Name: Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmountlarının Verimli ve Tutarlı Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Keşfedin, insan retinasından RPE/choroid flatmount üretimi için tekrarlanabilir diseksiyon tekniği ve REShAPE yazılımı ile morfometrik analiz. Retina dejeneratif hastalıklarda fenotipik farklılıkları inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Zeiss Axio Scan.Z1'i kullandıkları için Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) histoloji çekirdeğine teşekkür ederiz. Ayrıca bağışçılara, ailelerine, İlerleyen Görme Ağı'na ve Lions Göz Enstitüsü'ne cömertlikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NEI IRP fonları tarafından desteklenmiştir (hibe numarası ZIA EY000533-04).

Kadavra insan küreleri Gelişmiş Görüş Ağı'ndan (Birmingham, AL) elde edildi. Kadavra dokusu üzerinde yapılan çalışmalar NIH Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından araştırma etik kurulundan muaf tutulur.
1. Göz küre sevkiyatı
<ol><li>Enükleasyondan sonra, taze göz kürelerini Ca 2 + ve Mg2 + ile buz gibi soğuk DPBS 1x ile dolu bir kaptagönderin. NOT: Enükleasyondan sonraki 24 saat içinde gözü diseke etmek daha iyidir. RPE morfolojisi bu süre zarfında değiştirilmez.</li>
</ol>2. Silikon kalıp hazırlama
<ol><li>25 mm çapında yuvarlak tabanlı bir tüpün alt 20 mm'sini kesin. Kare ağırlıklı bir teknenin tabanına yerleştirin (81 mm x 81 mm x 25 mm).</li>
	<li>Silikon Elastomer Kitinin iki bileşenini 10:1 oranında karıştırın ve havayı hapsetmemeye dikkat edin. Karışımı, yuvarlak tabanlı tüpün küresel parçasını içeren tartım teknesine dökün.</li>
	<li>Silikonu gece boyunca oda sıcaklığında kürleyin. Tartım teknesini ve yuvarlak tabanlı tüpü kürlenmiş silikon kalıptan çıkarın.</li>
</ol>3. RPE diseksiyonu
<ol><li>Kasların ve bağ dokusunun taze göz küresinin sklerasını temizleyin. Skleradan geçirilmiş 27 G iğneleri kullanarak gözü silikon kalıba sabitleyin. Kalıbın boşluğunu DPBS 1x ile Ca 2+ ve Mg2+ ile doldurun. NOT: Göz odasını ihlal etmemeye dikkat edin. İğneler sadece skleradan geçmelidir.</li>
	<li>Vitreusa ~ 400 μL 1.700 mOsm D-mannitol çözeltisi enjekte etmek için 1 mL'lik bir şırınga ve 21 G'lik bir iğne kullanın. Gözün ön odasını delmekten kaçınmak için iğneyi pars plana'dan geçirin. Gözü ~ 45 dakika oda sıcaklığında bırakın.</li>
	<li>Ön odayı pars plana seviyesinde bir çift ince makas ve forseps kullanarak kesin. Arka göz odacığını DPBS 1x ile Ca 2+ ve Mg2+ ile doldurun. Stereomikroskop altında, makulayı (retinadaki sarı nokta) lokalize edin.</li>
	<li>Cerrahi bir vitreus kesici varsa, vitreusu çıkarın ve Ca 2 +ve Mg 2 + ile DPBS 1x ile değiştirin. Alternatif olarak, vitreusu forseps ile kaldırmaya çalışın ve ince makasla kesin.</li>
	<li>Maküler bölgenin korunmasına dikkat ederek, gözü kadranlara ayırın: nazal, zamansal, üstün ve aşağı. İğneleri yoldaysa çıkarın.</li>
	<li>Gözün tereyağlı arka odacığını, Ca 2+ ve Mg2+ ile DPBS 1x içeren 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Retinayı çıkarmadan önce, siliyer kenar boşluğunda biraz kesim (V şeklinde) yaparak makulayı içeren yaprakları işaretleyin. Retina üzerinde yatan tüm vitreusları kaldırın ve kesin.</li>
	<li>Retinanın RPE'den ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek ve iki katman arasında bir miktar sıvının dolaşmasına izin vermek için retinayı kavisli bir spatula veya bir çift forseps ile birden fazla taraftan yavaşça kaldırın. NOT: Retina hala çok periferde (siliyer kenar boşlukları) ve optik sinirde tutulacaktır.</li>
	<li>Retinayı tüm yapraklardaki siliyer kenar boşluklarından kesin ve RPE'yi çizmediğinizden emin olun. Dokuyu% 4 PFA'ya yerleştirin ve ~ 1 saat boyunca inkübe edin. DPBS 1x ile 3x'i Ca 2+ ve Mg2+ ileyıkayın. Dokuyu Ca 2+ve Mg 2+ ile DPBS 1x ile doldurulmuş bir kaba aktarın ve 4 °C'de saklayın. NOT: Bu noktada, retina sadece optik sinire bağlanır. Bu, bu denemede bir duraklama noktasıdır.</li>
	<li>Numuneyi, Ca 2+ve Mg 2+ ile DPBS 1x içeren 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Optik sinir kafasını 1,5 mm'lik bir biyopsi punch ile delin ve retinayı toplayın. Nöral retinayı DPBS 1x'te Ca 2+ ve Mg2+ ile 4 °C'de saklayın. NOT: Optik sinir kafasını delmeden önce, optik siniri skleral tarafta mümkün olduğunca kestiğinizden emin olun. Bu, zımbanın hassasiyetini artıracaktır. Düz montaj %4 PFA'da sabitlendikten sonra optik sinirin delinmesi, optik sinirin etrafında bulunan RPE hücrelerine verilen hasarı azaltır.</li>
