sistem sıvısını dağıtır ve ardından numune konumuna geçer. Daha sonra, 65 nanolitre numuneyi aspire eder ve daha sonra beş nanolitreyi numune tüpüne geri verir. Bu, sistem tepkisini hesaba katar ve senkronize yazmaya izin verir.Izgara konumuna hareket ettikten sonra, mikrokılcal damarın ızgara boyunca hareket etmesine ve aynı anda 45 nanolitre numune dağıtmasına neden olacak bir yazma modeli başlatır. Daha sonra mikrokılcal damarı ızgaranın merkezine geri hareket ettirir, 10 mikrometre daha indirir ve fazla numune sıvısını geri çeker. Son olarak, makro mikrokılcal damarı geri çeker ve elektromıknatısı kapatır, bu da daldırma dondurma mekanizmasını başlatır.Mıknatıstan serbest bırakıldıktan sonra, manyetik adaptörü pistondan dikkatlice serbest bırakın ve ızgarayı etan kabından kriyo kutusunu içeren kriyojen kabına hızlı bir şekilde aktarın ve ızgarayı boş bir yuvaya yerleştirin. Başlamak için, hücreleri ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve indiyum kalay oksit slaytını mikroskop ekine monte edin. Sürgüyü alüminyum parçaya sabitlemek ve sürgünün indiyum kalay oksit kaplaması ile elektrikle topraklanmış alüminyum çerçeve arasında elektrik temasını sağlamak için iki vida kullanın.Daha sonra hücre kültürü ortamını kuyudan çıkarın ve hücreleri 300 mikrolitre elektroporasyon tamponu ile iki kez yıkayın. Son yıkamanın ardından hücreleri elektroporasyon tamponunda tutun. Ardından, indiyum kalay oksit slaytını canlı hücre inkübatörü aşamasına tutan alüminyum eki kurulumun üzerine yerleştirin.Mikroskobu kullanarak hücre kültürünü bulun ve hücre olmayan bir alan seçin. Kaydırma yüzeyindeki mikro kılcal uca yaklaşın ve hafifçe dokunun. Ardından ucu 100 mikrometrede geri çekin ve konumu hücreler olarak kaydedin.Şimdi hızlı bir şekilde hücre kültüründen çıkın ve mikrokılcal ucu birkaç on nanolitre sistem sıvısı ile yıkayın, ardından tekrar hücre kültürüne koyun. Uçta hava kabarcığı sıkışmadığından emin olmak için PDMS'ye daldırma sırasında birkaç nanolitre dağıtın. Hücrenin konumuna çift tıklayın ve indiyum kalay oksit slaytının yüzeyine yavaşça yaklaşın ve temas halinde ucu 10 mikrometre geri çekin.Bu noktada, lizis için yakındaki bir hücreyi seçin. ve mikrokılcal damarın ucunu hedeflenen hücrenin üzerine yerleştirin. Ardından tek hücreli lizis için makro komut dosyasını başlatın.Bir kez başlatıldığında, komut dosyası, bir hücre başarılı bir şekilde parçalandıktan sonra mikro kılcal damarın taşınması gereken bir konum isteyecektir. EM ızgarası için istenen konumu, örneğin ızgarayı girin. Makro daha sonra kullanıcı müdahalesi olmadan ilerleyecek ve mikroskobun hücre kültüründeki aşamasını 100 mikrometre sola hareket ettirerek başlayacak ve burada hedeflenen hücrenin anlık görüntüsünü alacaktır.Daha sonra 15 nanolitre çift damıtılmış su, mikrokılcal tüpten dağılır, yüksek tuz tamponunun yerini alır ve seyreltir, hücreye ozmotik basınç uygular. Ardından, sahne alanı, ucu tekrar hedeflenen hücrenin üzerine yerleştirmek için geri hareket eder. Burada, önceden tanımlanmış bir voltaj patlaması uygulanır ve 500 milisaniye sonra, pompa sistemi dakikada iki mikrolitrelik bir akış hızında üç nanolitre numune aspire etmeye başlar.Son olarak, sahne tekrar sola hareket eder ve bu da hücrenin incelenmesini sağlar. Kullanıcı girişi isteyen bir pencere açılır. Hücre başarılı olduysa, parçalanmış hücrenin anlık görüntüsünü almak için evet girin.Daha sonra, mikrokılcal damar, rezervuar sıvısına daldırılmış endo konumuna hareket eder. Meme geometrisine bağlı olarak mikrokılcal damarı sekiz ila 12 dakika daldırılmış halde bırakın. Daha sonra, şartlandırılmış hücre lizatının beş nanolitresini ızgaraya dağıtın.Mikrokılcal damarı geri çekin ve şartlandırılmış numunenin bir çiy noktası aşamasında yavaşça kurumasını bekleyin. Son olarak, ızgarayı sahneden çıkarın ve oda sıcaklığında bir ızgara kutusunda saklayın. Burada, açıklanan CryoWriter kurulumu kullanılarak donmuş numunelerin tipik kriyo görüntüleri gösterilmektedir.Izgaraya genel bakışta, camsı buzun çevresi açıkça görülebilir. Camsı buz içeren delikli karbon film ile bir ızgara yuvasının daha yakından incelenmesi üzerine, tüm deliklerin numune tamponu ile doldurulmadığını gösteren beyaz delikler bulunabilir. Karbon delikleri içeren örneklerden birinde, bir bakteriyofajın kuyruğu ayrıntılı olarak açıkça görülebilir.Tek hücreli görsel proteomik gerçekleştirmek için kurulan CryoWriter kullanılarak, tek tek proteinler, örneğin filamentli aktin ve bağlı proteinlere sahip zar yamaları gibi şeyler görülebilir. Panel 6b'de görebileceğiniz görüntü, bir organotungsten bileşiğine dayalı olarak %2'lik negatif bir leke ile negatif olarak boyanmıştır. Panel c, kriyo EM için hazırlanmış tek hücreli bir lizatı göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, nanolitre toplam protein numuneleri veya tek hücreli ekstraktlardan negatif leke veya kriyo EM ızgaralarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.Sıvı etan ve nitrojen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygulayarak her zaman koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Burada, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analizi için düşük hücre sayılı numunelerin hazırlanmasına yönelik bir protokol sunuyoruz.

