Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, ekmek mayası Saccharomyces cerevisiae kullanılarak hücre içi protein agregatlarının oluşumu ile bunların hücresel oksidatif stres üzerindeki etkisi arasındaki ilişkiyi belirlemektir. Bu yöntem, nörodejeneratif bozukluklar ve nöropatik olmayan amiloidozlar gibi protein yanlış katlanması ve agregasyon hastalıkları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit, hızlı olması ve büyük bir maya popülasyonunda hücresel oksidatif stres hasarının ölçülmesine izin vermesidir.

Bu yöntemle, bir amiloidojenik proteinin hücre içi çözünür veya kümelenmiş durumu ile mayadaki oksidatif stres seviyeleri arasındaki korelasyon hakkında fikir verebiliriz. Ek olarak, rekombinant proteinleri eksprese eden diğer model organizmalara da uygulanabilir. Akış sitometrisi analizini göstermek, UAB'deki Akış Sitometrisi Tesisi'nden bir teknisyen olan Manuela Costa olacaktır.

Bu çalışmada, farklı A-beta-42 peptit varyantlarının hücre içi agregasyon durumu, galaktoz ile indüklenebilir bir promotörün kontrolü altında GFP'ye kaynaşmış A-beta-42 için kodlayan bir plazmit ile dönüştürülmüş S. cerevisiae kullanılarak izlenmiştir. Dönüştürülmüş maya hücrelerinin bir kolonisini seçin ve% 2 glikoz içeren 20 mililitre SC eksi Ura ortamına aşılayın. Kültürü gece boyunca çalkalama altında 30 santigrat derecede büyütün.

Ertesi gün, gece boyunca 100 mikrolitre kültürü beş mililitre taze SC eksi Ura ortamına aşılayın ve hücreleri iki ila üç saat boyunca 30 santigrat derecede büyütün. Kültür, 590 nanometrede veya 0.5 OD 590'da optik yoğunlukta olduğunda, kültürü dört dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri% 2 rafinoz içeren beş mililitre taze SC eksi Ura ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri 30 dakika boyunca çalkalama altında 30 santigrat derecede inkübe edin.

30 dakika sonra, hücreleri dört dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin, süpernatanı atın ve rekombinant protein ekspresyonunu indüklemek için% 2 galaktoz içeren taze SC eksi Ura ortamında hücreleri yeniden süspanse edin. Hücreleri 16 saat boyunca inkübatöre geri koyun. 16 saat sonra, kültürün bir mililitrelik alikotlarını steril mikrosantrifüj tüplerine aktararak ve dört dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyerek hücreleri hasat edin.

Bu prosedüre, 16 saatlik maya hücrelerinin OD 590'ını belirleyerek başlayın. Daha sonra hücreleri steril PBS'de 0.1'lik bir OD 590'a seyreltin. Eksprese edici hücre süspansiyonlarını uygun şekilde etiketlenmiş yuvarlak tabanlı polistiren tüplere aktarın ve bunları ışıktan koruyun.

Akış sitometrisi analizi için negatif bir kontrol olarak indüklenmemiş hücreleri hazırlayın. Oksidatif stres probunu her numuneye beş mikromolar final konsantrasyonunda ekleyin. Numuneleri alüminyum folyo ile örtün ve 30 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandığında, hücreleri aşağı döndürün, süpernatanı çıkarın ve hücre peletlerini PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri PBS ile bu şekilde üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri aynı hacimde PBS'de yeniden süspanse edin.

Lekelenmemiş hücrelerin akış sitometrisi analizine dahil edildiğinden emin olun. Uygun lazerleri ve filtreleri kullanarak, GFP'yi ve oksidatif stres probunun floresan sinyalini tespit etmek için akış sitometrisi analizini gerçekleştirin. Yeni Çalışma Sayfası Aç paneline tıklayarak başlayın ve denemeye bir ad verin.

Araç çubuğundan Dağılım Grafiği Aracı'nı seçin ve y ekseninde Yan Dağılım Alanı ve x ekseninde doğrusal bir ölçekte İleri Dağılım Alanı değişkenleriyle bir çizim oluşturun. Dağılım Grafiği Aracı'nı tıklatın ve x ekseninde FITC Alanı ve y ekseninde logaritmik bir ölçekte APC Alanı değişkenleriyle bir çizim oluşturun. Enstrüman Ayarı simgesine tıklayın ve Ücretlendirme sekmesinde tüm dengeleme seviyelerini sıfıra ayarlayın.

Ardından Edinme sekmesine tıklayın ve düşük bir akış hızıyla kaydedilecek toplam 20.000 olay sayısını seçin. Bir florokromun floresan emisyon sinyali başka bir dedektör tarafından algılanabildiğinden, tüm dedektörlerdeki her bir florokromun minimum sinyalini tek bir renk kontrolü ile eşitlemek için bir dengeleme işlemi gerçekleştirmek önemlidir. Tüp 001'i negatif kontrol olarak yeniden adlandırın ve indüklenmemiş, lekelenmemiş hücreleri çalıştırmaya başlamak için Al sekmesine tıklayın.

Popülasyon orta sol kadranda dağılana kadar ön ve yan saçılmanın Cihaz Ayarlarında voltajı ayarlayın. Hücre kalıntıları hariç hücre popülasyonu etrafında bir R1 bölgesi ayarlamak için Çokgen simgesine tıklayın ve bu geçitli popülasyonu P1'in tüm floresan nokta grafikleri ve histogram temsilleri için R1'e eşit olduğunu kullanın. Floresan sinyalinin PMT voltajını ayarlamak için, hücreler sol alt kadranda dağılana kadar Enstrüman Ayarı sekmesindeki kazancı ayarlayarak FL1 ila FL3 nokta grafiğindeki lekelenmemiş hücreleri çalıştırın.

Dağılım Grafiği Aracını kullanarak, FSC-A'ya karşı x ekseninde FITC-A değişkenleriyle bir nokta grafiği ve FSC-A'ya karşı x ekseninde APC-A değişkenleriyle ikinci bir nokta grafiği oluşturun. Ardından, GFP floresansını ölçmek için numuneyi indüklenen hücrelere değiştirin. Cihaz Ayarı sekmesinde, popülasyon sağ alt kadranda dağıtıldığında FSC-A'daki kazancı FITC'ye karşı ayarlayın.

GFP-pozitif hücre popülasyonunu bir kapı ile tanımlayın. Numuneyi indüklenmemiş lekeli hücrelere değiştirin. Oksidatif stresi bir FSC-A ve APC-A nokta grafiği üzerinde floresan ile görüntüleyin.

Hücre popülasyonu sol üst kadranda dağılana kadar kazancı ayarlayın. P3'teki pozitif hücre popülasyonunu kapatın. Histogram simgesiyle, biri FITC ve diğeri APC floresansı için olmak üzere hücre floresansını temsil eden iki histogram çizimi yapın. Ortalama floresan yoğunluğunu ve medyan floresansı, karşılık gelen standart hatası ve/veya GFP floresan ve oksidatif stres seviyeleri için varyans katsayısı ile gösteren bir tablo oluşturun.

Ücret sekmesine tıklayın ve tüm ücret düzeylerini sıfır olarak ayarlayın. Edinme sekmesine tıklayın ve kaydedilecek toplam 20.000 olay sayısını seçin. Üç yeni numune tüpü hazırlayın ve bunları indüklenmemiş, indüklenmiş çözünür ve indüklenmiş agrega olarak adlandırın.

Önceden ayarlanmış ayarlarla örneklerden veri alın. Yeni bir sayfa açarak ve FITC-A ve APC-A değişkenleri için bir nokta grafiği oluşturarak, pozitif hücreleri CellROX boyama için geçitleyerek verileri analiz edin. Her örnek için, FITC ve APC kanalları için ortalama floresan ve standart hatayı içeren bir istatistik tablosu oluşturun.

Agrega protein sayımını takiben hücreleri bir FACS sıralayıcı ile sıralamak da mümkündür. 16 saatlik bir indüksiyon periyodundan sonra A-beta-42 varyantlarını eksprese eden maya hücreleri, hücreler içindeki rekombinant protein dağılımını belirlemek için bir floresan mikroskobu altında görüntülenir. Bu görüntüler, seçilen A-beta-42 GFP varyantlarını temsil eder.

Protein inklüzyonları veya PI'nin oluşumu, analiz edilen koleksiyondaki 20 varyanttan 10'unda doğrulandı. Bu çubuk grafik, her varyant için toplam 500 floresan hücreden biyolojik kopyalara hesaplanan farklı sayıda PI içeren hücrelerin yüzdesini gösterir. Tahmin edilen ve in vivo toplama özellikleri arasında mükemmel bir uyum gözlendi.

Hücresel ekstraktlardaki protein ekspresyon seviyeleri, A-beta-spesifik bir antikor kullanılarak ölçüldü. Genel bir eğilim olarak, yeşil renkli PI oluşturan A-beta-42 varyantları, sitozolde dağınık olarak dağılmış, kırmızı renkli olanlardan daha düşük seviyelerde bulunur. A-beta-42 varyantları arasında, oksidatif stres probu floresansı, protein seviyeleri ve GFP floresan özellikleri, PI oluşturma yeteneklerine ve AGGRESCAN veya TANGO biyoinformatik algoritması tarafından tahmin edilen içsel agregasyon eğilimlerine göre temsil edildiğinde önemli farklılıklar gözlenmiştir.

PI oluşturan varyantlar yeşil renktedir ve PI oluşturmayan varyantlar kırmızı renktedir. Bu prosedürü takiben, hücre içi eksprese edilen bir protein varyantının hücre apoptozu veya sitotoksisite üzerindeki etkisinin belirlenmesi gibi ek soruları yanıtlamak için propidyum iyodür veya annexin V boyama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.