Name: Pozitron Emisyon Tomografisi Kullanılarak Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Fare Modelinde CD19+ B Hücrelerinin Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Öğrenin, deneysel otoimmün ensefalomiyelit fare modelinde PET görüntüleme ile CD19+ B hücrelerinin dağılımını ve dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, merkezi sinir sistemi hastalıklarında B hücre davranışlarını yüksek doğrulukla nicelendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stanford'daki SCi3 küçük hayvan görüntüleme tesisinden ve PET/CT ile ilgili teknik yardımı için Dr. Frezghi Habte'den destek için minnettarız. LC-MS, Stanford Üniversitesi Kütle Spektrometresi (SUMS) çekirdek tesisindeki çekirdek personel tarafından gerçekleştirilir ve bu hizmeti sağlayan personele teşekkür ederiz. Horizon Therapeutics'e hCD19-mAb'ı çok nazik bir şekilde sağladığı için ve özellikle Jodi Karnell'e teknik rehberliği ve desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1) tarafından finanse edilmiştir.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig1v2.jpg"> Şekil 1: Çalışma tasarımı. Bu makaledeki temel tekniklere genel bir bakış. (A) Fareleri tarama yatağına sırt üstü yerleştirmek omurgadaki hareketi azaltır. (B) Farelerin PET/CT görüntülemesi. (C) Omurgayı ortaya çıkarmak için hayvanın sırt tarafından bir kesi yapın. (D) Omurgayı servikal/torasik ve lomber kısımlara ayırın ve belirtilen beş kesiği takip eden bölümleri çıkarın. (E) Şırınga ve omurga ile bir sızdırmazlık yaparak ve gösterildiği gibi omurganın kraniyal ve kaudal uçlarından kızartarak omuriliği omurgadan çıkarmak için bir şırınga kullanın. (F) İzole servikal/torasik ve lomber omurilik segmentleri. Kısaltma: PET/CT = Pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tüm hayvan çalışmaları, Laboratuvar Hayvanları Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Derneği (AAALAC International) tarafından akredite edilmiş bir program olan Stanford Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Bakımı İdari Paneli'ne (APLAC) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Fareler, çalışmanın başlamasından en az 7 gün önce vivaryuma alıştırıldı, çünkü stres EAE indüksiyonunu etkileyebileceğinden, fareler üzerindeki stresi en aza indirgedi.
1. Dişi insanlaştırılmış CD19 farelerinde EAE indüksiyonu
<ol><li>MOG1-125 kullanarak daha önce tarif edildiği gibi 5 EAE ile 9-13 haftalık insanlaştırılmış CD19 C57BL / 6J dişi fareleri indükleyin.</li>
</ol>2. EAE fare modelinde hayvan bakımı ve puanlama
<ol><li>Daha önce tarif edildiği gibi fareler için hastalık ilerlemesini ve bakımını puanlayın5. Kısaca, bu modeli 1-5 arasında bir ölçekte şu şekilde puanlayın: 1 kuyruk zayıflığı/gevşekliği, 2 zayıflamış arka ayaklar, 3 arka bacak felci, 4 ön ayak zayıflığı ile arka bacak felci, 5 can çekişiyor.</li>
</ol>3. mAb konjugasyonu, radyoetiketleme ve karakterizasyon
<ol><li>İki işlevli şelatör 1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetik asit mono-N-hidroksisüksinimid esteri (DOTA-NHS-ester) hCD19-mAb'ye 64Cu ile radyo-etikete eşitleyin.<ol><li>Bir tuz giderme sütunu kullanarak, hCD19-mAb depolama tamponunu HEPES tamponu (pH 8.5-9) ile değiştirin: tuz giderme kolonunu/kolonlarını HEPES ile koşullandırın. Tuzdan arındırma kolonu numune hacmi kapasitesine ve gereken mAb hacmine bağlı olarak gereken kolon sayısını hesaplayın: 0,5 mL tüpler: 30-130 μL numune hacmi, 300 μL yıkama; 2 mL tüp: 200-700 μL numune hacmi, 1 mL yıkama.</li>
		<li>Tuzdan arındırma kolonu aracılığıyla tampon değişimi için santrifüjü 4 °C'ye soğutun.</li>
		<li>Tuzdan arındırma sütununu buzdolabından alın. Tuz giderme kolonunun altını çıkarın, kapağı gevşetin ve kolonu bir toplama tüpüne yerleştirin.</li>
		<li>Depolama solüsyonunu çıkarmak için 1.500 × g'da 2 dakika santrifüjleyin; Depolama solüsyonunu içeren akışı atın ve toplama tüpünü yeniden kullanın. Tuz giderme sıkıştırılmış reçinenin en yüksek noktasının yukarı doğru eğimli olduğu sütun üzerinde bir çizgi işaretleyin.</li>
		<li>Tuzdan arındırma kolonunun alt tarafına HEPES tamponu ekleyin. Tuz giderme kolonunu, çizgi dışa bakacak şekilde santrifüje yerleştirin; 1.500 × g'da 2 dakika döndürün. Akışı atın ve toplama tüpünü yeniden kullanın.</li>
		<li>Aynı toplama tüpünü kullanarak ve adımlar arasındaki akışı atarak 3.1.4 ve 3.1.5 adımlarını 2x tekrarlayın.</li>
		<li>Şartlandırılmış tuz giderme kolonunu yeni bir toplama tüpüne ve etikete yerleştirin; bu tüp hCD19-mAb içerecektir.</li>
		<li>Şartlandırılmış tuzdan arındırma kolonunun/kolonlarının üstüne hCD19-mAb ekleyin ve boş mAb şişesini durulamak için HEPES tamponu kullanın; Bunu tuzdan arındırma sütununun üstüne ekleyin (üreticinin tavsiyesine göre toplam hacim). HC19-mAb'yi elüte etmek için 2 dakika boyunca 1.500 × g'da döndürün. HC19-mAb'yi içeren akışı koruyun.</li>
		<li>Bir UV/Vis spektrofotometresi kullanarak hCD19-mAb konsantrasyonunu ölçün ve gerekirse HEPES tamponu ile 0,5 μg/μL'ye ayarlayın.</li>
		<li>hCD19-mAb çözeltisine, hCD19-mAb çözeltisinde EDTA'nın nihai konsantrasyonunu 0.01 M yapmak için 0.5 M EDTA'lık mAb çözeltisinin hacminin 1/50'sini ekleyin. HC19-mAb-EDTA çözeltisini oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.</li>
		<li>DOTA-NHS-ester'i dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına (10-15 dakika) gelmesini bekleyin. İstenen DOTA/mAb molar oranının (tipik olarak 1-2 DOTA/mAb mertebesindedir) eklenmesine izin verecek bir DOTA konsantrasyonu yapmak için DOTA-NHS-ester'e eklenecek DMSO hacmini hesaplayın. NOT: HC19-mAb'ye eklenen DMSO-DOTA-NHS-ester hacmi, mAb hacminin 'unu geçmemelidir. Bu, hızlı ve tekrar tekrar yapılabilmesi için bir elektronik tablo kullanılarak yapılmalıdır.</li>
		<li>İstenen DOTA'nın hCD19-mAb'ye oranına bağlı olarak, hCD19-mAb'ye eklenecek DOTA-NHS-ester miktarını hesaplayın. nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL DMSO → DOTA/DMSO çözeltisinin seyreltme faktörü</li>
		<li>1-2 mg DOTA-NHS-ester tartın ve DMSO'nun doğru hacmini (adım 3.1.11'de hesaplanan) DOTA-NHS-esterine dikkatlice ekleyin; karıştırın ve döndürün.</li>
		<li>DOTA-NHS-ester çözeltisinin (adım 3.1.12) hesaplanan hacmini hCD19-mAb çözeltisine pipetleyin; ekstra DOTA-NHS-ester eklenmediğinden emin olmak için eklemeden önce pipet ucunun dışını silin (pipetteki miktarı değiştirmeden). Yavaşça karıştırın ve döndürün.</li>
		<li>Gece boyunca (12-16 saat) reaksiyona girmesi için buzdolabına (4 °C) koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Saflaştırma ve konsantrasyon<ol><li>Santrifüj yoğunlaştırıcı tampon değişim adımları için santrifüjü 4 °C'ye soğutun; konjugatı dondurmak için kuru buz üzerine metal bir PCR tüp bloğu yerleştirin.</li>
		<li>DOTA-hCD19-mAb reaksiyonunu buzdolabından çıkarın ve biyolojik sınıf TRIS tamponu ekleyerek söndürün: toplam reaksiyon hacminin 'u. Kütle spektrometrisi analizi için numunenin 10-20 μg'ını çıkarın.</li>
		<li>0,1 M amonyum asetat tamponu, pH 5,5 kullanarak tuzdan arındırma kolonunu/kolonlarını yukarıda açıklandığı gibi (adım 3.1.1-3.1.5) koşullandırın.</li>
		<li>DOTA-hCD19-mAb çözeltisini amonyum asetat ile tampon değişimi (adım 3.1.1-3.1.8).</li>
		<li>DOTA-hCD19-mAb çözeltisini konsantre edin: çözeltiyi, üreticinin hacim konusundaki tavsiyelerine uyarak 50 kDa'lık bir moleküler ağırlık kesme santrifüj yoğunlaştırıcıya ekleyin. 4.000 × g'da</li><li> <ol><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></ol></li><li><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64133/64133eq01v2.jpg" style="margin: auto;"></li></ol></li><li> <ol><li><li></li><li><li></li><li><li><li><ol><li><li><li> </li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li> </li><li></li></ol></li></ol><ol><li></li><li> </li><li> <ol><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li> <ol><li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> </li><li> <ol><li><li></ol></li><li><ol><li></ol></li><li></ol><ol><li> <ol><li><li><li></li><li></li><li><ol><li></ol></li></ol></li><li><li> <ol><li><ol><li> </li><li></li><li> </li></ol></li></ol></li><li> <ol><li></ol></li><li><ol><li></ol></li><li><ol><li></ol></li><li><li><ol><li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li><li> </li><li><li><li></ol><ol><li><li></li><li><ol><li><li><li> <ol><li></ol></li></ol></li><li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li><ol><li></li><li><li></li></ol></li></ol></li></ol><ol><li></li><li> </li><li><li> </li><li><li></li><li></ol><ol><li> </li><li> </li><li><ol><li><li></ol></li><li><li><li></ol><ol><li><ol><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li></ol></li><li></ol><ol><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li></li><li></li><li><ol><li></li></ol></li><li> </li><li></li><li><ol><li></li></ol></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li><li></li></ol></li></ol><ol><li> </li></ol>