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Bu rapor, kalın biyolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron tomografisini gerçekleştirmek için bir numune hazırlama protokolünü ve özel görüntüleme koşullarını açıklar.

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

Bu çalışmada bir mikroorganizma transmisyon elektron mikroskobu içinde pahalı aletler olmadan seri ultrathin bölümleri elde etmek için güvenilir ve kolay yordamları sunar.

Transmisyon elektron mikroskobu mikroorganizmaların seri Ultrathin bölümler elde etmek için bir yöntem

Bu iletişim kuralı gerekli transmisyon elektron mikroskobu negatif boyama, ayrıntılı yapısı ve IMMUNO-altın spesifik proteinlerin konumlarda exosomes belirlemek için etiketleme için ultrathin kesit dahil olmak üzere için çeşitli teknikler açıklanır.

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Burada iki örnek işleme teknikleri, buz gibi yüksek basınç birleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve mikrodalga destekli örnek işleme, veri odaklı iyon demeti Taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile edinme için gömme en az reçine izledi. Bu bir fare tibial sinir örnek ve Caenorhabditis eleganskullanarak gösterilmiştir.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

Bu rapor, Drosophila Larvalarında nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için yeni bir numune hazırlama prosedürü sunmaktadır. Bu yöntem, geleneksel yönteme kıyasla örneklerin kıvrılmasını önlemede daha etkilidir ve özellikle Drosophila nöromüsküler kavşak ultrastrüktürel analizi için yararlıdır.

Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakların transmisyon elektron mikroskobu için numune hazırlama sürecinin optimize edilmesi

Bu protokol, numune hazırlama optimizasyonu yoluyla eşit olmayan parçacık dağılımını ele almak için bir örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) kullanan pratik bir yöntem sunar ve araştırmacılara kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanarak makromoleküler yapıları verimli bir şekilde aydınlatmaları için bir referans sağlar.

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Biz fiksasyon, gömme, kesit, bir süreç tarif etmek, ve geç dönem...

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

Keşfedin, iletim elektron mikroskobu için nanolitre hacimlerde kırılan numune hazırlama yöntemini. Bu teknik, kağıt emdirme adımı olmadan hassas proteinleri analiz ederek tek hücre lizatlarının görsel proteomik çalışmalarını mümkün kılar.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Daha fazla video keşfet