Name: Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Öğrenin, akış sitometrisi kullanarak Saccharomyces cerevisiae'de protein toplanması ile oksidatif stres arasındaki ilişkiyi değerlendirmeyi. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda protein katlanma bozukluklarını araştırmak için hızlı ve nicel bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. S. cerevisiae kültür ve Protein ifade
Not: Aβ türevleri farklı göreli toplama eğilimlerini de Aβ42 peptid (Şekil 1A) 19 (Phe19) konumunu tek bir kalıntı bir mutasyon nedeniyle sergi. Bu peptid çeşitleri bir toplama muhabir (Şekil 1)29davranan floresan yeşil protein (GFP), ile etiketlenir.
<ol><li>Maya hücreleri BY4741 ebeveyn arka plan (MATa onun3Δ1 leu2Δ0 bir araya geldi15Δ0 ura3Δ0)30ile 20 Aβ42-GFP türevleri için kodlama plazmid dönüşümü. Her plazmid GFP için GSSGSSG bağlayıcı tarafından erimiş bir Aβ42 mutant için kodlar. Plazmid pESC(-URA) ve seçilebilir işaret URA329içerir.<ol>
<li>Sentetik tam orta urasil (SC-URA) aşağıdaki bileşenleri içeren olmadan hazırlamak: 1.9 g/L Maya azot urasil, 5 g/L amonyum sülfat ve 900 mL GKD2O temel kombine ile 100 mL % 20 (w/v) glikoz.</li>
		<li>Dönüştürülmüş Maya hücreleri bir koloni % 2 glikoz içeren SC-URA orta 20 mL koymak ve kültürler gecede 30 ° C'de ajitasyon 210 devirde altında büyür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ertesi gün, yeni Maya hücreleri kültürleri 5 mL taze SC-URA orta de aşı 100 µL gecede kültür tarafından büyümek.</li>
	<li>Bir OD590 0,5, 3000 x g 4 dk için de kültürler santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve aynı birimin taze SC-URA Orta % 2 raffinose içeren hücrelerde resuspend.</li>
	<li>30 dk için 210 devirde ajitasyon altında 30 ° C'de kuluçkaya. Sonra 4 dk 3000 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Taze SC-URA orta Rekombinant protein ifade ikna etmek için % 2 galaktoz içeren hücrelerde resuspend.</li>
	<li>16 h SC-URA Orta % 2 galaktoz içeren protein ifadede inducing sonra Santrifüjü 3000 x g 4 dk için de tarafından 1 mL steril microcentrifuge tüpler indüklenen hücre hasat. Not: 16 h. Induced Maya hücreleri Aβ42-GFP türevleri ifade bir indüksiyon döneminde Rekombinant protein dağıtım hücrelere (Şekil 2B) belirlemek için floresans mikroskobu tarafından görüntülenmiştir sonra en alakalı farklılıklar ortaya.</li>
</ol>2. hücre boyama
Not: Taze sigara kaynaklı hücreler bir FC çözümleme sırasında bir floresan eşiği belirlemek için bir negatif kontrol olarak gereklidir.
<ol><li>16 h kaynaklı Maya hücreleri almak ve 590 optik onların yoğunluğuna belirlemek nm (OD590). Onları steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 0.1 OD590 için sulandırmak.<ol>
<li>1 fosfat tamponlu tuz x aşağıdaki gibi hazırlamak: NaCl, KCl, Na2HPO4, 1.44 g 0.2 g 8 g ekleyin ve KH2PO4 GKD2O. 800 ml 0,24 g doldurun 1 L-GKD2O kadar çözüm pH 7.4 için ayarladıktan sonra HCl. ile arabellek 0.2 µm filtreden filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uygun şekilde etiketlenmiş tüpler (12 × 75 mm yuvarlak alt Polistiren) ifade hücre süspansiyonlar aktarmak ve onları ışıktan korumak. Akış Sitometresi Analizi, Sigara kaynaklı ve lekeli olmayan hücreleri ile birlikte için üzerinde yüklü olması için hazır olduklarından emin olun.</li>
	<li>Her örnek 5 mikron son bir konsantrasyon, oksidatif stres sonda (Örneğin, CellROX derin kırmızı) ekleyin ve karanlıkta 30 dk 30 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra 3 kez 1 x PBS içeren hücreleri yıkama ve onları arabellek onların analiz FC tarafından daha önce aynı hacmine resuspend.</li>
</ol>3. Akış Sitometresi Analizi
Not: bir FC Kur uygun lazerler ve filtreler ile GFP ve oksidatif stres sonda floresans sinyal algılamak için kullanır. GFP tespiti için 488 nm mavi lazer ve oksidatif stres sonda floresans tespiti için 635 nm kırmızı lazer ile donatılmış bir akış sitometresi kullanılabilir. Emisyon floresans GFP ve oksidatif stres sonda edinimi yapılır 530/30 nm BP filtre ve 660/20 BP filtrenin sırasıyla (Tablo 1).
<ol><li>Yeni çalışma sayfası panelini açma tıklayın ve aşağıdaki edinme nokta araziler oluşturun.<ol>
<li>Araç çubuğundan Dağılım çizim aracı seçin ve bir komplo ile yan dağılım-alan (SSC-A) y ekseni vs üzerinde ileri dağılım alanı (FSC-A) x ekseni üzerinde doğrusal bir ölçek değişkenlerinin.</li>
		<li>Araç çubuğundan Dağılım çizim aracını tıklatın ve x ekseni vsFL1-alan (FITC) değişkenleri ile bir çizim oluşturma. Fl3-alan (APC) y ekseni Logaritmik bir ölçekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aletleri ayarları simgesini tıklatın. Tazminat sekmesini tıklatın ve tüm tazminat düzeyleri ayarlayın. Satın alma sekmesinde tıklatın ve kaydedilecek 20.000 olayların toplam sayısı seçin.</li>
	<li>Akış hızı düşükolarak geçmek için Akış hızı simgesini tıklatın.</li>
	<li>Sigara kaynaklı, günahı hücreleri yayınlanmaya başlaması için Al sekmesini tıklatın ve nüfus orta-sol çeyreğinde dağıtılır kadar ileri Araç ayarları ve yan dağılım gerilim ayarlayın.<ol>
<li>Hücre popülasyonu hücre artıkları dışında bir bölgesini R1 ayarlamak için Çokgen ikonuna tıklayın ve bu geçişli nüfus P1 kullanın R1 = tüm floresan nokta araziler ve çubuk grafik gösterimleri (Şekil 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresans sinyalinin Devresel_ödeme gerilimi ayarlamak için hücreleri içinde sol alt çeyrekte dağıtılır kadar kazanç Araç ayarı sekmesinde ayarlama FL1-FL3 nokta Arsa günahı hücreleri çalıştırın.</li>