<ol><li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).</li>
<li>Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inebilizumab%2C+a+B+cell-depleting+anti-CD19+antibody+for+the+treatment+of+autoimmune+neurological+diseases%3A+Insights+from+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107(2016).</li>
<li>Stevens, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+CD19+PET+tracer+for+detecting+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275(2020).</li>
<li>Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+neuroinflammation+using+%5B11C%5DDPA-713+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).</li>
<li>Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+antigen-specific+antibody+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+recombinant+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).</li>
<li>Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+follicle-like+structures+in+multiple+sclerosis-With+focus+on+the+role+of+B+cell+activating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor.</a> Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).</li>
<li>James, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis+using+64Cu-Rituximab+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Lyons, J. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+are+critical+to+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+protein+but+not+by+a+short+encephalitogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide.</a> European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).</li>
</ol>

CD19 antikoru Horizon Therapeutics tarafından sağlandı.

Bu makalede, CD19-PET kullanılarak MS'in bir fare modelinde insan-CD19+ B hücrelerinin görüntülenmesi için kolaylaştırılmış bir yöntem açıklanmaktadır. MS'in heterojen prezentasyonu ve tedavilere farklı yanıtlar nedeniyle, klinikte yönetimi zor olabilir ve tedavi seçimi ve izlemi için yeni yaklaşımlara büyük ihtiyaç vardır. PET görüntüleme, hastalığın ilerlemesini ve B hücresini tüketen tedaviye bireysel yanıtı izlemek için güçlü bir araç olarak hizmet edebilir. MS'e ek olarak, CD19-PET görüntüleme, lenfoma ve lösemi alt tiplerinde veya diğer B hücresi aracılı hastalıklarda tedaviden sonra B hücresi tükenmesini izlemek için kullanılabilir. Bu protokol ve temsili veriler, nörolojik hastalıklarda B hücrelerinin görüntülenmesinin faydasını göstermektedir.
İnsan CD19+ B hücrelerini MS bağlamında incelemek için, B hücresine bağımlı MOG1-125 EAE model7'yi seçtik. Diğer EAE modellerine benzer şekilde, bu model ilerleyici paralizi ve immün hücrelerin CNS'ye infiltrasyonu semptomları ile kendini gösterir. Bununla birlikte, MOG1-125 modeli, B hücresi güdümlü bir model olması bakımından benzersizdir: fareler, meninksler, beyin sapı, parankim ve ventriküllerdeki subaraknoid boşlukta değişen sayıda B hücresi içerir. Bu lenfositler, bu bölgeler boyunca seyrek olarak dağılabilir ve/veya MS8,9'lu insanlarda da gözlenen folikül benzeri yapılar oluşturabilir. Saf farelerin kontrol olarak kullanılmasına ek olarak, tam bir Freund'un adjuvanı (CFA) sadece indüksiyon kiti kullanılabilir (yani, MOG proteini olmayan EAE farelerine verilenle aynı indüksiyon emülsiyonu). EAE fare modelinde, kan beyin bariyeri (BBB) işlevsizdir ve antikorlar gibi daha büyük varlıkların geçmesine izin verir. CD19-mAb radyoizleyici, yalnızca B hücreleri mevcutsa bağlanır ve CNS'de kalır; B hücreleri yoksa izleyici kan havuzuna geri dönecektir. Bunu, dokulardaki radyoaktivite düzeylerini ölçmeden önce perfüze ederek CNS dokularının gama sayımı ve ex vivo otoradyografisini kullanarak gösterdik. Bunu, CNS 1,2'deki B hücrelerini tespit etmek için mAb tabanlı PET radyoizleyicilerin (yani, immünoPET görüntüleme yaklaşımları) kullanımını bildiren daha önceki yayınlarda da gösterdik.
DOTA şelatörü, bakır-64 işaretli peptitler ve antikorlar ile klinik PET görüntülemede kullanıldığı için kullanıldı ve hCD19-mAb'yi MS hastalarının klinik görüntülemesi için çevirmeyi amaçlıyoruz. DOTA, in vivo olarak bakır-64'e yeterli bağlanma afinitesine sahiptir. İn vivo stabilite çok önemlidir çünkü serbest 64Cu karaciğere gider ve bağlı radyoizleyicinin sinyalini gizleyebilir; Bu nedenle, diğer organlara kıyasla bağıl sinyali hesaplamak için karaciğerdeki sinyali ölçmek önemlidir. Kas tipik olarak bir kontrol dokusu olarak alınır, ancak EAE durumunda kaslarda iltihaplanma olabilir. 64Cu'nun yarı ömrü 12.7 saattir, bu da sinyalin PET ile ölçülebilmesini sağlarken DOTA-hCD19-mAb'ın hedefine bağlanması için yeterli zaman sağlar. Konjugatı hazırlarken, istenen DOTA/mAb oranını üretmek için mAb'ye eklenecek DOTA miktarını belirlemek için küçük ölçekli (75-125 μg) test reaksiyonları gerçekleştirilmelidir (örneğin, mol mAb başına 6-10 kat fazla DOTA-NHS-ester reaksiyonu 1-2 DOTA/mAb'lik bir konjugat). Reaksiyon süresi ve sıcaklığı (örneğin, 2-4 saat veya gece boyunca 4 °C veya oda sıcaklığında) da DOTA/mAb oranını etkiler ve optimize edilmelidir. mAb başına DOTA sayısını hesaplamak için radyoaktif olmayan bakır ile bir titrasyon gerçekleştirilebilir; ancak, daha güvenilir ve doğru sonuçlar için MALDI-MS ve/veya LC-MS yapmanızı öneririz.
Hesaplanan DOTA/mAb oranı, belirli bir numune için ortalama bir değerdir ve bazı farklılıklar beklenir. MALDI için, konjuge ve konjuge olmayan mAb'ler için numune başına birkaç çekim yapılır. Daha sonra ortalama DOTA/mAb sayısını belirlemek için konjuge ve konjuge olmayan oranını hesaplıyoruz. DOTA/mAb oranı önemlidir çünkü çok fazla şelatör antikor bağlanmasını bozar ve çok azı tutarsız radyoetiketlemeye ve düşük sinyale yol açar. Tutarlı sinyal yoğunluğunu ve bağlanma kinetiğini korumak için oran, eşlenik partileri arasında çok yakın olmalıdır; İdeal olarak, belirli bir çalışmadaki tüm deneyler için aynı eşlenik parti kullanılmalıdır. Olası aşırı konjugasyona bağlı immünoreaktivite üzerindeki potansiyel etkileri azaltmak için umut verici bir teknik, bölgeye özgü konjugasyon10'u kullanmaktır, bu sayede şelatör konjugasyonu antikorun ağır zincirli glikanları üzerinde bölge seçicidir, böylece mAb başına 1 şelatör ilavesini garanti eder.
Diğer koşulların yanı sıra antikor, DOTA/mAb oranı ve 64Cu molar aktivitedeki farklılıklar radyo-etiketlemeyi etkileyeceğinden, radyoetiketleme reaksiyon koşulları en yüksek etiketleme verimliliğini ve verimini sağlamak için optimize edilmelidir. Optimum 64Cu / mAb eşlenik oranının kullanılması, radyoizleyicinin saflaştırılmadan kullanılmasına izin vererek, yerçekimi akış kolonu ve radyoaktif bozunma nedeniyle radyo-etiketleme ve kayıp için gereken süreyi azaltabilir. Aynı 64Cu / mAb konjugat oranı kullanıldığında tutarlı ve güvenilir bir molar aktivite de elde edilebilir, bu özellikle birden fazla fare kohortu veya görüntüleme çalışmaları arasındaki sonuçları karşılaştırırken önemlidir. ITLC koşulları da her kullanıcıya uyacak şekilde değiştirilebilir. Saflaştırma gerekliyse, molar aktivitenin hesaplanabilmesi için HPLC ve/veya UV/Vis spektrofotometrisi için bir alikot kaydedilmelidir.
Görüntüleme için radyoaktif işaretli antikorların kullanılmasının zor olabileceğini unutmamak önemlidir. Radyoizleyici için kullanılan antikorun fizyolojik bir etkiye sahip olmaması için biyolojik olarak inert olması esastır. Ayrıca, antikorlar uzun bir kan ikametgahına sahip olduklarından, görüntü kalitesinden ödün vermeden uygun bir sinyal-arka plan sağlamak için belirli bir mAb'nin dolaşımı, bağlanması ve temizlenmesi için yeterince uzun süre beklenmelidir. Tipik olarak 64 Cu etiketli bir mAb için 20-48 saat beklemek yeterlidir, ancak belirli bir kemirgen modelinde görüntüleme için en iyi zaman noktasını belirlemek için yeni bir mAb PET izleyiciyi değerlendirirken enjeksiyondan 2, 4, 6, 12, 24, 48 saat sonra görüntülenmelidir. Aynısı, en yüksek sinyal-arka plan oranına sahip ARG görüntülerini elde etmek için de geçerlidir. Bu protokoldeki temsili görüntüler enjeksiyondan 18-20 saat sonra alınmıştır, ancak kullanılan radyoizotopa bağlı olarak başka zaman noktaları da kullanılabilir. CD19'un farklı epitoplarına bağlanan farklı antikorlar farklı sonuçlar verecektir ve titizlikle karakterize edilmelidir.
Omurilik sinyalini analiz ederken, solunumun neden olduğu hareketi azaltmak için fareleri tarama yatağında sırt üstü konumlandırmak önemlidir. Ek olarak, sırtüstü yerleştirme, EAE hastalığının ilerlemesi nedeniyle omurga eğriliği artmış farelerde omurgayı düzeltmeye yardımcı olabilir. Omurga ve omurilikteki sinyali tespit etmeyi hedeflerken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli husus, MOG1-125'in yan tarafa enjekte edilmesinden kaçınmaktır, çünkü enjeksiyon bölgeleri bu bölgelerdeki ilişkili bağışıklık tepkisi nedeniyle izleyiciyi bağlayabilir. Enjeksiyon bölgesinin yakınlığı omurilik analizini etkileyebilir; Bu nedenle, burada açıklanan uygulama için göğüste enjeksiyonlar tercih edilir.
Kullanılan görüntü analiz teknikleri CNS görüntülemeye özgüdür. Görüntü analiz yazılımı içindeki bir beyin atlası aracı, PET ve CT kaydı doğru olduğu sürece tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar verir. Yarı otomatik 3D beyin atlasını kullanmak ve her farenin kafatasına uyacak şekilde ayarlamak, hayvanlar arasında tutarlı yatırım getirisi sağlar. Şu anda omuriliklerdeki sinyali analiz etmek için otomatik veya yarı otomatik bir yaklaşım olmadığından, manuel ROI'ler çizilmelidir. Özellikle, CD19 + B hücrelerini (veya hem kemik iliğinde hem de omurilikte bulunan herhangi bir hücre tipini) ölçerken, omurga ve kemik iliğinden kaynaklanan sinyali mümkün olduğunca ortadan kaldırmak çok önemlidir. Bunun nedeni, saf farelerin kemik iliğinde, B hücrelerinin CNS 5,11'e sızmak için çevreyi terk ettiği EAE farelerinden daha fazla CD19 + B hücresi içerdiğinin bilinmesidir. Bu kemik iliği sinyali, omurilikteki gerçek sinyali gizleyebilir.
Omurga ve kemik iliğinden gelen sinyalin katkısını en aza indirirken gerçek omurilik sinyalini tanımlamak için, BT görüntüsünün Otsu eşiklemesi, omurga için değişmez bir ROI oluşturmak için kullanılabilir. Ayrı bir omurilik ROI'si daha sonra omurga içinde kolayca çizilebilir. Aynı teknik, uyluk kemiğindeki kemik iliğini ölçmek için de uygulanabilir. Bu, omurilikteki izleyici bağlanması hakkında bilgi edinmek için çok yararlı bir yöntemdir. Bununla birlikte, PET'in nispeten düşük uzamsal çözünürlüğü ve farelerin küçük anatomik bölgelerini tararken kısmi hacim etkisi ile ilgili sorunlar nedeniyle, ek ex vivo doğrulayıcı tekniklerin (örneğin, gama sayımı, ARG) kullanılması, omurilikte kan, beyin omurilik sıvısı veya omurgadan yayılma sinyali olmadan radyoizleyici bağlanmasının doğrulanmasını sağlar.
Servikal / torasik omurilikteki sinyal, EAE farelerinde hastalığın ciddiyetine ve adaptif immün yanıt sırasında kaç B hücresinin sızdığına bağlı olarak değişme eğilimindedir. Saf farelerin pelvik / spinal kemik iliğindekilere kıyasla CNS'deki az miktarda B hücresinin yanı sıra sızan B hücrelerinin sayısındaki bu varyasyon, farelerde omurilik dokusunun in vivo kantitasyonunu zorlaştırabilir. Küçük hayvan görüntülemede PET'in uzamsal çözünürlüğü göz önüne alındığında, kemik iliğinden gelen sinyal omurilik sinyaline yayılabilir. Burada tamamlanan ex vivo biyodağılım ve otoradyografi, omurların omurilik dokusuna karşı PET sinyalinin doğrulanmasına yardımcı olur. Fareler, kan havuzundaki herhangi bir bağlanmamış izleyiciyi çıkarmak için diseksiyondan önce perfüze edilir, böylece gama sayımı ve otoradyografi sonuçları, o organdaki kan havuzundaki izleyiciden ziyade her organda gerçekten bağlı olan izleyiciyi yansıtır.
Radyoizleyiciler kanda dolaşır ve antikor izleyicileri ile, özellikle, ilk enjeksiyondan sonra haftalarca kanda genellikle bağlanmamış radyoizleyici bulunur. Birçok kan damarına sahip olan beyni ve omuriliği görüntülediğimiz için, sinyalin hangi kısmının gerçekten kan havuzunda bulunana karşı ilgilenilen beyin/dokudaki izleyici bağlanmasından kaynaklandığını anlamak önemlidir. Bu nedenle beyin sinyalini kalp/kan havuzundaki sinyale bölmek gerekir. Klinik ortamda, omurların Otsu eşiklemesi ve omurilik dokularının ROI'leri ile aynı görüntü analiz teknikleri miktar tayini için kullanılabilir. İnsanlarda farelere kıyasla daha büyük doku hacimleri göz önüne alındığında, kısmi hacim etkilerinden önemli ölçüde daha az etki olmalıdır, bu da doğruluğun artmasına ve in vivo bulguları doğrulamak için ex vivo tekniklere olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Klinikte PET kullanımı, klinisyenlerin bireysel B hücresi yüküne bağlı olarak her hasta için tedaviyi kişiselleştirmesine olanak tanıyacaktır.
ARG, beyin sapı ve beyincik gibi küçük bölgelerde izleyici bağlanmanın uzamsal konumunun daha doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için özellikle yararlıdır. Aynı kesitler ve/veya bitişik kesitler, B hücrelerinin varlığını doğrulamak için immünohistokimyasal boyalar için kaydedilebilir. Daha önce CNS dokularını CD45R/B220 (Ek Şekil S1) ile boyayarak B hücrelerinin sayısını PET ve ARG sinyali 5,9 ile ilişkilendirmiştik. Boyama daha sonra radyoizleyici sinyalinin boyama modeliyle eşleştiğini doğrulamak için ARG sonuçlarıyla uzamsal olarak karşılaştırılabilir. B hücreleri, beyin sapı boyunca kümeler halinde veya yaygın olarak bulunabilir; PET duyarlılığı, sinyali ölçmek için yeterince yüksektir, bu da klinik çeviri için cesaret vericidir. Omurilik ARG için, omuriliğin omurlardan çıkarılması, ölçülen sinyalin kemik iliği ve/veya kandan ziyade omurilik dokusundaki izleyici bağlanmasından kaynaklanmasını sağlar ve bu da kısmi hacim etkileri nedeniyle PET görüntülerini gizleyebilir.
ARG'ye benzer şekilde, ex vivo gama sayımı, tek tek organlarda radyoaktif sinyalin ölçülmesini sağlar. Bu özel teknik için, tüpleri gama sayacına yerleştirmeden önce dokuların ıslak ağırlığını ölçmek ve ilgili tüplerinin dibinde olduklarından emin olmak önemlidir. Tüpler, doğru tüpün kullanılması için fare numarası ve dokusu ile etiketlenmelidir; Tüp daha sonra kalibre edilmiş bir terazide tartılır ve organlar bir mikrogramın en yakın onda birine (0.0001 mg) yerleştirilir. Bazı dokular son derece küçüktür ve öncesi ve sonrası tüp kütlesindeki fark 0.0001 mg mertebesinde olacaktır. Nem kaybını önlemek için dokular diseksiyondan hemen sonra tartılmalıdır, bu da daha düşük bir kütle ile sonuçlanır. Tartıldıktan sonra, bu dokular ARG için dondurulmadan önce kurumasını önlemek için beyin ve omurilik tüpleri PBS ile doldurulmalıdır.