	<li>RPE / koroid tabakasını çevreden yavaşça kaldırarak ve sklera ile RPE arasındaki koroidal damarları ve bağ dokusunu bir çift Vannas yay makası ile keserek sklerayı RPE / koroidden çıkarın. RPE / koroid skleradan tamamen ayrıldıktan sonra, RPE / koroid katmanını toplayın. Dokuyu Ca 2+ve Mg 2+ ile DPBS 1x ile doldurulmuş bir kaba aktarın ve 4°C'de saklayın. NOT: Şu anda deneme duraklatılabilir.</li>
</ol>4. Boyama
<ol><li>RPE/koroidi 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın. DPBS 1x'te numuneyi Ca 2+ ve Mg2+ ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 sığır serum albümini (BSA), %0,5 Ara20 ve %0,5 Triton X-100 ile bloke edin ve geçirgenleştirin.</li>
	<li>Numuneyi, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 BSA,% 0.5 Aralık 20 ve% 0.5 Triton X-100 ile Ca2+ ve Mg 2+ ile DPBS 1x'te 1:250 seyreltmede 647 florofor ile konjuge edilmiş falloidin ile inkübe edin. DPBS 1x'te 3x'i Ca 2+ ve Mg2+ ile yıkayın.</li>
	<li>RPE/koroid numunesini 50 mm x 75 mm cam kızağa aktarın ve düzleştirin. Numuneyi daha düz hale getirmek için her "yaprağı" ikiye bölün. Makala dikkat edin. Hidrofobik bir kalemle düz montajın bir konturunu çizin.</li>
	<li>Lipofuscin otofloresansını söndürmek için,% 70 etanol içinde 1:20'ye seyreltilmiş 500 μL otofloresan söndürücü çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.</li>
	<li>DPBS 1x'te Ca 2+ve Mg 2+ ile iyice (en az 3x) yıkayın. DPBS'yi çıkarın ve montaj ortamını ekleyin. Düz montaja bir kapak camı yerleştirin ve oje ile kapatın.</li>
	<li>Flatmount'u bir floresan mikroskobu ile görüntüleyin (tercihen 10x veya 20x objektif kullanarak).</li>
</ol>5. REShAPE analizi
NOT: REShAPE AI tabanlı algoritma 10x ve 20x görüntüler üzerinde eğitildiğinden, görüntüleme sırasında 10x veya 20x objektif kullanılması şiddetle tavsiye edilir . Aksi takdirde, görüntülerin buna göre yeniden ölçeklendirilmesi gerekir.
<ol><li>Görüntüler birden fazla floresan kanalla elde edilirse, hücre sınırlarını elde etmek için kullanılan kanalı izole edin. Görüntüleri 16 bit gri tonlamalı TIF dosyaları olarak dışa aktarın. NOT: .czi dosya uzantısıyla alınan görüntülerin TIF dosyaları olarak dışa aktarılması gerekmez, ancak hücre kenarlıklarını içeren kanalın yine de yalıtılması gerekir.</li>
	<li>Yazılımı Windows x64 veya Linux (Centos 7) platformlarına yükleyin. NOT: Yazılım ve kurulum talimatları https://github.com/nih-nei/REShAPE bulunabilir.</li>
	<li>Yazılımı açın (Şekil 1).</li>
	<li>Dizinler sekmesinde, giriş ve çıkış klasörlerini seçin. Giriş dizininde, görüntüleri içeren klasörü seçin. Çıktı dizininde, yazılımın yolu otomatik olarak "giriş dizini/İşlenmiş" olarak değiştirmesine izin verin. Alternatif olarak, çıkış dizinini el ile değiştirin. NOT: Yazılım, giriş klasöründe bulunan tüm görüntüleri yineleyecektir.</li>
	<li>NN Segmentasyon Seçenekleri sekmesinde, görüntü segmentasyonu için aşağıdaki ayarları seçin:<ol><li>Toplu İş Boyutu: İyi bir başlangıç noktası olarak metin kutusuna 20 değerini yazın, ancak sistemde grafik işleme birimleri (GPU'lar) biterse bu değeri düşürün. NOT: Orijinal görüntü, işlenmek üzere daha küçük kutucuklara bölünmüştür. Toplu iş boyutu, aynı anda kaç kutucuğun işlenebileceğini belirtir.</li>
		<li>GPU mu kullanıyorsunuz?: Sistemde yeterli GPU kaynağı yoksa Hayır kutusunu işaretleyin.</li>
		<li>Dahili Ölçek: Açılır menüyü kullanarak, görüntülerin 10x veya 20x hedefiyle alınmadığı durumlarda dahili ölçeklendirmeyi Yok'tan değiştirin. Örneğin, 1/2 düğmesini kullanarak 40x görüntüyü boyutun yarısına küçültün. Açılır menüde bulunan yeniden ölçeklendirme seçenekleri aşağıdaki gibidir: 5x, 2x, Hiçbiri, 1/2, 1/5. NOT: Makine öğrenimi, 10x ve 20x görüntülerle eğitilmiştir. Diğer büyütmelerde çekilen görüntülerden hücre sınırlarını tanımayabilir. Bu durumda, ikili görüntüler tamamen siyah görünecektir.</li>
		<li>Arti Filtresi: Görüntüde bulunabilecek ve hücre sınırı segmentasyonuna müdahale edebilecek çok parlak parçacıkları (retinanın veya optik sinirin etrafındaki bağ dokusunun kalıntılarını veya küçük kısımlarını) çıkarmak için artefakt filtresi sekmesini kullanın. Varsayılan olarak filtre kullanılmaz. Açılır menüdeki yapay filtre seçenekleri aşağıdaki gibidir: Normal, Güçlü ve Zayıf.</li>
