Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak Hücre Çekirdeğinde Mutlak DNA Yoğunluğunun Haritalanması
11 Kasım 2025
Mevcut protokol, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu verilerinin, bilinen hacmin, genom boyutunun ve hücre döngüsü aşamasının Voronoi mozaiklemesini kullanarak yapışık hücre çekirdekleri içindeki mutlak DNA yoğunluklarını ölçen bir yöntemi açıklamaktadır.
Mevcut yöntem, hücre çekirdeklerindeki mutlak DNA yoğunluğu ölçümlerinin, aksi takdirde yalnızca translasyon sonrası histon modifikasyonları ile karakterize edilen kromatin yapılarındaki uzamsal kısıtlamaları araştırmasına izin verir. SMLM ile birleştirilmiş Voronoi mozaiklemesi, mikrometre kare başına baz çifti cinsinden DNA'nın mutlak yoğunluk tahminlerine izin verir. İhtiyaç duyulan tek önsel bilgi, ölçülen hücre çekirdeğinin toplam DNA içeriğidir.
Gelecekteki deneylerde, mutlak yoğunluk farklılıklarının, epigenetik modifikasyonların immünofloresansı veya Hi-C verileri gibi diğer yöntemlerden elde edilen biyolojik bilgilerle ilişkili olup olmadığını araştırmak ilginç olacaktır. Önceden kaydedilmiş tek görüntüleri bir araya getirerek taranan alanı yeniden oluşturarak başlayın. CellProfiler'ı açın ve cellcycleanalysis.cpproj işlem hattını yükleyin.
İşlem hattının ilk adım görüntülerinde, başvuru görüntüsü de dahil olmak üzere görüntüleri sürükleyip bırakın. Ardından, referans görüntülerin saklanacağı bir konum tanımlayın. Ardından Test Modunu Başlat simgesine ve ardından Çalıştır'a tıklayın.
Analiz edilecek görüntüdeki çekirdeklerin histogramı görüntülendikten sonra, G1, S ve G2 fazları için yoğunluk aralıklarını belirleyin ve bunların boru hattının sonraki filtre nesnesi adımlarına girildiğinden ve bu adımların aktif olduğundan emin olun. Ardından, ardışık düzenin ikinci yarısına devam etmek için Çalıştır düğmesine tekrar tıklayın. Farklı hücre döngüsü aşamalarını, G1, S veya G2'yi temsil eden kaplamalara sahip üç resme bakın ve daha fazla görüntüleme için G1 veya G2'deki çekirdekleri seçin, böylece görüntü çekirdeklerinin baz çiftlerindeki DNA miktarı bilinir.
Hücreleri tek molekül lokalizasyon mikroskobunda yeniden konumlandırın ve FPALM işleminin uygun şekilde yanıp sönmesini sağlayın. İlk olarak, dilim başına yalnızca 500 kare kullanarak seçilen çekirdeğin 3B yığınını kaydedin. Bu, orta bölümdeki nispi DNA miktarının belirlenmesine izin verir ve daha sonra üst yapısını ortaya çıkarmak için çok daha fazla çerçeve ile görüntülenir.
Görüntü serisi alımına 50 milisaniyelik bir pozlama süresi kullanarak başlayın, bu da saniyede yaklaşık 20 karelik bir kare hızıyla sonuçlanır. 200 nanometre adım aralıkları ve ışık optik bölümü başına yalnızca 500 kare ile çekirdekten bir Z yığını alın. Yığın alındıktan sonra, ilk z konumuna dönün ve aynı 50 milisaniye pozlama süresine sahip 50.000 karelik ana veri setini elde edin.
FPALM veri kümesini ImageJ'de açın. Yanıp sönen sinyallerin algılanmasına yönelik ayarları optimize etmek için ThunderSTORM'a ve ardından Analizi çalıştır'a tıklayın. Şimdi Kamera kurulumunu seçin.
Görüntü verilerinin doğru piksel boyutunu, A/D sayısını, kullanılan kameranın kuantum verimliliğini, temel seviyeyi ve EM kazancını girin ve ardından Tamam'ı tıklatın. Yanıp sönen sinyalleri sığdırarak yerelleştirme koordinatlarını belirlemek için algoritmayı seçin. Görüntü filtreleme bölümünde, B-Spline sırası 3 ve B-Spline ölçeği 2 ile Dalgacık filtresi B-Spline'ı kullanın. Ardından, Moleküllerin yaklaşık lokalizasyonu Yöntemini Yerel maksimum olarak ayarlayın, Tepe yoğunluğu eşiğini ve Bağlantıyı 8 komşuluk olarak ayarlayın.
Moleküllerin alt piksel lokalizasyonu bölümünde, Yöntem olarak PSF tümleşik Gauss'u seçin, Sığdırma yarıçapı px'i 3 olarak ayarlayın, Sığdırma yöntemini Maksimum olasılık olarak seçin ve İlk sigma'yı 1,6 olarak ayarlayın. Sonra tıklayın OK sinyallerin algılanmasını ve görüntünün yeniden oluşturulmasını başlatmak için. Alım farklı görüntü yığınlarına bölünmüşse, yerelleştirme tablolarını ThunderSTORM'da birleştirin.