	<li>Örnek GFP floresans ölçmek için indüklenen hücrelere değiştirin. Nüfus sağ alt çeyreğinde dağıtıldığında Araç ayarı sekmesinde kazanç FSC-A vs FL1 (FITC) olarak ayarlayın. Bir kapı (Gate P2) ile pozitif hücre nüfus tanımlayın.</li>
	<li>Değişiklik olmayan indüklenen için örnek bir FSC-A vs FL3 (APC) nokta arsa üzerinde floresans tarafından oksidatif stres görüntülemek için hücreleri lekeli. Hücre popülasyon sol üst çeyreğinde dağıtılır kadar kazanç ayarlayın. P3 pozitif hücre kalabalıkta bir kapı.</li>
	<li>Hücre floresans temsil etmek için iki çubuk grafik bir cenaze dört nikah çubuk grafik simge olun. Floresan yoğunluğu temsil etmek için FL1 (FITC GFP floresans temsil eden) x ekseni ise FL3 (APC) Floresan temsil eden y ekseni, P2 ve P3 nüfusu sırasıyla logaritmik bir ölçekte uygulama emin olun. Not: Histogram bindirmeleri floresans profilleri farklı Aβ türevleri ifade hücre arasındaki farkları göstermek için iyi bir yoldur.</li>
</ol>4. rekombinant Protein Immunodetection
<ol><li>Protein ifade düzeylerini belirlemek için Santrifüjü 4.000 x g 6 min için de 16 h için indüklenen maya kültürleri hasat ve hücre granül-80 ° C'de depolayın<ol>
<li>16 h PBS için Rekombinant protein ifade kendine hakim hücre resuspend. 200 µL hücre süspansiyonlar, her Aβ42-GFP mutant bir OD590 20 için hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplam protein fraksiyonu analiz, her mutant 100 µL Santrifüjü 14.000 x g 20 dk için de tarafından hasat ve Maya lizis arabellek Y aynı birim hücre granül resuspend-(50 mM Tris-HCl pH 8.0, % 1 DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA içeren 10 mg/mL SB3-14 (en düşük ücret istyl sulfobetaine) takıma 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF)).<ol>
<li>Örnekleri hafif ajitasyon altında oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein özü konsantrasyon Bradford tahlil kullanarak belirleyin. % 15 akrilamid SDS-sayfa Elektroforez jel ve leke üzerine polivinilidin difluoride (PVDF) membran 100 V 60 dk için her örneğinin protein ekstresinin 5 µg yükleyin.<ol>
<li>Bir Bradford reaktifi ile Coomassie parlak mavi G-250 100 mg 50 mL % 95 etanol çözünmüş ve 100 mL % 85 (w/v) fosforik asit ekleyin hazırlayın. O zaman, boya tamamen çözüldüğünde, GKD2O 1 m'ye karışımla sulandırmak ve selüloz filtre kağıdı kullanmadan önce aracılığıyla filtre. Not: Bradford reaktifi olmak hafif kahverengi.</li>
		<li>Sığır serum albumin (BSA) 1.000 µL Bradford reaktif proteinin 5-100 µg arasında değişen bir standartta hazırlayın.</li>
		<li>1-10 µL protein Bradford reaktifi 1 mL için ayıklamak ve 5 min için oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya ekleyin.</li>
		<li>Standartları ve protein özü örnekler, OD595absorbans ölçmek.</li>
		<li>Analiz için bir arsa için standartlar vselde absorbans değerleriyle olun. µg protein. Standart eğri dayalı, protein, miktarı üzerinden orijinal örnekleri konsantrasyonları hacmi ve seyreltme, varsa göz önünde bulundurarak belirleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membran ile 1 x Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS), % 0,1 durulama ara 20 (TTBS) ve %5 (w/v) yağsız Kuru süt 1 x TTBS kullanarak engelleyiniz.<ol>
<li>10 x TBS 1 litre hazırlamak için 24 g Tris temel ve NaCl 88 g H2Odd 900 ml dağıtılması ve pH 7,6 için ayarlayın. GKD2O 1 L. son bir birime ekleme 1 x çözüm için 10 x hisse senedi, 1 kısım GKD2O. 9 parçaları ile karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membran bir birincil β-amiloid antikor seyreltilmiş 6E10 1:1,000 ile 1 h için kuluçkaya ve ikincil antikor keçi ile Oda sıcaklığında 1 h için 1:10, 000 Anti-fare IgG-HRP eşlenik seyreltilmiş.</li>
	<li>1 mL Luminata floresan reaktif kullanarak membranlar geliştirmek ve grup tarafından densitometric analiz 5.2 adımda anlatıldığı gibi ölçmek.</li>
</ol>5. veri analizi
<ol><li>FC tarafından elde edilen verileri analiz etmek için Ortalama floresan yoğunluğu (MFI) görüntüleyen bir tablo oluşturmak ve onun karşılık gelen standart hata ve/veya GFP floresans ve oksidatif stres düzeyleri farkı (MF) katsayısı ile ortalama Floresans.<ol>
<li>Müfettiş sekmesini ve her kanal için gerekli olan istatistiksel verileri özelleştirmek için İstatistikleri simgesini tıklatın. Not: protein türevleri karşılaştırılırken, katlanır arka plan veya çözünürlük metrik (RD) Floresan veri değerleri dönüştürür: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> Bu ölçüm, sorun örneklerinin ortalama floresans kötü örnek olduğunu, bir denetim olarak kullanılan hücre ortalama floresans ortalama denetimidir ve SD ortalama floresans standart sapmasıdır. Sadece örnekleri aynı zamanda veri yaymak için hesapları arasındaki farkı hesaplar gibi RD faktör MFI değerden daha doğru bir dizindir. Zaman içinde farklı deneyler gelen verilere karşılaştırma yürütülen bu hesaplama özellikle uygundur. RDs hesaplanan bir kez bir istatistiksel test kullanımı protein çeşitleri arasında gözlenen farklılıklar önemini onaylamak için tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein immunodetection için ImageJ yazılım kullanarak Western blot tarafından Rekombinant protein düzeyleri ölçmek.<ol>
<li>Dansitometresi analiz daha önce geliştirilen membran orijinal raw görüntüleri JPEG dosya biçimi ve gri tonlama moduna dönüştürün.</li>
		<li>Çözümle menüsünde demek grideğerine Ayarla ölçümler kısmında ayarlayın.</li>
		<li>ImageJ dikdörtgen aracını tıklatın ve grup Dansitometresi analiz için tutarlı boyutu ile bir bölgesi (ROI) ilgi tanımlamak. Membran görüntü oluşturulan dikdörtgen çerçeve içindeki her band merkezi ve ölçüm Ctrl + M (ölçü komutu) kullanarak tek tek kaydedin.</li>
		<li>Aynı YG alan uygulama her grup için bitişik yerel arka plan ölçmek. Ölçüm sonra tek tek her gruptan karşılık gelen yerel arka plan çıkarma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+newly+translated+proteins+in+vivo%3A+the+role+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones.</a> Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Wong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+selective+clearance+of+protein+inclusions+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy.</a> Nature Communications. 3, (2012).</li>
<li>Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+networks+in+protein+disaggregation+and+prion+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation.</a> Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).</li>
<li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%3A+destruction+for+the+sake+of+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.</a> Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12181546">Getting out of shape.</a> Nature. 418, 729-730 (2002).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Aguzzi, A., O'Connor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+diseases%3A+pathogenicity+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transthyretin-related+amyloidoses+and+the+heart%3A+a+clinical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview.</a> Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).</li>
<li>Deas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+oligomers+interact+with+metal+ions+to+induce+oxidative+stress+and+neuronal+death+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).</li>
<li>Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).</li>
<li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431, 805-810 (2004).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+what+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).</li>
<li>Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characterization+of+diverse+amyloid+fibrils+in+vitro+by+the+fluorescent+dye+Nile+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red.</a> Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).</li>
<li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+amyloid+by+congo+red+spectral+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay.</a> Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast?</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).</li>
<li>Tenreiro, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+is+good%3A+yeast+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Simple is good: yeast models of neurodegeneration.</a> FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).</li>
<li>Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+model+of+amyloid-%CE%B2+and+Tau+aggregation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).</li>
<li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).</li>
<li>Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+sequestration+and+detoxification+of+huntingtin+by+the+ribosome+quality+control+complex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+yeast%3A+modeling+neurotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).</li>
<li>Figley, M. D., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genetic+screen+reveals+novel+therapeutic+strategy+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS.</a> Rare Diseases. 1, e24420(2013).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Bharathi, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27654890">Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33, 607-620 (2016).</li>
<li>Pallarès, I., Ventura, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28685682">Advances in the prediction of protein aggregation propensity.</a> Current Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+propensity+is+a+crucial+determinant+of+intracellular+inclusion+formation+and+quality+control+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).</li>
<li>Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+against+toxic+aggregation-prone+protein+sequences+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).</li>
<li>Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li>
<li>Conchillo-Solé, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGGRESCAN%3A+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+%26%2334%3Bhot+spots%26%2334%3B+of+aggregation+in+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &#34;hot spots&#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65(2007).</li>
<li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li>
<li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24698014">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li>
<li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li>
</ol>