	</ol></li>
	<li>Döşenmiş Görüntü Seçeneği sekmesinde, Pad Tiles By parametresini ayarlayarak görüntü kutucukları arasındaki örtüşme miktarını belirtmek için metin kutusuna bir değer ekleyin. 100 piksellik bir örtüşme genellikle iyi çalışır.</li>
	<li>Çıktı Grafiği Seçenekleri sekmesinde, ısı haritası oluşturma ayarlarını yapın:<ol><li>Döşenmiş Görüntüleri Yeniden Yapılandır?: Sistemde büyük görüntülerin analizi için yeterli kaynak yoksa, yazılımın tüm görüntüyü yeniden oluşturmadan tek tek döşemeleri kaydederek analizi tamamlamasına izin vermek için Hayır kutusunu işaretleyin.</li>
		<li>Renkli Görüntüler Oluştur: Isı haritaları oluşturmak için açılır menüden Tümü'nü seçin.</li>
		<li>Boyama için, açılır menüde bulunan farklı renk paletlerinden birini seçin: Termal, Yeşil, Mpl-magma, Faz, Ateş, Jet, Camgöbeği Sıcak.</li>
		<li>Görüntü Biçimi için, sekmedeki seçeneklerden birini belirleyerek görüntüleri TIF veya PNG olarak kaydedin.</li>
		<li>Kullanım Kılavuzu Sınırları? özelliği ile ilgili olarak, yazılımın her görüntüde algılanan minimum ve maksimum değerleri kullanmasına izin vermek için Hayır kutusunu işaretleyin. Her şekil metriği ısı haritası için değer aralığını el ile ayarlamak üzere Evet kutusunu işaretleyin ve metin kutularına değerler ekleyerek tek tek parametreler için aralıkları seçmek üzere Sınırları Ayarla düğmesini tıklatın. İlgilenilen değerleri değiştirdikten sonra, Kaydet'e tıklayın. Tüm sınırları sıfırlamak için Varsayılanları Yükle'ye tıklayın. NOT: Birden fazla görüntüden gelen ısı haritalarının karşılaştırılması gerekiyorsa, örneğin farklı bileşiklerin hücre şekli üzerindeki etkilerini karşılaştırırken manuel sınırlar kullanın. Bu şekilde, aynı değer aralığı kullanılır. Manuel olarak girilecek değerler kümesi, numunenin türüne bağlı olarak değişir. En uygun aralığı seçmek için birkaç yineleme çalıştırmanız önerilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Analiz için Hücre Boyutu Kısıtlamaları sekmesinde, analiz için bir hücre boyutu eşiği seçin:<ol><li>Alt Hücre Boyutu'nda, metin kutusuna analize dahil edilecek en küçük hücrenin boyutunu ekleyin.</li>
		<li>Üst Hücre Boyutu'nda, metin kutusuna analize dahil edilecek en büyük hücrenin boyutunu ekleyin. NOT: Hücre boyutu birimi, Otomatik Birim Dönüştürme sekmesinde seçilen seçeneğe bağlı olarak piksellerden mikrometre kareye değişir.</li>
	</ol></li>
	<li>Otomatik Birim Dönüştürme sekmesinde, analiz için tercih edilen birimi seçin:<ol><li>Pikselleri gerçek birimlere dönüştür?'de, analizi piksel birimlerinde çalıştırmak için Hayır kutusunu işaretleyin. Analizi mikrometre cinsinden çalıştırmak için Evet kutusunu işaretleyin.</li>
		<li>Ölçek çubuğunun uzunluğu (Piksel) alanına, metin kutusuna piksel değerini girin.</li>
		<li>Ölçek çubuğunun uzunluğu (Mikronlar) alanına, metin kutusuna karşılık gelen mesafeyi mikrometre cinsinden girin.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizi başlatmak için, Go For It tuşuna basın. NOT: Yazılım, hücreler 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ve propidium iyodür (CZI seçenekleri sekmesi) ile boyandığında hücre canlılığını da ölçebilir, ancak bu RPE flatmount'lar için geçerli değildir.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig01.jpg"> Şekil 1: REShAPE grafik kullanıcı arabirimi. GUI, çalışma dizinlerini seçmek (Dizinler sekmesi), segmentasyon seçeneklerini değiştirmek (NN Segmentasyon Seçenekleri ve Döşenmiş Görüntü Seçenekleri sekmeleri), analiz parametrelerini belirtmek (Analiz ve Otomatik Birim Dönüştürme sekmeleri için Hücre Boyutu Kısıtlamaları) ve ısı haritası oluşturma (Çıktı Grafikleri Seçenekleri sekmesi) için farklı sekmelere sahiptir. Kısaltma: GUI = grafik kullanıcı arayüzü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+adherence+as+a+measure+of+retinal+adhesion%3A+Dependence+on+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).</li>
<li>Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+detachment+from+hyperosmotic+intravitreal+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).</li>
<li>Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+induced+retinal+detachment+in+the+rabbit+and+primate.+Electron+microscopy+of+the+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).</li>
<li>Ban, Y., Rizzolo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Molecular Vision. 3, 18(1997).</li>
<li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (19), 2117553119(2022).</li>
<li>Schaub, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+predicts+function+of+live+retinal+pigment+epithelium+from+quantitative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Deep learning predicts function of live retinal pigment epithelium from quantitative microscopy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 1010-1023 (2020).</li>
<li>Beatty, S., Koh, H. -H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li>
<li>Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+of+retinal+pigment+epithelial+cells+in+the+living+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).</li>
<li>Bhatia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RPE+morphometry+in+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Analysis of RPE morphometry in human eyes.</a> Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).</li>
<li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+A+comparison+to+unaffected+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

İnsan RPE ve retinalarının tutarlı ve verimli bir şekilde ayrılması bu protokol kullanılarak sağlanabilir. Bu yöntem, tüm insan retinalarında RPE şeklindeki bölgesel farklılıkların incelenmesine izin verir5. Protokoldeki önemli bir adım, RPE ve retinanın fiziksel olarak ayrılmasıdır. İki doku bazı bölgelerde tamamen ayrılmamışsa, retinayı hafifçe kaldırmalı ve dokuların kırılmamasını sağlamalıdır. Büyük düz montajların REShAPE analizi, önemli RAM kaynaklarına sahip sistemlerin kullanılmasını gerektirebilir. Bu durumda, tüm görüntünün yeniden montajı, yazılımın işlem kaynaklarının eksikliğine rağmen analizi başarıyla tamamlamasına izin vermek için devre dışı bırakılabilir.
İnsan RPE düz montajlarını segmentlere ayırmak için REShAPE kullanmanın ana sınırlaması, AI algoritmasının çoğunlukla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı RPE görüntüleri üzerinde eğitilmiş olmasıdır. Sonuç olarak, insan RPE flatmount'larının segmentasyonu daha az doğrudur. Yaşlı donörlerden elde edilen RPE hücreleri çok miktarda lipofuscin7 içerir ve otofloresansının geniş spektrumu hücre sınır segmentasyonuna müdahale eder. Gelecekte, bu tür bir örnekte hücre sınırı segmentasyonunu iyileştirmek için RPE düz montajlarının daha fazla görüntüsü kullanılacaktır. Bu sınırlamaya rağmen, REShAPE, RPE hücre sınırlarını tanımak ve segmentlere ayırmak için özel olarak eğitilmiştir ve RPE hücrelerinin Voronoi8 ve CellProfiler9 segmentasyonu gibi diğer mevcut yöntemlerden daha iyi performans gösterir.
Ayrıca, manuel segmentasyon 10 ile karşılaştırıldığında, REShAPE büyük görüntüleri hızlı bir şekilde analiz etme avantajı sağlar (~ 130.000 piksel x130.000 piksel test edilmiştir). Sonuç olarak, bu diseksiyon yöntemi yüksek oranda tekrarlanabilir ve diğer hayvan modellerine kolayca genişletilebilir. Ek olarak, yazılım, belirli tedavilerin etkisini incelemek için göz düzlüklerinde veya hücre kültürü modellerinde RPE şeklini incelemek için kullanılabilir. Son olarak, REShAPE'nin çok yönlülüğü, diğer epitel hücrelerinin analizi için geniş çapta uygulanabilir olmasını sağlar.

Retinal pigment epiteli (RPE) ve nöral retina, fotoreseptörlerin RPE'ye güçlü fizyolojik bağımlılığı nedeniyle birbirleriyle güçlü bir şekilde bağlantılıdır. Diseksiyon sırasında, nöral retinanın RPE'den mekanik olarak ayrılması, RPE hücrelerinin yırtılmasına neden olur, RPE'nin apikal kısımları retinal fotoreseptörlerin dış segmentlerine bağlı kalır. RPE-retinal adezyonun derecesi o kadar büyüktür ki, ayrılmadan sonra retinada kalan pigment miktarı, retinal adezyonun gücünü ölçmek için kullanılır1. Spesifik olarak, apikal tarafta bulunan RPE sıkı kavşaklar ve bunları birbirine bağlayan aktin yapısı, mekanik ayırma sırasında kopar. Bu nedenle, hücre kenarlıkları için RPE düz montajlarının boyanması, birçok hücrenin eksik kenarlıklara sahip olduğu yamalı bir tek katmanla sonuçlanır. Bu etki, doku diseksiyondan önce paraformaldehit (PFA) ile sabitlendiğinde, proteinler çapraz bağlandıkça daha da şiddetlenir.
İntravitreal ilaç dağıtımı üzerine yapılan çalışmalar, arka kamaraya hiperozmotik solüsyon enjeksiyonlarının retina dekolmanı indüklediğini göstermiştir 2,3. Bu deneylerde, orta vitreusa enjekte edilen 1.000 mOsm ila 2.400 mOsm arasında değişen 50 μL'lik farklı çözeltiler, dakikalar içinde retina dekolmanına neden oldu. Özellikle, yüksek ozmolariteli çözeltilere uzun süre maruz kaldıktan sonra bile, RPE sıkı bağlantıları, hem tavşan hem de maymun gözlerinin iletim elektron mikroskobik görüntülerinde bozulmadan ortaya çıktı3. Benzer bir stratejiyi takiben, RPE diseksiyonu yapmadan önce etkili bir retina dekolmanı indüklemek için orta vitreusa hiperozmotik bir D-mannitol çözeltisi enjekte ettik. D-mannitol RPE4 tarafından taşınmadığından, ozmotik bir gradyan oluşturarak yüksek bir intravitreal konsantrasyon korunur. RPE ve retinanın tüm arka kamara boyunca verimli bir şekilde ayrılması, RPE hücresel bağlantılarının korunmasını garanti eder ve tüm düz montajda RPE morfometrisinin incelenmesine izin verir. Buna ek olarak, floresan olarak etiketlenmiş RPE hücre sınırlarını tanıyan ve segmentlere ayıran, 30 farklı şekil metriğini ölçen ve görselleştirmeiçin her metriğin ısı haritalarını üreten yapay zeka (AI) tabanlı bir yazılım geliştirdik 5,6.

<table><tbody><tr><td>Biyopsi punch 1.5 mm&nbsp;</td><td>Acuderm A.Ş.</td><td>P1525</td><td></td></tr><tr><td>Sığır albümini</td><td>MP Biyomedikal</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı 50 x 75 mm, #1.5 kalınlık&nbsp;</td><td>Beyin Araştırma Laboratuvarları</td><td>5075-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli spatula</td><td>Katena</td><td>K3-6600</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x, Ca2+ ve Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>İnce Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluormount-G</td><td>Güney Biyoteknoloji</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Forseps - Dumont #5</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları 50 x 75 x 1.2 mm</td><td>Beyin Araştırma Laboratuvarları</td><td>5075</td><td></td></tr><tr><td>İğneler 21 G x 1-1 / 2 "hipodermik</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>İğneler 27 G x 1-1 / 4 "hipodermik</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305136</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit %16 &</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>PAL (Personna)</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı borular 50 mL</td><td>Newegg</td><td>9SIA4SR9M88854</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Kare tartı teknesi (81 mm x 81 mm x 25 mm)</td><td>Sigma</td><td>W2876</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Vitrektomi Sistemi</td><td>BD Visitrec</td><td>585100</td><td>isteğe bağlı</td></tr><tr><td>Şırınga 1 mL</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td>otofloresan söndürücü ve nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Affymetrix</td><td>20605</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Yaylı Makas - 3 mm kesici kenar</td><td>İnce Bilim Aletleri</td><td>15000-10</td><td></td></tr></tbody></table>

histolojik analiz için İnsan gözünden retinal pigment epitel/koroid flatmount'larının verimli ve tutarlı Üretimi

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Retinal pigment epiteli (RPE) ve retina, ışık algısını ve görmeyi düzenlemek için birlikte çalışan fonksiyonel ve yapısal olarak bağlı dokulardır. RPE apikal yüzeyindeki proteinler, fotoreseptör dış segment yüzeyindeki proteinlerle sıkı bir şekilde ilişkilidir ve RPE'yi fotoreseptörlerden / retinadan tutarlı bir şekilde ayırmayı zorlaştırır. Fotoreseptörlerin ve RPE hücrelerinin ayrı hücresel analizi için tam RPE / koroid ve retina düz montajları üretmek üzere retinayı insan gözlerinin RPE'sinden verimli bir şekilde ayırmak için bir yöntem geliştirdik. RPE tarafından taşınmayan bir şeker olan yüksek ozmolariteli bir D-mannitol çözeltisinin intravitreal enjeksiyonu, RPE hücre bağlantılarına zarar vermeden RPE ve retinanın tüm arka oda boyunca ayrılmasını indükledi. Retinaya bağlı RPE yamaları gözlenmedi. Aktinin falloidin etiketlenmesi RPE şeklinin korunmasını gösterdi ve tüm epitelin morfometrik analizine izin verdi. RPE hücre sınırlarını doğru bir şekilde tanımak ve segmentlere ayırmak ve 30 farklı şekil metriğini ölçmek için yapay zeka (AI) tabanlı bir yazılım geliştirilmiştir. Bu diseksiyon yöntemi yüksek oranda tekrarlanabilir ve diğer hayvan modellerine kolayca genişletilebilir.

Bu protokol, doğru tanımlanmış her RPE hücresi için hücre konumunun ve 30 şekil metriğinin ölçüldüğü düz montajın tek düzlemli bir görüntüsüyle sonuçlanır (Şekil 2). Giriş dizininin içinde otomatik olarak "İşlenmiş" adlı bir klasör oluşturulur. Bu klasör, "Analiz", "Renk Kodlu", "Birleşik Dosyalar" ve "Bölümlere Ayrılmış Görüntüler" adlı dört alt dizin ve analiz sırasında oluşturulan bazı geçici dosyalar içerir. "Birleşik Dosyalar" klasörü, tüm şekil ölçümlerini içeren bir elektronik tablo ve birleştirilen tüm dosyaların hücre komşu sayımlarının sıklıklarını içeren bir elektronik tablo içerir. "Analiz" klasörü, tüm şekil ölçümlerini içeren bir elektronik tablo ve her görüntü için ayrı ayrı hücre komşusunun sayımlarının sıklıklarını içeren bir elektronik tablo içerir. "Segmente Edilmiş Görüntüler" dizini, RPE hücre sınırlarının son ikili maskelerini içerir; segmentasyonun kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. "Renk Kodlu" dizini, her görüntüdeki şekil desenlerini görselleştirmek için her şekil ölçümü için ısı haritaları içerir. Şekil metriği tanımları ve kısaltmaları Tablo 1'de bulunabilir.
Bazen RPE flatmounts, özellikle optik sinirin etrafında, temiz bir şekilde çıkarılmamış artık retina parçaları içerebilir. Numunenin falloidin boyanması, retinadan gelen güçlü bir sinyalle sonuçlanır ve bu, RPE hücre sınırı segmentasyonu için sorunlara neden olabilir. Bazı fayanslar tamamen siyah görünürken, çevredeki fayanslar normal segmentasyon gösterecektir. Görüntüde bulunabilecek diğer parlak nesneler de siyah karoların oluşmasına neden olacaktır (Şekil 3). Bu gibi durumlarda, Arti Filtresi açılır menüsünde bulunan filtreleme seçeneklerinden birini (Zayıf, Normal, Güçlü) seçmek siyah karoların oluşmasını önleyecektir.
REShAPE, 8 bit veya 16 bit gri tonlamalı görüntüleri giriş olarak alır, ancak RGB görüntüleri almaz. REShAPE analizi için RGB görüntülerin kullanılması tamamen siyah ikili görüntüler üretecektir. Bu durumda, RGB görüntülerin gri tonlamaya dönüştürülmesi doğru şekilde bölümlere ayrılmış ikili görüntüler üretecektir (Şekil 4). RPE sınırlarının doğru tanınmadığı bazı durumlarda, örneğin, boyama optimal değilse veya numune bir çizik nedeniyle hasar görmüşse (Şekil 5A), büyük hücre kümeleri tek bir çok büyük hücre olarak tanımlanabilir (Şekil 5B). Bu durumda, hücre boyutu eşiği azaltılarak büyük nesneler analizin dışında bırakılabilir (Şekil 5C). Bu, Üst Hücre Boyutu metin kutusuna daha düşük bir değer eklenerek elde edilebilir. Ancak bu, ısı haritasının aralığında bir değişikliğe neden olacaktır. Bir araştırmacı bunu yapmayı seçerse, Manuel Sınırları Kullan? özelliğindeki Evet kutusunu işaretleyerek orijinal ısı haritası aralığını (Şekil 5D) korumak da mümkündür. Daha sonra, araştırmacı Sınırları Ayarla düğmesine sol tıklamalı ve manuel sınırları belirtmek için metin kutularına istenen değerleri eklemelidir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig02.jpg"> Şekil 2: Tüm insan RPE monokatmanının tam morfometrik analizi. (A) Tüm insan RPE / koroid flatmount'un (macenta: falloidin) düşük büyütmeli bir görünümü. (B) Falloidin boyalı RPE hücrelerinin yakınlaştırılmış görünümü. (C) Tüm insan RPE/koroid düz montajı için RPE hücre sınırlarının REShAPE tarafından oluşturulan segmentasyonu ve (D) karşılık gelen yakınlaştırılmış görünüm. (E) Tüm insan düz montajındaki bireysel RPE hücrelerinin hücre alanını gösteren yazılım tarafından oluşturulmuş bir ısı haritası. Sol üst köşedeki termal ölçek, kullanılan değerlerin aralığını gösterir. (F) Alana göre renklendirilmiş tek tek RPE hücrelerini gösteren karşılık gelen yakınlaştırılmış görünüm. Ölçek çubukları = (B,D,F) 50 μm, (A,C,E) 5 mm. Kısaltma: RPE = retinal pigment epiteli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig03.jpg"> Şekil 3: Parlak eserlerin filtrelenmesi. (A) Hücre sınırları (macenta: falloidin) için boyanmış bir insan RPE düz montajı, segmentasyona müdahale eden parlak alanlar (yeşil dikdörtgenler) sunabilir. (B) Tüm düz montajın RPE hücre sınırı segmentasyonu, parlak floresan bölgelerine karşılık gelen üç tamamen siyah karo (yeşil ok) içerir. (C,E) Siyah karolardan ikisi, muhtemelen bazı döküntüler olan parlak noktalar içeren alanlara karşılık gelir. (D) Siyah karolardan biri, optik sinirin etrafındaki doğru şekilde çıkarılmamış bir nöral retina parçası tarafından üretildi. Nöral retina parçaları RPE tabakasından önemli ölçüde daha parlaktır ve hücre segmentasyonunu engeller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig04.jpg"> Şekil 4: Giriş görüntüsü gereksinimi. Hücre kenarlıkları için boyanan RPE hücreleri, REShAPE analizi için (A) RGB veya (B) gri tonlamalı 16 bit görüntüler olarak kaydedildi. (C) RBG görüntü analizinin çıktısı siyah bir ikili görüntüdür, (D) gri tonlamalı görüntünün analizi ise hücre kenarlıklarının doğru şekilde bölümlere ayrılmış bir ikilisini üretir. REShAPE yalnızca 8 bit veya 16 bit gri tonlamalı görüntüleri analiz edebilir. Ölçek çubukları = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig05v2.jpg"> Şekil 5: Suboptimal sonuçlar . (A) RPE tek katmanının bir kısmının faloidin ile boyanmış hücrelerin yanlışlıkla çizildiği bir görüntüsü. (B) Hücre alanının boyutuna göre renklendirilmiş RPE hücrelerinin ısı haritası. Büyük bir üst hücre boyutu eşiği, analizde büyük nesneler içerir. (C) Büyük nesneleri analizden dışlamak için daha küçük bir üst hücre boyutu eşiğinin seçildiği bir hücre alanı ısı haritası. (D) Daha küçük bir üst hücre boyutu eşiğinin seçildiği ve orijinal olarak kullanılan ısı haritası aralığını korumak için manuel sınırların ayarlandığı bir hücre alanı ısı haritası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig05largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: REShAPE parametreleri. Tablo, her parametrenin tanımını ve ham elektronik tablolarda ("_Data.csv" dosyaları) ve ısı haritalarında kullanılan kısaltmaları bildirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761_Table-1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

İnsan gözünde retinal pigment epitelini (RPE) retinadan etkin bir şekilde ayırmak ve RPE'nin histolojik ve morfometrik analizleri için tüm RPE / koroid düzlüklerini üretmek için bir yöntem tanımladık.

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Bu yöntem, RP hücrelerinin tüm insan retinasındaki fenotipik farklılıklarını anlamaya yardımcı olur. Davide Ortolan'ın geliştirdiği diseksiyon tekniği, RP ve retina arasında bir dekolmanı oluşturmada oldukça tekrarlanabilir. Ve REShAPE yazılımı, RP düz montajların büyük görüntülerini analiz etmede gerçekten dikkate değerdir.Davide'in geliştirdiği yöntem, RP fenotipindeki bölgesel farklılıkları farklı retinal dejeneratif hastalıkları olan hastalardan incelemek için kullanılabilir. Başlamak için, 50 mililitrelik konik tüpü 5 mililitrelik işaretin biraz altında kesin. Sıcak tutkal kullanarak tüp ucunu tartım teknesinin dibine takın.Ardından, silikon elastomer kitinin iki bileşenini 10'a 1 oranında karıştırarak havayı hapsetmekten kaçının. Karışımı, yuvarlak tabanlı tüpün bu küresel parçasını içeren tartım teknesine dökün. Silikonu gece boyunca oda sıcaklığında kürleyin.Tartım teknesini ve yuvarlak alt boruyu kürlenmiş silikon kalıptan çıkarın. İlk önce, 1 mililitrelik bir şırıngayı 1700 milimol D-Mannitol çözeltisi ile doldurun ve 21 gauge iğneye takın. Gözün ön odasını delmekten kaçınmak için iğneyi pars planadan geçirin ve çözeltinin 400 mikrolitresini vitreusa enjekte edin.Gözü 45 dakika oda sıcaklığında bırakın. Bir çift ince makas ve forseps kullanarak, ön odayı pars plana seviyesinde kesin. Arka göz odacığını kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS ile doldurun.Stereo mikroskop altında, retinada sarı bir nokta olarak görselleştirilen makulayı lokalize edin. Maküler bölgenin korunmasını sağlarken gözü kadranlara, yani nazal, zamansal, üstün ve alt kadranlara kesin. İğneleri yoldaysa çıkarın.Kelebeği gözün arka odasına, kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Retinayı çıkarmadan önce, siliyer kenar boşluğunda V şeklinde bir kesim yaparak makulayı içeren yaprağı işaretleyin. Retina üzerinde yatan tüm vitreusları kaldırın ve kesin.RPE'yi çizmemek için retinayı tüm yapraklardaki siliyer kenar boşluklarından kesin. Dokuyu% 4 PFA'ya yerleştirin ve bir saat boyunca inkübe edin. Kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS ile üç kez yıkayın.Dokuyu aynı tamponla doldurulmuş bir kaba aktarın ve 4 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, numuneyi kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Optik sinir kafasını 1,5 milimetrelik bir biyopsi yumrukla delin.Retinayı toplayın ve aynı tamponda 4 santigrat derecede saklayın. Sklerayı RPE koroidinden çıkarmak için, RPE koroid tabakasını çevreden yavaşça kaldırın. Daha sonra bir çift Vannas Yaylı Makas ile, sklera ve RPE arasındaki koroidal damarları ve bağ dokusunu kesin.Skleradan tamamen ayrıldıktan sonra, RPE koroid tabakasını toplayın. Dokuyu kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS ile dolu bir kaba aktarın ve 4 santigrat derecede saklayın. RPE koroidini altı delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.Numuneyi oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin ve geçirgenleştirin. Numuneyi, geçirgenlik tamponunda 1 ila 250 seyreltmede 647 florofor ile konjuge edilmiş falloidin ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'de üç kez yıkayın.RPE koroid örneğini 50 x 75 milimetrelik bir cam slayda aktarın ve düzleştirin. Numuneyi daha düz hale getirmek için her bir yaprağı ikiye bölün. Hidrofobik bir kalemle düz montajın bir konturunu çizin.Lipofuscin otofloresansını söndürmek için, 500 mikrolitre otofloresan söndürücü çözeltisi ekleyin ve iki dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'lerde iyice yıkayın. DPBS'yi çıkarın ve montaj ortamını ekleyin.Düz montaja bir kapak camı yerleştirin ve oje ile kapatın. Yazılımı açın. Dizinler sekmesinde, giriş ve çıkış klasörlerini seçin.Çıkış dizininde, yazılımın giriş dizininin veya işleminin yolunu otomatik olarak değiştirmesine izin verin. Alternatif olarak, çıkış dizinini el ile değiştirin. Isı haritaları oluşturmak için, renkli görüntüler oluştur sekmesindeki açılır menüden tümünü seçin.Yazılımın her görüntüde algılanan minimum ve maksimum değerleri kullanmasına izin vermek için manuel sınırları kullanma özelliğindeki hayır kutusunu işaretleyin. Her şekil metrik ısı haritası için değer aralığını manuel olarak ayarlamak üzere Evet kutusunu işaretleyin. Ardından, sınırları ayarla düğmesine tıklayın ve tek tek parametreler için aralıklar seçmek üzere metin kutularına değerler ekleyin.İlgilenilen değerleri değiştirdikten sonra, kaydet'e tıklayın. Tüm sınırları sıfırlamak için düşük varsayılanlara tıklayın. Daha düşük hücre boyutunda bir hücre boyutu eşiği seçmek için, analize dahil edilecek en küçük hücrenin boyutunu ekleyin.Üst hücre boyutunda, dahil edilecek en büyük hücrenin boyutunu ekleyin. Pikselleri gerçek birimlere dönüştürürken, analizi piksel birimlerinde çalıştırmak için hayır'ı, analizi mikrometre cinsinden çalıştırmak için evet'i işaretleyin. Ölçek çubuğu piksellerinin uzunluğu alanına, metin kutusuna piksel değerini girin.Ölçek çubuğu mikronlarının uzunluğunda, karşılık gelen mesafeyi mikrometre cinsinden girin. Analizi başlatmak için, bunun için git'e basın. Bu protokol, hücre konumunun RPE hücre sınırlarının REShAPE tarafından oluşturulan segmentasyonu ile tanımlandığı düz bir montajın tek düzlemli görüntüsüyle sonuçlanır.Ayrıca, tek tek RPE hücrelerinin hücre alanı da dahil olmak üzere 30 şekil metriği, doğru tanımlanmış her RPE hücresi için ölçülür. Artık retina parçalarından veya diğer parlak nesnelerden kaynaklanan siyah karolar, RT filtresi açılır menüsünde bulunan filtreleme seçeneklerinden biri seçilerek çıkarılabilir. Yeniden şekillendirme analizi için RBG görüntülerinin kullanılması tamamen siyah ikili görüntüler üretecektir.Bu durumda, RGB görüntüleri gri tonlamaya dönüştürmek, doğru şekilde bölümlere ayrılmış ikili görüntüler üretecektir. Boyama optimal değilse veya numune bir çizik nedeniyle hasar görmüşse, büyük hücre kümeleri tek bir çok büyük hücre olarak tanımlanabilir. Bu durumda, hücre boyutu eşiği değiştirilerek büyük nesneler analizin dışında bırakılabilir.Düz bir doku elde etmek için, bu adımlar uzun zaman alabilse bile, RP ve koroidin skleradan ayrılması gerekir. RP düz montajın oluşturulmasını takiben, RP tek katmanının farklı bölgelerini inceleyebilmeniz için ek RPE işaretleyicileri için boyama yapmak mümkündür. Bu yöntemi kullanarak, farklı retinal dejeneratif hastalıklara farklı şekilde duyarlı beş farklı RP popülasyonu keşfettik.

efficient-consistent-generation-retinal-pigment-epitheliumchoroid

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Bu çalışma, eksplant kullanımı sırasında retina bütünlüğünü tehlikeye atmayı önleyen yeni bir insan organotipik retina kültürü (HORC) modeli geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu, retinanın aşırı vitreus ve alttaki retina pigment epitel-koroid (RPE-choroid) ve sklera ile kültleşmesi ile elde edilir.

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Keşfedin, insan retinasından RPE/choroid flatmount üretimi için tekrarlanabilir diseksiyon tekniği ve REShAPE yazılımı ile morfometrik analiz. Retina dejeneratif hastalıklarda fenotipik farklılıkları inceleyin.

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

Daha fazla video keşfet