Bunu yapmak için, açılır pencerede İçe Aktar'a tıklayın. Geçerli tabloya ekle seçeneğinin etkinleştirildiğinden ve tablodaki yerelleştirmelerin geçersiz kılınmasını önlemek için doğru başlangıç numarasının kullanıldığından emin olun. Ardından dosya yolunu seçin ve bir dosyayı birbiri ardına içe aktarmak için Tamam'ı tıklayın.
Ardışık karelerde sinyallerin fazla sayılmasını önlemek için, molekül başına maksimum 20 nanometre mesafe, maksimum 1 kapalı kare ve 0 maksimum kare kullanarak yerelleştirme verilerini birleştirin ve ardından Birleştir'i tıklatın. Veri alt bölümlerini çapraz ilişkilendirerek sapmayı ölçmek ve düzeltmek için Sapma düzeltme menüsünü açın ve okları tıklatın. 3 kutu ekleyin ve Büyütmeyi 5'e ayarlayın.
Ardından Uygula'ya tıklayın, x ve y kaymasını gösteren pencere görünecektir. Her dilim için 500 kare ile önceden kaydedilmiş 3B yığının her dilimindeki DNA içeriğiyle orantılı sinyal miktarını belirlemek için Eklentiler'i, ardından ThunderSTORM'u ve ardından İçe/Dışa Aktar'ı seçin ve yığının ilk dilimi için sonuç tablosunu içe aktarın. 3B yığının diğer görüntü düzlemlerinden gelen sinyallerin aşırı sayılmasını önlemek için, dilimler arasındaki z cinsinden 200 nanometre adım aralığının dışından gelen sinyallerin kaldırılması gerekir.
Histogramı çiz'e basın ve açık Dağıtım iletişim kutusunda z'yi seçin ve Tamam'a basın. Tepe noktasının konumunu belirleyin ve optik adım boyutu 200 nanometre olan sinyalleri seçmek için filtre alanını kullanın. Görselleştirme'ye tıklayın ve Histogramlar seçeneğini seçin, ardından Tamam'a tıklayın. Ortaya çıkan görüntüyü TIFF formatında bir klasöre kaydedin. Tüm dilimleri açın ve Görüntü'yü, ardından Yığınlar'ı ve ardından Yığınlanacak Görüntüler'i kullanarak bunları birleştirin.
Tüm görüntü alanını seçtikten sonra Analiz Et'e gidin, Araçlar'a tıklayın ve ROI Yöneticisi'ni seçin. Ekle'ye tıklayın, ardından Analiz Et'e tıklayın, ardından Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın ve Entegre yoğunluk'u seçin. Şimdi, Daha Fazla seçeneğini seçin, Çoklu Ölçü'yü seçin, Tüm yığınları ölç ve Dilim başına bir satır seçeneğini işaretleyin.
Tamam'a tıkladığınızda sonuçlar görünecektir. Tüm dilimlerin yoğunluklarının toplamı, tüm çekirdeğin DNA içeriği ile orantılıdır, tıpkı tek tek dilimlerin yoğunluklarının tüm genomun fraksiyonlarıyla orantılı olması gibi. 50.000 karelik sinyalleri içeren merkez düzlemin sonuç tablosunu açtıktan sonra, 100 nanometre kalınlığa filtreleyin.
Daha önce gösterildiği gibi ortaya çıkan sinyallerin histogramını oluşturun ve merkez bölümün entegre yoğunluğunu ölçün. MATLAB betiği TS2orte'yi çalıştırarak orta bölümdeki ultrastrüktürel bilgileri içeren büyük ThunderSTORM yerelleştirme tablosunu csv formatından ORTE formatına dönüştürün. m, yerelleştirme tablosunu bir MATLAB matrisine dönüştürür ve mat formatında kaydeder.
LAND-voronoi klasörüne gidin ve coreAlgorithm alt klasöründe voronoicluster dosyasını açın. m ve mutlak yoğunluk hesaplamaları için kullanılan hücre tipine ve hücre döngüsü aşamasına göre DNA içeriğini, tüm çekirdek fraksiyonu DNA'sının gözlemlenen merkez bölümünün fraksiyonunu ve lokalizasyonlarını ve dönüşüm faktörünü ayarlayın. Analizi başlatan komut dosyasını düzenleyin voronoi.m.
Orte yerelleştirme verilerine ve sonuç dosyaları için çıktı klasörüne dosya yolunu ayarlayın. Mozaiklemenin yapılması gereken alanı tanımlayan koordinatları belirtin. Aynı giriş veri kümesi içinde hesaplanacak birden çok alan tanımlayın.
Komut dosyasını çalıştırdıktan sonra, alan dağılımının histogramını ve yoğunluklarını gösteren grafikler içeren diğer dosyalarla birlikte mutlak DNA yoğunluklarını gösteren görüntüyü arayın. m çıktı klasöründeki hesaplanan her bir Voronoi hücresinin yoğunluklarını içeren dosya. 50.000 kareden oluşan FPALM ölçümü, 100 nanometre kalınlığındaki bir orta bölüm içinde tespit edilen 6 lokalizasyonun gücüne 2,68 çarpı 10 ile sonuçlandı.
Yeniden oluşturulan görüntünün lokalizasyon doğruluğu 10 nanometreydi. Çok sayıda lokalizasyon, mutlak DNA yoğunluklarını gösterirken süper çözünürlüklü görüntülemenin kombinasyonuna izin verdi. Ölçülen DNA yoğunluklarının çekirdek boyunca eşit olarak dağılmadığı ve geniş bir dinamik aralığı kapsadığı açıktı.
Çekirdek içindeki daha büyük Voronoi hücrelerini gösteren alanların daha yüksek büyütmeleri, düşük DNA yoğunluklarını gösterirken, daha küçük hücreler yüksek DNA yoğunluklarını gösterdi. G1C3H10T yarım çekirdekte ölçülen DNA yoğunlukları, farklı bir tür ve türün çekirdeği içindeki mutlak DNA yoğunluğu dağılımını gösterdi. Temel organizasyon erken G1 HeLa çekirdeğine benzese de, ayrıca parasentrik heterokromatin kurucu kümelerine sahipti.
Biraz artan nükleer boyuta rağmen G2 çekirdeğinde dramatik bir mimari değişiklik gözlenmedi. TSA ile tedavi edilen HeLa çekirdeği, nükleer topografya ve DNA yoğunluğu açısından dikkate değer farklılıklar gösterdi. Daha yüksek DNA yoğunluğuna sahip adalar gösteren periferik heterokromatin dışında, kromatinin geri kalanı çok daha homojen ve yoğunlaşmamış görünüyordu.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, yapışkan hücre çekirdeği içindeki mutlak DNA yoğunluklarını ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır ve tekli molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM) verilerinin Voronoi tesellenasyonunu kullanır. Bu yaklaşım, kromatin yapılarındaki mekansal kısıtlamaların araştırılmasını sağlar ve genetik bilgiyi hücre döngüsü aşamalarıyla ilişkilendirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre biyolojisi
- Genetik
- Mikroskopi ve görüntüleme teknikleri
Arka Plan
- DNA yoğunluğunu anlamak, kromatin yapısının araştırılması için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler genellikle histonların translasyon sonrası modifikasyonlarına dayanır.
- Toplam DNA içeriğinin bilgisi, doğru ölçümler için esastır.
Kullanılan Yöntemler
- SMLM verilerinin Voronoi tesellenasyonu
- Biyolojik sistem olarak yapışkan hücre çekirdeği
- CellProfiler ve ImageJ gibi görüntü analiz yazılımları
Ana Sonuçlar
- Ölçümler, kare mikrometre başına baz çiftlerinde ifade edilen DNA yoğunluklarını verir.
- Gelecek yönleri, yoğunluk farklılıklarını epigenetik modifikasyonlarla ilişkilendirmeyi içerir.
- Yöntem, hücre döngüsü aşamalarının DNA içeriği ölçümündeki etkisini doğrular.
Sonuçlar
- Bu protokol, hücre çekirdeğindeki DNA yoğunluğunun hassas değerlendirilmesine olanak tanır.
- Çalışma, genomik verilerin kromatinin fiziksel özellikleriyle entegrasyonu için ön ayak olur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of absolute DNA density in cell nuclei addresses a critical gap in understanding chromatin architecture beyond epigenetic marks, enabling direct assessment of spatial constraints that may influence gene regulation. This capability enhances predictive confidence in early discovery by providing high-resolution, quantitative data on nuclear organization relevant to target validation and mechanistic de-risking. Integrating such spatially resolved DNA density measurements supports risk-adjusted portfolio decisions at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of chromatin spatial organization for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying DNA density variations linked to gene activity states.
- Provides a quantitative framework for hypothesis testing regarding spatial constraints in gene regulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated nuclear models for downstream chromatin or epigenetic assays.
- Delivers reproducible, quantitative DNA density outputs for assay standardization.
- Enables robust comparison of chromatin states across cell cycle stages and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin density mapping with disease-relevant nuclear phenotypes when integrated with orthogonal data.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking physical chromatin features to functional readouts.
- Provides predictive de-risking for chromatin-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions within the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model refinement, enabling integration of spatial chromatin data with functional and epigenetic analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven investigation of chromatin spatial constraints and their regulatory implications.
- Screening: Provides quantitative, reproducible DNA density metrics for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates high-resolution, statistically robust density maps for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Enables alignment of chromatin architecture with disease models when combined with additional molecular data.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for nuclear architecture analysis across diverse cell types and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin biology.
- Operational Value: Standardizes nuclear density measurement with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative spatial data on chromatin organization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chromatin-modifying targets and strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule localization microscopy and advanced image analysis.
- Demands access to high-resolution microscopy platforms and computational infrastructure for data processing.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptation across cell types and cell cycle stages requires careful calibration of DNA content and segmentation parameters.
- Practical limitations include the need for accurate total DNA content and potential integration with orthogonal molecular data.