Çok çeşitli hastalıklar misfolded proteinleri birikimi hücresel mevduat6,7,8,33içine bağlıdır. Birçok çabaları rapor protein konsantrasyonları almayın, Hesaplamalı yaklaşımları kullanarak bu hastalıkların başlangıcı tetiklemek moleküler mekanizmaları çözmeye gelmiş yapılmış veya vitro yaklaşımları, içinde protein konsantrasyonu reaksiyon sırasında sabit kalır. Ancak, hücre içinde prote...

Proteostasis hücre fitness ve yaşlanma süreçlerinin temel bir belirleyici olduğunu. Hücrelerde, protein homeostazı sofistike protein kalite kontrol doğru misfolded protein conformers chaperones ve/veya onların hedeflenen proteolizis tarafından birkaç iyi korunmuş mekanizmalarıyla1 refolding emin olmak için ağlar amaçlayan tarafından yapılmaktadır ,2,3,4,5. Çok sayıda çalışmalar başlangıçlı ve geniş bir insan hastalıkları ve proteostasis, protein misfolding ve toplama için önde gelen başarısızlık arasındaki bağlantı için destek sağlar. Örneğin, protein mevduat varlığı çok nörodejeneratif hastalıkları, Alzheimer, Parkinson, gibi ve Huntington hastalıkları6,7,8patolojik damgasını olarak kabul edilir, prionogenic hastalıklar ve sigara dejeneratif amyloidoses9. Toplama tepki erken oligomeric ve protofibrillar derlemelerde diğer proteinler ile anormal etkileşim içinde kalabalık hücresel ortamı10kurulması ana elicitors, sitotoksisite, çoğu sürülmüştür. Buna ek olarak, protein kapanımlar (PI) onların toksik etkisi11,12yayılıyor hücreler arasında aktarılabilir. Bu nedenle, PI oluşumu gerçekten tehlikeli toplanan türlerin varlığı belirli konumlara hücresinde, nerede onlar olabilir işlenen veya önemli yan etkileri olmadan birikmiş kısıtlar detoxifying bir mekanizma teşkil olabilir 13 , 14.
Standart vitro biyokimyasal yaklaşımlar toplama reaksiyonlar ve onların özellikleri15,16doldurmak farklı türlerin önemli anlayışlar hazırladık. Ancak, bu deneyleri içinde kullanılan koşulları açıkça farklı hücre içinde meydana gelen ve bu nedenle, kendi fizyolojik alaka soru. Protein kalite kontrol, autophagy veya Düzenleme Ökaryotlar19,20,21 arasında hücresel redoks devlet17,18 , gibi hücresel yolları önemli korunması nedeniyle ,22,23, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) protein toplama moleküler belirleyicileri çalışmaya ayrıcalıklı basit bir hücresel model çıkmıştır ve ilişkili sitotoksik etkisini de biyolojik olarak uygun ortamlar24,25,26.
Protein toplama eğilimi doğal olarak birincil sırada kodlanmış bir özelliktir. Böylece, amiloid benzeri yapıların oluşumu kimlik ve toplama teşvik potens değerlendirilmesi dayalı tahmin edilebilir polipeptitler27bölgelerde. Ancak, protein sequences vitro toplama özelliklerini tahmin etmek için bioinformatic algoritmaları başarı rağmen bunlar hala bu eğilimlerini vivo içinde sitotoksik etki nasıl tercüme tahmini çok uzak. Belirli bir protein toplanan durumunu ve onun ilişkili hücresel hasarı arasındaki bağlantıyı sistematik bir şekilde ele alan çalışmalar Hesaplamalı bu sınırlamayı aşmak için yardımcı olabilir. Bu bağlantı yalnızca tek bir kalıntı farklı ama toplama eğilimlerini vivo içinde28sürekli bir dizi görüntüleme β-amiloid peptid Aβ42 türevleri büyük bir set yararlanarak bu da çalışmanın, yöneliktir. Maya hücreleri toplama eğilimli proteinler tarafından elde edildi oksidatif hasar için muhasebe konformasyon türler tanımlamak için FC dayalı bir yaklaşım özellikle de açıklanmıştır. Metodoloji basitlik, yüksek üretilen iş yetenekleri ve doğru nicel ölçüm gibi birçok avantaj sağlar. Bu yaklaşım o PI oksidatif strese karşı koruyucu bir rol oynar teyit mümkün kıldı.

<table><tbody><tr><td>Maya hücreleri BY4741&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>Genotip: MATa his3 & Delta; 1 leu2 ve Delta; 0 met15 ve Delta; 0 ura3 ve Delta; 0</td></tr><tr><td>pESC(-Ura) plazmid&nbsp;</td><td>Agilent Genomics</td><td></td><td>217454 Gal promotorlu maya ekspresyon plazmiti. Seçilebilir işaretleyici URA3</td></tr><tr><td>Maya Sentetik Bırakma Ortamı Takviyeleri</td><td>Sigma</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>Amino Asitsiz Toz Maya Azot Baz</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td>Toz</td></tr><tr><td>Rafinoz</td><td>Sigma</td><td>R7630</td><td>Toz</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Toz</td></tr><tr><td>Galaktoz</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td>Toz</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991&nbsp;</td><td>Çözüm 10X</td></tr><tr><td>CellROX Koyu Kırmızı Reaktif&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C10422</td><td>Serbest radikal hücre kaynaklı floresan sensör, indirgenmiş durumdayken floresan değildir ve reaktif oksijen türleri (ROS) tarafından oksidasyon üzerine parlak floresan sergiler, 644/665 nm'de absorpsiyon/emisyon maksimumu ile.</td></tr><tr><td>Y-PER protein ekstraksiyon reaktifi&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78990</td><td>Sıvı hücre lizis tamponu</td></tr><tr><td>Akrilamid/Bis-akrilamid</td><td>Sigma</td><td>A6050</td><td>Çözeltisi</td></tr><tr><td>Bradford boya reaktifi</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>5000205</td><td>Protein konsantrasyonunun tek aşamalı tayini için boya reaktifi</td></tr> <tr><td>beta; - amiloid antikoru 6E10 &</td><td>BioLegend</td><td>803001</td><td>Fare IgG1. Epitop, beta amiloidin (EFRHDS) 3-8 amino asitleri içinde yer alır.</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG-HRP konjugat&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1721011</td><td></td></tr><tr><td>Membran İmmobilon-P, PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Luminata forte</td><td>Merk</td><td>WBLUF0100</td><td>Önceden karıştırılmış, kullanıma hazır kemilüminesan HRP tespit reaktifi</td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür çözeltisi (PMSF)</td> <td>Sigma</td><td>93482</td><td>Proteaz inhibitörü. Etanol FACS'ta 0.1 M'de çözülürKanto</td></tr><tr><td>akış sitometresi&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>657338</td><td>488&nbsp; GFP'nin tespiti için nm mavi lazer ve 635&nbsp; nm kırmızı lazer / 530/30 nm BP filtre ve 660/20 BP filtre</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Elektroforez Transfer hücresi</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td>Protein transfer sistemi</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra El Döküm Sistemleri</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td>Elektroforez sistemi</td></tr></tbody></table>

protein toplama maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein misfolding ve toplama amiloid biçimler içine başlangıçlı ve ilerleme çeşitli nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili olduğu. Ancak, hala çok az bilgi var hakkında nasıl çözünmez protein toplamları onların toksik etkileri içinde vivouygulamayın. Basit prokaryotik ve ökaryotik canlılar, bakteri ve Maya, gibi önemli ölçüde mevcut anlayışımız mekanizmaları hücre içi amiloid dil oluşumu, toplamları yayma ve toksisite arkasında katkıda bulunmuştur. Bu protokol için maya kullanımı protein toplamları oluşumu ve hücresel oksidatif stres üzerindeki etkileri arasındaki ilişkiyi incelemek için bir model olarak tanımlanıyor. Yöntem bir amyloidogenic protein çözünür/toplanan hücre içi durumunu algılama akış sitometresi (FC) kullanarak kendi ifadeden kaynaklanan hücresel oksidatif hasar miktar ile birleştirir. Bu basit, hızlı ve nicel yaklaşımdır. Çalışma tekniği β-amiloid peptid türevleri ile onların anılan sıraya göre iç Toplama eğilimlerini büyük bir set neden hücresel oksidatif stres birleştiriliyor tarafından gösterilmektedir.

Bu iletişim kuralı 20 değişik-in nereye Phe19 için tüm doğal proteinogenic amino asitler28mutasyona uğrattı Aβ42 peptid topluluğu istihdam edileceğini açıklar. Bu proteinlerin teorik toplama eğilimlerini iki farklı bioinformatic algoritmaları (AGGRESCAN ve TANGO31,32) kullanılarak analiz edilebilir. Her iki durumda da, bu analiz ascribing, genel bir kural olarak, en yüksek değerleri hidrofobik kalıntıları v...

Protein toplama hücresel oksidatif stres ortaya çıkarır. Bu iletişim kuralı amyloidogenic proteinlerin hücre içi Birleşik ve onlarla akış sitometresi kullanarak ilişkili oksidatif stres izlemek için bir yöntem açıklanır. Yaklaşım β-amiloid peptid çözünür ve toplama eğilimli türevleri davranışını incelemek için kullanılır.

Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Bu prosedürün genel amacı, ekmek mayası Saccharomyces cerevisiae kullanılarak hücre içi protein agregatlarının oluşumu ile bunların hücresel oksidatif stres üzerindeki etkisi arasındaki ilişkiyi belirlemektir. Bu yöntem, nörodejeneratif bozukluklar ve nöropatik olmayan amiloidozlar gibi protein yanlış katlanması ve agregasyon hastalıkları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit, hızlı olması ve büyük bir maya popülasyonunda hücresel oksidatif stres hasarının ölçülmesine izin vermesidir.Bu yöntemle, bir amiloidojenik proteinin hücre içi çözünür veya kümelenmiş durumu ile mayadaki oksidatif stres seviyeleri arasındaki korelasyon hakkında fikir verebiliriz. Ek olarak, rekombinant proteinleri eksprese eden diğer model organizmalara da uygulanabilir. Akış sitometrisi analizini göstermek, UAB'deki Akış Sitometrisi Tesisi'nden bir teknisyen olan Manuela Costa olacaktır.Bu çalışmada, farklı A-beta-42 peptit varyantlarının hücre içi agregasyon durumu, galaktoz ile indüklenebilir bir promotörün kontrolü altında GFP'ye kaynaşmış A-beta-42 için kodlayan bir plazmit ile dönüştürülmüş S. cerevisiae kullanılarak izlenmiştir. Dönüştürülmüş may

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

Bu yazıda maya poliglutamin toksisite (polyQ)-genişletme proteinlerin değerlendirilmesi için üç tamamlayıcı protokoller...

Büyüme Tahliller Mayalarda poliglutamin toksisite değerlendirilmesi için

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını...

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif...

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Protein bolluğu hem protein sentezi hem de protein yıkım oranlarını yansıtır. Bu makale, tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) modelinde protein bozulmasını analiz etmek için sikloheksimid kovalamacasının ve ardından western blotlamanın kullanımını açıklamaktadır.

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Bu protokol, proteotoksik antimikrobiyal ile tedaviden sonra Escherichia coli'den agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılmasını ve görselleştirilmesini açıklar. Bu prosedürün ardından, farklı bakteri suşlarında ve/veya tedaviler arasında in vivo protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir.

Proteotoksik Stresör ile Escherichia coli Tedavisinden Sonra Protein Agregalarının Ekstraksiyonu ve Görselleştirilmesi

Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.

İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Öğrenin, akış sitometrisi kullanarak Saccharomyces cerevisiae'de protein toplanması ile oksidatif stres arasındaki ilişkiyi değerlendirmeyi. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda protein katlanma bozukluklarını araştırmak için hızlı ve nicel bir yaklaşım sunar.

Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet