İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu, hücresel fenotipleri ve R-pass çekirdeklerinin özelliklerini izlemek için basit bir yöntemdir. Ayrıca, R-pass çekirdeklerinin stabilitesini etkileyen genetik faktörleri bulmak için genom çapında yapılan çalışmalarda sıklıkla geri kazanılabilir. Bu köklü bir motor organizma olduğundan, bu teknik kolaydır ve insan hücre hatlarını veya hayvan modellerini kullanmaya kıyasla fazla zaman ve çaba gerektirmez.

R-pass çekirdeklerinin agregasyonu Parkinson hastalığı ile yakından ilişkilidir. R-pass çekirdeklerinin stabilitesini etkilemesi muhtemel proteinler veya kimyasallar bu İnsanlaştırılmış maya modelinde test edilebilir. Başlamak için, alfa-sinüklein plazmidleri içeren hücrelerin seçimi için üç tek koloni bir SD-URA agar plakasına yama yapın.

Daha sonra, Gal1 promotörü ve% 0.1 glikoz altında alfa-sinüklein indüksiyonunun indüksiyonunun inhibisyonu için% 2 rafinoz ile plazmidleri içeren mayanın seçici büyümesi için suş başına üç yamalı maya dönüştürücülerini 3 mililitre SRD-URA'ya aşılayın. Aşılanmış kültürü dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, gece kültürlü hücreleri, 600 nanometrede 0.2'lik bir optik yoğunluğa ulaşana kadar 3 mililitre taze SRD-URA'ya aşılayın.

Daha sonra, kültürü dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede altı saat boyunca inkübe edin. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün. Daha sonra, her kültürdeki hücre sayısını eşitlemek için numuneleri 600 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa kadar 96 kuyucuklu bir plakanın 1. şeridinde steril damıtılmış suyla seyreltin.

Sonraki beş şeride 160 mikrolitre steril damıtılmış su ekleyerek maya hücrelerinin 5 kat seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve her şeritteki hücreleri seri olarak seyreltirken toplam 40 mikrolitre hacim sağlayın. Kontroller için SD-URA agar plakalarındaki numuneleri ve toksisiteyi izlemek için SG-URA agar plakalarındaki numuneleri tespit etmek üzere her bir kuyucuktan 10 mikrolitre aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Benekli plakaları dört gün boyunca 30 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin.

Dördüncü güne kadar her 24 saatte bir plakaların görüntülerini alın ve ardından gözle tespit edilen suşlar arasındaki büyüme farklılıklarını karşılaştırarak verileri analiz edin. Suş başına üç yamalı maya dönüştürücüsünü üç mililitre SRD-URA'ya aşılayın ve gece boyunca dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 600 nanometrede gece boyunca kültürlenen hücrelerin optik yoğunluğunu ölçün ve hücreleri 96 delikli plakalarda toplam 200 mikrolitre taze SD-URA ve SG-URA'ya aşılayın.

Hücreler de dahil olmak üzere son hacmi 200 mikrolitreye ayarlayın ve ilk hücre optik yoğunluğunu 600 nanometrede 0.05'e ayarlayın. Mikrotitre plakasındaki program ayarlarını yapın. Hedef sıcaklığı 30 santigrat dereceye, aralık süresini 15 dakikaya, sarsıntı süresini 890 saniyeye, sarsıntı genliğini 5 milimetreye ve ölçümü 600 nanometrede absorbans olarak ayarlayın.

Tüm suşların bir mikroplaka okuyucuda sabit faza ulaşması için plakayı 2-3 gün boyunca inkübe edin. Büyüme eğrisini çizerek verileri analiz edin. Yamalı maya dönüştürücülerini 3 mililitre SRD-URA'ya aşılayın ve dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede gece boyunca kültürleyin.

Ertesi gün, gece kültürlü hücreleri 3 mililitre taze SRD-URA'ya 600 nanometrede 0.003 optik yoğunluğa yeniden aşılayın, ardından optik yoğunluk 0.2'ye ulaşana kadar kültürü dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra 300 mikrolitre% 20 galaktoz ekleyin ve daha sonra dakikada 200 rotasyonda ajitasyon altında 30 santigrat derecede 6 saat daha inkübe edin. 5 dakika boyunca 800 g'da santrifüjleme yoluyla hücre kültürünün bir mililitresini toplayın ve süpernatanı atın.

Hücre peletini 30 mikrolitre damıtılmış suda nazikçe askıya alın. Bir cam slayt üzerinde bir agaroz jel ped hazırlayın. Hücreleri yeniden askıya alın ve cam slayta hücre süspansiyonunun beş mikrolitresini yükleyin ve inceleme için kesilmiş agaroz pedi kullanarak hücreleri örtün.

100x objektifle mikroskobik görüntüleme gerçekleştirmek için, programı kullanarak görüntü oluşturmak için ekran yakalama seçeneğini kullanın ve daldırma yağı kullanarak hücreyi 100x objektifle odaklamak için parlak alanı seçin. GFP floresan filtresine geçin ve sinyal-gürültü oranını dengeleyerek net bir görüntü elde etmek için görüntü pozlama süresini 50 milisaniye ile 300 milisaniye arasında ayarlayın. Görüntü dosyasını açın ve görüntü analiz yazılımını kullanarak hücrelerdeki odak sayısına göre hücreleri sayarak verileri analiz edin.

PRS426 vektöründeki Gal1 promotörü altındaki sinüklein ekspresyonu, indükleyici olarak galaktoz içeren agar plakasında önemli büyüme geriliği gösterdi. Sinüklein ekspresyonu ile büyümedeki fark sıvı kültürlerde de gözlenmiştir. Her iki kültür koşulunda da, vahşi tip sinüklein ve E46K veya A53T mutasyonlu varyantlar, sinüklein toksisitesine bağlı büyüme kusurları göstermiştir.

Bununla birlikte, agrega oluşturmayan sinüklein A30p varyantı, toksik olmayan bir fenotip göstermiştir. Şiddetli sitotoksisite sergileyen suşlar, sinüklein agregalarının odaklarını gösterdi, ancak A30p varyantında, hücreler boyunca daha az toksik bir sinüklein formu yayıldı. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, hücreyi her deneyde aynı büyüme aşamasında, özellikle sinükleinle ilişkili fenotipleri izlerken kullanmak önemlidir.

Floresan mikroskop verilerinde gösterdiğimiz gibi, sinüklein daha büyük agregalar oluşturabilir. Bu nedenle, santrifüjleme ile basitçe fraksiyone edilebilir ve sinükleine özgü antikor kullanılarak batı lekelenmesi ile ölçülebilir. Bu teknik, sinükleinin agregasyonunu etkileyen yeni genetik faktörleri ve kimyasal bileşikleri bulmak için yüksek verimli tarama için geçerlidir.

Bu nedenle, Parkinson hastalığı için yeni terapötik adaylar bulmayı umuyoruz.