Pozitron Emisyon Tomografisi Kullanılarak Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Fare Modelinde CD19⁺ B Hücrelerinin Görüntülenmesi

Bu makale, insana özgü bir anti-CD19 monoklonal antikorun radyo-etiketlenmesi için metodolojiyi ve bunun in vivo PET görüntüleme, ex vivo gama sayımı ve otoradyografi yaklaşımlarını kullanarak bir fare multipl skleroz modelinin periferik dokularındaki B hücrelerini ölçmek için nasıl kullanılacağını detaylandırmaktadır.

Bu teknik, merkezi sinir sistemindeki B hücrelerinin in vivo dağılımını ve dinamiklerini aydınlatmak için PET görüntülemeyi kullanır. Yaklaşımımız, etkilenen omuriliğin analizi daha zor hale getirdiği nörolojik hastalıkları incelemek için faydalıdır. Yani tekniğimizin birkaç ana avantajı var.

İlk olarak, bir dizi B hücresi alt kümesini yakalamamıza ve bunları in vivo olarak görselleştirmemize olanak tanıyan bir pan B hücresi biyobelirtecini izlemek için yeni bir araç oluşturduk. İkinci olarak, omurilik analiz yöntemimiz bu bölgedeki PET sinyallerinin son derece doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini sağlar. Tekniğimizle ilgili en güzel şey, hastalıktan bağımsız olmasıdır.

B hücrelerinin ve/veya omuriliğin ilgilendiği herhangi bir senaryoda klinik öncesi PET görüntülemeden klinik görüntülemeye kadar kullanılabilir. Radyo-etiketleme ve antikorun fareye enjekte edilmesinden 18 ila 24 saat sonra, gözlere göz jeli uygulayarak fareyi taramaya hazırlayın. Dört fareli tarama yatağının %1,5 ila %2 arasında ayarlanmış izofluranlı bir ısıtma yastığı ile donatıldığından emin olun Fareyi tarama yatağına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve omurgayı düzeltmek için fare kuyruğunu hafifçe çekin.

Fare sırtüstü pozisyondayken, nefes alma hareketini en aza indirmek için yumuşak mikroskop bandı ile başın ve karnın üzerine güvenli bir şekilde bantlayın. Laboratuar not defterinde her fare için tarama konumunun kaydını yapın. İlk grubu sabitledikten sonra yatağı kapatın ve bir BT taraması yaparak yatağın yerleşimini kontrol edin.

CT Merkezi Görüş Alanı'na tıklayın ve yatak yerine oturduktan sonra, yerleşimin doğru olduğundan emin olmak için CT test taramasını çalıştırın. Yatak pozisyonu tatmin edici olana kadar tekrarlayın. Çalışmanın geri kalanında doğru yatak yerleşimini işaretlemek için tarayıcı yatağına küçük beyaz bir bant yerleştirin.

Hareket Denetleyicisi menüsünü açın ve fareleri PET halkasına taşımak için PET Merkezi Görüş Alanı'na tıklayın. Yatak PET halkasına girdikten sonra, Çalıştır'a tıklayarak tarama sırasını başlatın ve tarayıcının PET taramasını otomatik olarak tamamlamasını bekleyin ve CT alımı için PET halkasından CT'ye geçin. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit veya EAE, fareler hastalığın ilerlemesi nedeniyle omurganın eğriliğini belirgin hale getirdiğinden, sırtlarında iken onları taramak omurgayı düzeltmeye yardımcı olur.

Hayvanın sırt tarafında bir kesi yapın ve omurgayı ortaya çıkarmak için deriyi ve kürkü çıkarın. Beli servikal ve torasik bölgelerden ayırmak için boyundaki omurga boyunca, doğrudan göğüs kafesinin altında ve pelvisin tepesinde üç enine düzlem boyunca kesin. Lomber ve servikal torasik olmak üzere iki parça elde etmek için segmentli omurgayı dikkatlice çıkarın.

Ardından, lomber omurilik görünene kadar omurgayı pelvik uçtan dikkatlice keserek lomber omurgayı izole edin. Lomber omuriliği çıkarmak için, PBS ile doldurulmuş kayar uçlu bir şırınga kullanın ve başparmak ve işaret parmağını kullanarak şırınga ile omurga arasında bir conta oluşturun. Omuriliği emici bir ped üzerine çıkarmak için PBS'yi şırınganın içinden yavaşça itin ve şırıngayı servikal taraftan sokarak servikal torasik omurilik için tekrarlayın.

Omurilik dokularını bir gama sayma tüpüne yerleştirin. Kuru ağırlığı kaydedin ve kurumayı önlemek için dokunun tüpün dibinde olduğundan emin olmak için PBS ekleyin. Saymaya hazır olana kadar tüpü buzun üzerine yerleştirin.

Omurilikteki ilgi bölgelerinin analizine başlamak için, Gezinme menüsünden 3B İlgi Bölgesi Aracı'nı açın. İlgi Bölgeleri başlığının altında, altı ilgi alanı oluşturmak için menünün altındaki artı işaretini kullanın: ilgilenilen lomber bölge, servikal torasik ilgilenilen bölge, lomber iskelet, torasik iskelet, lomber omurilik, torasik omurilik. PET sinyalinden kaynaklanan görsel paraziti önlemek için, PET'i kapatmak için F3'e tıklayın.

3B İlgi Bölgesi Araç Operatörü'nün en üstüne gidin ve 3B Boyama Modu ve Aşındır/Genişlet menüsünü açmak için imleç sembolünün sağındaki düz noktaya tıklayın. Küre'yi seçin ve boyutu 20 piksel olarak değiştirin. Aynı şekilde, genişlemeyi artı beşe ayarlayın.

Daha fazla ilerlemeden önce, menünün en altına gidin ve ilgilenilen bel bölgesinin seçildiğinden emin olun. BT'de, omurganın L6 omurunu bulun. L6'nın üzerinde bir omurdan başlayarak, kalçaların üzerindeki beş omurun üzerine kaba bir bel bölgesi çizin.

Daha sonra ilgilenilen servikal torasik bölgeye geçin ve omurganın geri kalanını kafatasının tabanına kadar takip edin. Genelleştirilmiş ilgi alanlarını çizdikten sonra, operatörün en üstüne gidin ve Segmentasyon Algoritmaları menüsünü seçin. Açılır menüden Otsu Thresholding'i seçin, ardından giriş için ilgilenilen bel bölgesini seçin ve menünün alt kısmında lomber iskeletin seçildiğinden emin olun.

Görüntü'nün yanındaki açılır menüde, burada sıfır rakamıyla gösterilen CT taramasının seçili olduğundan emin olun. Uygula'ya tıklayın ve ilgilenilen servikal torasik bölge ve torasik iskelet için prosedürü tekrarlayın. İlgilenilen iskelet bölgelerini oluşturmak için Otsu Thresholding'i kullandıktan sonra, Gezinme menüsüne dönün ve ilgilenilen bölgeyi silin veya gizlemek için ilgilenilen hem kaba lomber hem de servikal torasik bölgeler için H sütununu işaretleyin.

İlgilenilen her iki iskelet bölgesi için I sütununu işaretleyin, böylece düzenlenemezler. Son olarak, 3B İlgi Alanı Araç Operatörü'nün en üstüne dönün ve ilgilenilen omurilik bölgelerini çizmek için 3B Boyama menüsüne gidin. Küre aracını tekrar seçin ve hem bel hem de göğüs için iskelet içindeki omuriliği takip ederek menünün alt kısmında doğru ilgi bölgesinin seçildiğinden emin olun.

İlgilendiğiniz herhangi bir bölgeyi silmek için Komut/Kontrol'e tıklayın ve silinecek parçanın üzerine çizin. Omurganın dışında herhangi bir ilgi bölgesinin çizilmediğinden emin olmak için her üç düzlemden de ilgilenilen omurilik bölgesini kontrol edin. PET sinyali kapatıldıysa, PET'i tekrar açmak için ilgilenilen omurilik bölgeleri çizildikten sonra F3 tuşuna basın veya Görsel Denetleyiciyi seçin ve PET çubuğuna tıklayın.

Gezinme menüsüne geri dönün. Tabloyu göstermek için Izgara simgesine tıklayın. Tabloyu elektronik tablo yazılımına kopyalayın ve dosyayı kaydedin.

PET görüntüleme, EAE farelerinin beyin ve torasik omuriliğinde naif farelere kıyasla artmış radyoizleyici bağlanmasını ortaya çıkardı. Ex vivo gama sayımı, hem lomber hem de servikal torasik spinal segmentlerde ve EAE farelerinin beyninde naif farelere kıyasla artmış bağlanma gösterdi. Ex vivo otoradyografi görüntüleri, sagital beyin bölümlerinde, özellikle EAE farelerinin beyin sapı, beyincik ve ventriküllerinde, saf farelere kıyasla artmış radyoizleyici bağlanması gösterdi.

Benzer şekilde, EAE farelerinin hem servikal torasik hem de lomber omurilik segmentlerinde naif omuriliklere kıyasla artmış bir radyoizleyici bağlanması gözlenmiştir. PET görüntüleme ve gama sayımından sonra, PET sinyali ile ilgilenilen hedef arasındaki ilişkiyi akım sitometrisi ve immünohistokimya gibi moleküler biyoloji teknikleri ile araştırabiliriz. Tekniğimiz, araştırmacıların inme, multipl skleroz, diğer otoimmün hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere birçok hastalık alanında B hücrelerinin in vivo rolü hakkında sorular sormalarının yolunu açtı.