MS, bağışıklık aracılı nörolojik bir bozukluktur; Her hastadaki benzersiz sunum, hem hastalar hem de klinisyenler için yönetimi zorlaştırabilir1. Hastalığın kendisi, beyinde ve omurilikte demiyelinizan lezyonların ve immün hücre infiltrasyonunun varlığı ile karakterizedir, bu da fiziksel ve bilişsel bozulmaya neden olur2. MS'in T hücresi aracılı bir hastalık olduğu geleneksel paradigma, ilk olarak, B hücrelerinin CD20 + alt kümesini hedef alan bir tedavi olan rituksimab3'ün dönüm noktası niteliğindeki bir faz II klinik çalışmasında sorgulandı. O zamandan beri, hem tanısal hem de terapötik olarak avantajlı olabilen, daha geniş bir B hücresi aralığında eksprese edilen bir pan B hücresi biyobelirteci olan CD194'ü hedefleyen ek B hücre tedavileri geliştirilmiştir. Ayrıca, tedavi etkinliğini değerlendirmek için mevcut yöntemler (yani, nüks sayısının ve manyetik rezonans görüntüleme [MRI] aktivitesinin izlenmesi) erken yanıt ölçümlerini sağlamaz - bu nedenle hastaları yetersiz tedavi seçimi ve optimizasyonu nedeniyle önemli CNS hasarı riskine sokar. Bu nedenle, MS hastalarının CNS ve çevresinde CD19 + B hücreleri gibi spesifik bağışıklık hücrelerini gerçek zamanlı olarak izlemek için stratejilere kritik bir ihtiyaç vardır.
PET görüntüleme, CD19 gibi belirli bir ilgilenilen hedefin in vivo, tüm vücut görselleştirmesine izin veren sağlam bir görüntüleme tekniğidir. Kan alımları, nüks oranlarının kayıtları ve MRI yoluyla lezyon izleme, tedavi etkinliğine ilişkin anlık görüntüler sağlarken, PET görüntüleme, araştırmacıların ve klinisyenlerin bir tedavinin tüm vücuttaki etkinliğini izlemesine izin verebilir. Terapötik izlemeye yönelik bu proaktif yaklaşım, klinisyenlerin ilaç etkinliğini gerçek zamanlı olarak değerlendirmesine olanak tanıyarak gerektiğinde hızlı ayarlamalar yapılmasını sağlar. Hastalıkla ilişkili hücre popülasyonlarının yerinin ve yoğunluğunun izlenmesi, hastaya özgü anatomik bilgileri kullanarak şiddetin uzunlamasına değerlendirilmesine de izin verir. Bu nedenle, klinik ve klinik öncesi ortamlarda PET görüntülemenin tüm potansiyelini güvenilir bir şekilde kullanmak için tekrarlanabilir analitik yöntemler oluşturmak esastır.
Bu makale, insan rekombinant miyelin oligodendrosit glikoprotein 1-125 (MOG 1-125). Ayrıca, her ikisi de bu ve diğer nörodejeneratif modellerde sıklıkla ciddi şekilde etkilenen kritik patogenez bölgeleri olan beyin ve omurilikte radyoizleyici bağlanmasını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirmek için yöntemler sunuyoruz. Bu teknikler, hastalık patolojisinde B hücrelerinin rolünün invaziv olmayan bir şekilde araştırılmasına izin verir ve MS'de anti-B hücre tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek için klinik olarak çevrilme potansiyeline sahiptir.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL 50 kDa MWCO Santrifüj filtre</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>santrifüj filtre</td></tr><tr><td>64Cu-CuCl3</td><td>Washington Üniversitesi, St. Louis; Wisonsin Üniversitesi, Madison; veya başka bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AR-2000 Radio-TLC Görüntüleme Tarayıcısı</td><td>Eckert & Ziegler</td><td>AR-2000</td><td></td></tr><tr><td>Otoradyografi kaseti</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>Alüminyum, 8 "x 10"</td></tr> <tr><td>Otoradyografi</td> <td>filmi&nbsp; GE Yaşam Bilimleri</td><td>28-9564-78</td><td>Depolama Fosforlu Ekran BAS-IP SR 2025 E Süper Çözünürlük, 20 x 25 cm, yalnızca ekran</td></tr><tr><td>Kelebek İğneli Kateter</td><td>SAI İnfüzyon Teknolojileri</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-ester</td><td>Makrosiklikler</td><td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>EAE İndüksiyon Kiti</td><td>Hooke Laboratuvarları</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>Geiger Sayacı</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>GNEXT PET / CT Tarayıcı</td><td>Sofie</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Hidex Otomatik Gama Sayacı</td><td>Hidex</td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Sütun</td><td>Phenomenex</td><td>&nbsp; 00H-2146-K0</td><td>5 &mu; m SEC-s3000 400 &, 300 x 7,8 mm</td></tr><tr><td>Illustra NAP-5 sütunu</td><td>Cytiva</td><td>17085301</td><td>DNA yerçekimi sütunu</td></tr><tr><td>Resim: J</td><td>NIH</td><td></td><td>ARG analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Düşük Protein Bağlayıcı Toplama Tüpleri (1,5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>840281400 UV-Vis mikro/nano spektrofotometre</td></tr><tr><td>PCR tüpleri 0.2 mL, DNA sınıfı</td><td>için Eppendorf</td><td>30124707</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon fosfor görüntüleyici 9410</td><td>GE Sağlık Hizmetleri</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>Sürüm 4 Yama 3</td><td>PET Analiz Yazılımı; Beyin atlası eklentisi satın alınmalıdır</td></tr><tr><td>Zeba Spin Tuz Giderme Kolonları, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>Tuz Giderme sütunu</td></tr></tbody></table>

pozitron emisyon tomografisi kullanılarak deneysel otoimmün ensefalomiyelit fare modelinde cd19+ b hücrelerinin görüntülenmesi

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

Multipl skleroz (MS), genç erişkinleri etkileyen en yaygın demiyelinizan merkezi sinir sistemi (MSS) hastalığıdır ve genellikle hastalık ilerledikçe nörolojik defisitlere ve sakatlığa neden olur. B lenfositleri MS patolojisinde karmaşık ve kritik bir rol oynar ve klinik çalışmalarda çeşitli terapötiklerin hedefidir. Şu anda, spesifik anti-B hücre tedavileri için hastaları doğru bir şekilde seçmenin veya bu tedavilerin CNS ve periferik organlardaki B hücre yükü üzerindeki etkilerini invaziv olmayan bir şekilde ölçmenin bir yolu yoktur. Pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme, canlı deneklerde B hücrelerinin in vivo uzay-zamansal dağılımı ve yükü hakkında oldukça spesifik, nicel bilgi sağlama konusunda muazzam bir potansiyele sahiptir.
Bu makale, insan rekombinant miyelin oligodendrosit glikoprotein 1-125 ile indüklenen MS'in iyi kurulmuş bir B hücresi güdümlü fare modelinde, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) insan CD19+ B hücrelerine özgü bir PET izleyiciyi sentezleme ve kullanma yöntemlerini bildirmektedir. Burada açıklananlar, in vivo PET görüntüleme kullanılarak beyin ve omurilikteki CD19+ B hücrelerini tespit etmek ve ölçmek için optimize edilmiş tekniklerdir. Ek olarak, bu makale, kemik iliği, omurilik ve dalak dahil olmak üzere hastalıkla ilgili organların ex vivo gama sayımı için kolaylaştırılmış yöntemleri ve CNS dokularında CD19 izleyici bağlanmasının yüksek çözünürlüklü otoradyografisini bildirmektedir.

HC19-mAb, Şekil 2'de gösterildiği gibi DOTA konjuge edildi ve 64Cu ile radyoaktif etiketlendi. EAE ve saf farelere 64Cu-DOTA-hCD19-mAb enjeksiyonundan 18-24 saat sonra PET/BT taraması yapıldı (Şekil 3). PET/CT görüntüleri, PET analiz yazılımı kullanılarak birlikte kaydedildi ve CNS dokuları, manuel ROI'ler veya yarı otomatik bir 3D beyin atlası kullanılarak analiz edildi. ROI'lerde radyoizleyici bağlanması (Şekil 4) EAE farelerinde saf farelere göre daha yüksekti. Ex vivo gama sayımı ve ARG, EAE farelerinin omuriliğinde (hem lomber hem de servikal torasik segmentler) ve beyninde (sadece ARG) naif farelere kıyasla artmış bağlanma gösterdi (Şekil 5 ve Şekil 6). Perfüze farelerin ex vivo gama sayımı, dalak, femur ve kemik iliği dahil olmak üzere periferik organlarda radyoizleyici bağlanmasının azaldığını gösterdi (Şekil 5), bu EAE modelinde çevreyi terk eden ve CNS'ye sızan B hücreleri ile tutarlı.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg"> Şekil 2: Kalite kontrol verilerine ek olarak 64 Cu etiketli insana özgü CD19 monoklonal antikor, 16C4-TM mAb (64 Cu-DOTA-hCD19-mAb) üretmek için konjugasyon ve radyoetiketleme şeması. (A) DOTA-NHS-esterin hCD19-DOTA konjugatı (ölçek değil) üretmek için hCD19 monoklonal antikoru ile reaksiyonu ve 64Cu-DOTA-hCD19-mAb üretmek için 64Cu-CuCl3 ile radyo-etiketleme. (B) Temsili ITLC kromatografı. 40-60 cm'deki zirve, radyoaktif işaretli antikordur; bağlanmamış 64Cu-CuCl3 mobil faz ile hareket eder ve 200 ila 240 cm arasında mevcut olacaktır. Bu kromatografta saptanabilir serbest 64Cu-CuCl3 yoktur. (C) Radyoaktif işaretli antikorun kalite kontrol özellikleri. Kısaltmalar: DOTA-NHS ester = 1,4,7,10-Tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetik asit mono-N-hidroksisüksinimid ester; ITLC / HPLC = anlık ince tabaka kromatografisi / yüksek performanslı sıvı kromatografisi; MALDI/LC-MS = matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon/sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi; BGBM = dakikadaki sayım. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg"> Şekil 3: Hareketi en aza indirirken omurilik ve beynin yüksek kalitede görüntülenmesini sağlamak için PET tarayıcı içinde 3D baskılı bir yatakta farelerin nasıl sabitleneceğini gösteren fotoğraflar. (A) Isıtma elemanları ve anestezi tüpü ile donatılmış 3D baskılı dört fareli tarayıcı yatağı ("fare oteli" olarak da bilinir). (B) Omurganın düzlüğünü en üst düzeye çıkarmak için sırtüstü pozisyonda anestezi uygulanmış fareler; Her farenin yatak konumu kaydedilir. (C) Fareler, beyindeki hareketi en aza indirmek için başlarına ve nefes alma hareketini en aza indirmek için göbek boyunca güvenli bir şekilde bantlanmıştır. (D) Fare yatağı tarayıcının içine yerleştirilmiş ve tarama yatağına bantlanmıştır. Anestezi tüpü tarayıcıdan yatağa bağlandı ve izofluran %2'ye ayarlandı. Tarayıcı kapağını kapatmadan önce uygun izofluran seviyesini sağlamak için fare solunumu izlendi. Kısaltma: PET = Pozitron emisyon tomografisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg"> Şekil 4: PET analiz yazılımı kullanılarak omurilik görüntüsü ve beyin analizi ve sonuçları. (A) i) Lomber torasik ve servikal vertebralardan ayırmak ve Otsu eşiklemesi için görüntü hazırlamak için omurgaya çizilen ROI'ler (pembe ve ten rengi). ii ) Spinal omurlar (turkuaz ve kırmızı) Otsu Eşikleme kullanılarak bölümlere ayrıldı. iii ) Omurlar daha sonra 3D ROI menüsünde değişmez hale getirildi ve omurilik servikal/torasik (mor) ve lomber (lacivert) ROI'lere bölündü. iv) Vertebra ROI'si çıkarıldı, omurilik ROI'leri ve temsili beyin atlası uygulandı. (B) Her bir hayvandaki kalbin yatırım getirisine normalize edilmiş %ID/g olarak temsil edilen çeşitli CNS bölgelerinden elde edilen PET sonuçlarının temsili analizi. PET edinimi, PET/CT görüntüleme ile 10 dakikalık bir statik taramaydı. Beyin bölgeleri, panel A'da gösterilen yarı otomatik bir beyin atlası yaklaşımı kullanılarak ölçülmüştür. iv) Temsili sonuçlar, beyinde ve torasik omurilikte izleyici bağlanmasında önemli bir artışa doğru önem veya eğilim göstermektedir. İstatistikler Student t-testi kullanılarak yapılmıştır (*: p &lt; 0.0332). Kısaltmalar: PET = Pozitron emisyon tomografisi; ROI'ler = ilgi alanları; CNS = merkezi sinir sistemi; BT = bilgisayarlı tomografi; %ID/g = doku gramı başına enjekte edilen doz yüzdesi; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg"> Şekil 5: EAE'de ve saf farelerde çeşitli organlarda ex vivo gama sayımının temsili miktar tayini% ID/g olarak ifade edilir. PET taraması sonrası, fareler, kanda bulunan radyoizleyiciyi serbest veya kanda yerleşik CD19 + B hücrelerine bağlı olarak çıkarmak için PBS ile perfüze edildi ve organlar, her organın doğru bir ağırlığına sahip olacak şekilde hızla diseke edildi ve tartıldı. EAE farelerinde dalak ve kemik iliğinde izleyici bağlanması, naif farelere göre önemli ölçüde azalmıştır. EAE farelerinin hem lomber hem de servikal/torasik omurilik segmentlerinde artmış radyoizleyici bağlanması gözlenir. Beyin, radyoizleyici sinyalinde önemli bir artış göstermez, ancak önemli bir artışa doğru eğilim göstermektedir. İstatistikler Student t-testi kullanılarak yapılmıştır (*: p &lt; 0.0332; ****: p &lt; 0.0001). Kısaltmalar: PET = Pozitron emisyon tomografisi; %ID/g = doku gramı başına enjekte edilen doz yüzdesi; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit; PBS = fosfat tamponlu salin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg"> Şekil 6: Ex vivo ARG görüntüleri, naif farelerle karşılaştırıldığında EAE'den sagital beyin kesitlerinde ve tüm omuriliklerde 64Cu-DOTA-hCD19-mAb bağlanmasını göstermektedir. Dijital fosfor depolama filmleri, yaklaşık 10 yarı ömür (127 saat veya 5 gün) boyunca radyoaktif doku örneklerine maruz bırakıldıktan sonra bir fosfor görüntüleyici kullanılarak tarandı. Elde edilen görüntüler, EAE farelerinin beyninde, bu modelde B hücreleri içerdiği bilinen bölgeler nedeniyle beklenen saf farelerden alınan beyin bölümlerine kıyasla görsel olarak daha yüksek sinyal ortaya koymaktadır5. Spesifik olarak, EAE fare beyin bölümlerinin beyin sapı, beyincik ve ventriküllerinde artmış izleyici sinyali vardır. EAE fare beyin bölümleri için sinyaldeki bu artış, yukarıda ayrıntıları verilen tüm beyin PET nicelemesinde bulunanları yansıtmaktadır. Benzer şekilde, hem servikal/torasik hem de lomber omurilik segmentlerinde, naif omuriliklere kıyasla radyoizleyici bağlanmasında bir artış vardır, bu da ex vivo gama sayımı kullanılarak bulunanları yansıtır. Kısaltmalar: PET = Pozitron emisyon tomografisi; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit; Havalandırma = ventriküller; Cb = beyincik; BS = beyin sapı; TSc = torasik ve servikal omurilikler birleşik; LSc = lomber omurilik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Naif ve EAE fare beyin dokusunun CNS dokularının CD45R/B220 ile boyanması. B hücreleri, EAE farelerinin beyin sapı, meninksleri ve beyaz cevherinde gözlenir (n = 7 EAE, n = 5 saf fare, hayvan başına ortalama dört dilim). Bu rakam 5'ten. Ölçek çubukları = sagital beyin görüntülerinde 5 mm (düşük büyütme [1x]), beyin sapı, meninksler ve serebellar beyaz cevherde 100 μm (yüksek büyütme [20x]). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl%20Fig%201.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu makale, insana özgü bir anti-CD19 monoklonal antikorun radyo-etiketlenmesi için metodolojiyi ve bunun in vivo PET görüntüleme, ex vivo gama sayımı ve otoradyografi yaklaşımlarını kullanarak bir fare multipl skleroz modelinin periferik dokularındaki B hücrelerini ölçmek için nasıl kullanılacağını detaylandırmaktadır.

Pozitron Emisyon Tomografisi Kullanılarak Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Fare Modelinde CD19+ B Hücrelerinin Görüntülenmesi

Multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating central nervous system (CNS) disease affecting young adults, often resulting in neurological ...

Bu teknik, merkezi sinir sistemindeki B hücrelerinin in vivo dağılımını ve dinamiklerini aydınlatmak için PET görüntülemeyi kullanır. Yaklaşımımız, etkilenen omuriliğin analizi daha zor hale getirdiği nörolojik hastalıkları incelemek için faydalıdır. Yani tekniğimizin birkaç ana avantajı var.İlk olarak, bir dizi B hücresi alt kümesini yakalamamıza ve bunları in vivo olarak görselleştirmemize olanak tanıyan bir pan B hücresi biyobelirtecini izlemek için yeni bir araç oluşturduk. İkinci olarak, omurilik analiz yöntemimiz bu bölgedeki PET sinyallerinin son derece doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini sağlar. Tekniğimizle ilgili en güzel şey, hastalıktan bağımsız olmasıdır.B hücrelerinin ve/veya omuriliğin ilgilendiği herhangi bir senaryoda klinik öncesi PET görüntülemeden klinik görüntülemeye kadar kullanılabilir. Radyo-etiketleme ve antikorun fareye enjekte edilmesinden 18 ila 24 saat sonra, gözlere göz jeli uygulayarak fareyi taramaya hazırlayın. Dört fareli tarama yatağının %1,5 ila %2 arasında ayarlanmış izofluranlı bir ısıtma yastığı ile donatıldığından emin olun Fareyi tarama yatağına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve omurgayı düzeltmek için fare kuyruğunu hafifçe çekin.Fare sırtüstü pozisyondayken, nefes alma hareketini en aza indirmek için yumuşak mikroskop bandı ile başın ve karnın üzerine güvenli bir şekilde bantlayın. Laboratuar not defterinde her fare için tarama konumunun kaydını yapın. İlk grubu sabitledikten sonra yatağı kapatın ve bir BT taraması yaparak yatağın yerleşimini kontrol edin.CT Merkezi Görüş Alanı'na tıklayın ve yatak yerine oturduktan sonra, yerleşimin doğru olduğundan emin olmak için CT test taramasını çalıştırın. Yatak pozisyonu tatmin edici olana kadar tekrarlayın. Çalışmanın geri kalanında doğru yatak yerleşimini işaretlemek için tarayıcı yatağına küçük beyaz bir bant yerleştirin.Hareket Denetleyicisi menüsünü açın ve fareleri PET halkasına taşımak için PET Merkezi Görüş Alanı'na tıklayın. Yatak PET halkasına girdikten sonra, Çalıştır'a tıklayarak tarama sırasını başlatın ve tarayıcının PET taramasını otomatik olarak tamamlamasını bekleyin ve CT alımı için PET halkasından CT'ye geçin. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit veya EAE, fareler hastalığın ilerlemesi nedeniyle omurganın eğriliğini belirgin hale getirdiğinden, sırtlarında iken onları taramak omurgayı düzeltmeye yardımcı olur.Hayvanın sırt tarafında bir kesi yapın ve omurgayı ortaya çıkarmak için deriyi ve kürkü çıkarın. Beli servikal ve torasik bölgelerden ayırmak için boyundaki omurga boyunca, doğrudan göğüs kafesinin altında ve pelvisin tepesinde üç enine düzlem boyunca kesin. Lomber ve servikal torasik olmak üzere iki parça elde etmek için segmentli omurgayı dikkatlice çıkarın.Ardından, lomber omurilik görünene kadar omurgayı pelvik uçtan dikkatlice keserek lomber omurgayı izole edin. Lomber omuriliği çıkarmak için, PBS ile doldurulmuş kayar uçlu bir şırınga kullanın ve başparmak ve işaret parmağını kullanarak şırınga ile omurga arasında bir conta oluşturun. Omuriliği emici bir ped üzerine çıkarmak için PBS'yi şırınganın içinden yavaşça itin ve şırıngayı servikal taraftan sokarak servikal torasik omurilik için tekrarlayın.Omurilik dokularını bir gama sayma tüpüne yerleştirin. Kuru ağırlığı kaydedin ve kurumayı önlemek için dokunun tüpün dibinde olduğundan emin olmak için PBS ekleyin. Saymaya hazır olana kadar tüpü buzun üzerine yerleştirin.Omurilikteki ilgi bölgelerinin analizine başlamak için, Gezinme menüsünden 3B İlgi Bölgesi Aracı'nı açın. İlgi Bölgeleri başlığının altında, altı ilgi alanı oluşturmak için menünün altındaki artı işaretini kullanın: ilgilenilen lomber bölge, servikal torasik ilgilenilen bölge, lomber iskelet, torasik iskelet, lomber omurilik, torasik omurilik. PET sinyalinden kaynaklanan görsel paraziti önlemek için, PET'i kapatmak için F3'e tıklayın.3B İlgi Bölgesi Araç Operatörü'nün en üstüne gidin ve 3B Boyama Modu ve Aşındır/Genişlet menüsünü açmak için imleç sembolünün sağındaki düz noktaya tıklayın. Küre'yi seçin ve boyutu 20 piksel olarak değiştirin. Aynı şekilde, genişlemeyi artı beşe ayarlayın.Daha fazla ilerlemeden önce, menünün en altına gidin ve ilgilenilen bel bölgesinin seçildiğinden emin olun. BT'de, omurganın L6 omurunu bulun. L6'nın üzerinde bir omurdan başlayarak, kalçaların üzerindeki beş omurun üzerine kaba bir bel bölgesi çizin.Daha sonra ilgilenilen servikal torasik bölgeye geçin ve omurganın geri kalanını kafatasının tabanına kadar takip edin. Genelleştirilmiş ilgi alanlarını çizdikten sonra, operatörün en üstüne gidin ve Segmentasyon Algoritmaları menüsünü seçin. Açılır menüden Otsu Thresholding'i seçin, ardından giriş için ilgilenilen bel bölgesini seçin ve menünün alt kısmında lomber iskeletin seçildiğinden emin olun.Görüntü'nün yanındaki açılır menüde, burada sıfır rakamıyla gösterilen CT taramasının seçili olduğundan emin olun. Uygula'ya tıklayın ve ilgilenilen servikal torasik bölge ve torasik iskelet için prosedürü tekrarlayın. İlgilenilen iskelet bölgelerini oluşturmak için Otsu Thresholding'i kullandıktan sonra, Gezinme menüsüne dönün ve ilgilenilen bölgeyi silin veya gizlemek için ilgilenilen hem kaba lomber hem de servikal torasik bölgeler için H sütununu işaretleyin.İlgilenilen her iki iskelet bölgesi için I sütununu işaretleyin, böylece düzenlenemezler. Son olarak, 3B İlgi Alanı Araç Operatörü'nün en üstüne dönün ve ilgilenilen omurilik bölgelerini çizmek için 3B Boyama menüsüne gidin. Küre aracını tekrar seçin ve hem bel hem de göğüs için iskelet içindeki omuriliği takip ederek menünün alt kısmında doğru ilgi bölgesinin seçildiğinden emin olun.İlgilendiğiniz herhangi bir bölgeyi silmek için Komut/Kontrol'e tıklayın ve silinecek parçanın üzerine çizin. Omurganın dışında herhangi bir ilgi bölgesinin çizilmediğinden emin olmak için her üç düzlemden de ilgilenilen omurilik bölgesini kontrol edin. PET sinyali kapatıldıysa, PET'i tekrar açmak için ilgilenilen omurilik bölgeleri çizildikten sonra F3 tuşuna basın veya Görsel Denetleyiciyi seçin ve PET çubuğuna tıklayın.Gezinme menüsüne geri dönün. Tabloyu göstermek için Izgara simgesine tıklayın. Tabloyu elektronik tablo yazılımına kopyalayın ve dosyayı kaydedin.PET görüntüleme, EAE farelerinin beyin ve torasik omuriliğinde naif farelere kıyasla artmış radyoizleyici bağlanmasını ortaya çıkardı. Ex vivo gama sayımı, hem lomber hem de servikal torasik spinal segmentlerde ve EAE farelerinin beyninde naif farelere kıyasla artmış bağlanma gösterdi. Ex vivo otoradyografi görüntüleri, sagital beyin bölümlerinde, özellikle EAE farelerinin beyin sapı, beyincik ve ventriküllerinde, saf farelere kıyasla artmış radyoizleyici bağlanması gösterdi.Benzer şekilde, EAE farelerinin hem servikal torasik hem de lomber omurilik segmentlerinde naif omuriliklere kıyasla artmış bir radyoizleyici bağlanması gözlenmiştir. PET görüntüleme ve gama sayımından sonra, PET sinyali ile ilgilenilen hedef arasındaki ilişkiyi akım sitometrisi ve immünohistokimya gibi moleküler biyoloji teknikleri ile araştırabiliriz. Tekniğimiz, araştırmacıların inme, multipl skleroz, diğer otoimmün hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere birçok hastalık alanında B hücrelerinin in vivo rolü hakkında sorular sormalarının yolunu açtı.

imaging-cd19-b-cells-an-experimental-autoimmune-encephalomyelitis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, miyelin oligodendrosit glikoproteinleri ve inaktive edilmiş Mycobacterium tuberculosis'in bir kombinasyonunu enjekte ederek bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelit indüksiyonunu göstermektedir. Model, araştırmacıların hastalık mekanizmalarını incelemelerine ve terapötik müdahaleleri test etmelerine olanak tanır.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit İndüksiyonu

Bu video, beyne göç eden otoreaktif T hücrelerini aktive etmek için miyelin türevi peptitleri bir adjuvan ile enjekte ederek deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indükleme yöntemini göstermektedir. Boğmaca toksini, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için uygulanır ve bu T hücrelerinin ve diğer bağışıklık hücrelerinin beyne girmesine izin verir. Bu bağışıklık hücreleri demiyelinizasyona neden olarak sinir iletiminin bozulmasına ve EAE gelişimine yol açar.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Oluşumu

Bu videoda, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) kullanılarak multipl sklerozun bir fare modeli oluşturulmuştur. Fareye, otoreaktif T hücrelerini aktive eden bir bağışıklık tepkisini tetikleyen bir nöronal peptit ve bir adjuvan içeren bir emülsiyon enjekte edilir. Bunu, otoreaktif T hücrelerinin beyne sızmasına izin vererek kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için bir boğmaca toksini (PTX) enjeksiyonu takip eder. Bu infiltrasyon, multipl sklerozun demiyelinizan durumunu taklit ederek...

Bu makale, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modelinin indüksiyon ve skorlama yöntemlerini, çeşitli hastalık evrelerinde sırasıyla akış sitometrisi ve kantitatif PCR kullanılarak lenf düğümleri, dalak, kan ve omurilikteki immün hücre dağılımı ve mRNA sitokin seviyelerinin değerlendirilmesi ile birlikte açıklamaktadır.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Biz, in vivo canlı biyolüminesans ve yakın kızılötesi SJL / J farelerinde multipl skleroz için deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) modelinde optik nevrit ve ensefalit görüntüleme tekniğini göstermektedir.

Farelerde Multipl Skleroz EAE Modeli Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Biyoparlaklık ve Yakın-Kızılötesi Görüntüleme

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Bu protokol, multipl sklerozun bir hayvan modelinde pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme ile in vivo miyelin değişikliklerini (demiyelinasyon ve remiyelinasyon) izlemeyi amaçlamaktadır.

Multipl Sklerozun Lysolecithin Rat Modelinde Miyelin İçeriğinin In Vivo Ölçümü için Pozitron Emisyon Tomografi Görüntüleme

Bu protokol, klinik olarak mevcut bir platformla kimerik antijen reseptörlerini in vivo olarak eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücrelerini invaziv olmayan bir şekilde izleme metodolojisini açıklamaktadır.

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Öğrenin, deneysel otoimmün ensefalomiyelit fare modelinde PET görüntüleme ile CD19+ B hücrelerinin dağılımını ve dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, merkezi sinir sistemi hastalıklarında B hücre davranışlarını yüksek doğrulukla nicelendirmeyi sağlar.

Pozitron Emisyon Tomografisi Kullanılarak Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Fare Modelinde CD19⁺ B Hücrelerinin Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet