Name: Tarama Uygulamaları için İnsan iPSCden Elde Edilen Nöron-Astrosit Kokültürlerinin Üç Boyutlu Biyobaskısı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Keşfedin, iPSC kaynaklı nöron ve astrositlerin hidrojel içinde 3D biyobaskı ile yüksek verimli ko-kültür protokolü. Yedi günde yüksek canlılık ve nörit uzaması sağlayan bu yöntem, nörobilim araştırmalarında otomasyonu artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Alex Volkerling, Martin Engel ve Rachel Bleach'e protokolün geliştirilmesindeki yardımları ve makaleyle ilgili geri bildirimleri için teşekkür eder.

iPSC'den Türetilmiş Nöronların ve Astrositlerin 3D Biyobaskılı Kokültürleri

<ol><li>Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+burden+metrics+the+innovations+of+leading+pharmaceutical+companies%3A+a+global+and+regional+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Globalization+and+Health%22%5BJournal%5D)">Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study.</a> Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).</li>
<li>Potkin, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+treatment-resistant+schizophrenia%3A+paths+to+antipsychotic+resistance+and+a+roadmap+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Schizophrenia%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research.</a> npj Schizophrenia. 6, 1(2020).</li>
<li>Keswani, C., et al. The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZahra%2C+W+%22Bioeconomy+for+Sustainable+Development%22">Bioeconomy for Sustainable Development</a>. , Springer, Singapore. (2019).</li>
<li>Perucca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacological+treatment+of+epilepsy%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Epileptologica%22%5BJournal%5D)">The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives.</a> Acta Epileptologica. 3 (1), 22(2021).</li>
<li>Nikolakopoulou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+translational+engineered+in+vitro+models+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system.</a> Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).</li>
<li>Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+models+of+neurodegeneration%3A+implementation+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).</li>
<li>Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+brain+extracellular+matrix+in+vitro%3A+A+review+of+current+methodologies+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges.</a> Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).</li>
<li>Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+perineuronal+nets+and+the+perinodal+extracellular+matrix+in+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).</li>
<li>Lam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+extracellular+matrix+accelerates+the+formation+of+neural+networks+and+communities+in+a+neuron-glia+co-culture+on+a+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array.</a> Scientific Reports. 9, 4159(2019).</li>
<li>Roll, L., Lessmann, K., Brüstle, O., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+maintain+the+expression+of+neural+stem+cell-associated+glycoepitopes+and+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix.</a> Cells. 11 (5), 760(2022).</li>
<li>Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+to+study+extracellular+matrix+development+during+neural+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration.</a> Cells. 8 (3), 242(2019).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinted+hyaluronic+acid-based+cell-laden+scaffold+for+brain+microenvironment+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Design+and+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation.</a> Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).</li>
<li>Liaw, C. -Y., Ji, S., Guvendiren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+3D+hydrogels+for+personalized+in+vitro+human+tissue+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165(2018).</li>
<li>Ma, J., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+mechanism+of+three-dimensional+hydrogel+system+in+regulating+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).</li>
<li>Belfiore, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+3D+cell+culture+models+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876(2021).</li>
<li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).</li>
<li>Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+high+throughput+drug+discovery+in+3D+cell+cultures+through+a+novel+bioprinting+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technology%22%5BJournal%5D)">Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow.</a> SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).</li>
<li>Takamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+age+on+global+and+regional+brain+stiffness+in+young+and+middle-aged+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).</li>
<li>Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328(2020).</li>
<li>de Souza, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+variability+examined%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Organoid variability examined.</a> Nature Methods. 14 (7), 655-655 (2017).</li>
<li>Hernández, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+variabilities+of+human+iPSC-derived+cerebral+organoids+are+a+major+issue+for+the+modelling+of+phenotypes+observed+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Review+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer's disease.</a> Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPS+cells+into+sensory+neurons+exhibits+developmental+stage-specific+cryopreservation+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960(2021).</li>
<li>Nishiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+and+efficient+method+for+cryopreservation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+stem+and+progenitor+cells+by+a+programmed+freezer+with+a+magnetic+field%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field.</a> Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).</li>
<li>Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell+recovery%3A+Freezing+and+thawing+optimization+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells.</a> Cells. 11 (5), 799(2022).</li>
<li>Harbom, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+rho+kinase+inhibition+on+morphological+and+electrophysiological+maturity+in+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons.</a> Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).</li>
<li>Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+neurite+outgrowth+using+nano-structured+scaffolds+coupled+with+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin.</a> Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).</li>
<li>Tarus, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+hyaluronic+acid+hydrogels+to+promote+neurite+outgrowth+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).</li>
<li>Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiative+Cell+Census+Network+%28BICCN%29.+A+multimodal+cell+census+and+atlas+of+the+mammalian+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).</li>
<li>Dauchy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+transcriptional+regulation+of+ABC+transporters+and+cytochromes+P450+in+hCMEC%2FD3+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).</li>
<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia%2Fneuron+ratio%3A+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li>
<li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain%3A+A+review+of+150+years+of+cell+counting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+stem+cell-derived+central+nervous+system+cells+enables+astrocyte+growth%2C+vasculogenesis+and+enhances+neural+differentiation%2Ffunction%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+deterministic+forward+programming+of+human+pluripotent+stem+cells+into+neurons%2C+skeletal+myocytes%2C+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li>
</ol>

CW, NC ve JB, Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, Londra, Birleşik Krallık'ın çalışanlarıdır. YH, Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, ABD'nin bir yan kuruluşu olan Merck Sharp & Dohme LLC'nin bir çalışanıdır.
Şekil bir, Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

CNS'nin doğru modellerine duyulan ihtiyaç hiç bu kadar yüksek olmamıştı ve iki boyutlu (2D) geleneksel hücre kültürü modellerinin sınırlamaları, son yıllarda bir nesil karmaşık CNS modelini yönlendirdi19. Bununla birlikte, nöral hücre tipleri ve ECM arasındaki etkileşimleri temsil eden birçok karmaşık 3B model, bu modellerin endüstriyel süreçlerde uygulanmasını engelleyecek sınırlamalara sahiptir 6,20,21. Bu protokolde, 96 kuyucuklu ve 384 kuyucuklu formatlarda biyoaktif bir hidrojel iskelesi oluşturmak için 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak bu sınırlamaların bazılarını çözmeyi amaçlayan, insan iPSC'den türetilmiş nöronların ve astrositlerin bir 3D kokültür modelini geliştiriyoruz.
Bu modelleri geliştirme metodolojisi, plaka haritası tasarım yazılımı, otomatik olarak oluşturulan baskı protokolleri ve biyoyazıcıdan yönlendirilen baskı süreci aracılığıyla basitleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokolde kullanılan hassas iPSC türevi hücre tiplerinin hassas doğası nedeniyle, çözdürme ve kültürde aşağıdaki kritik adımlara dikkat edilmelidir. İlk olarak, ROCK inhibitörünün (ROCKi) dahil edilmesi, biyo-baskı işlemi boyunca ve erken kültür sırasında çeşitli faydalara sahiptir. Hücre çözülmesi, nöronların stres tepkisi yaşayabileceği kritik bir noktadır ve uygun olmayan çözülme protokolleri hayatta kalma şansını azaltabilir22. Tipik olarak hücrelerin çözülmesi, ortam eklenmesi ve hücrelerin inkübatör sıcaklığına mümkün olduğunca verimli bir şekilde yükseltilmesi önerilir23. Bununla birlikte, bu protokolde açıklanan biyo-baskı işlemi sırasında, nöronların ve astrositlerin ortam yerine bir aktivatör çözeltisinde yeniden süspanse edilmesi gerekir ve hücreler, baskı çalışmasının sonuna kadar (çözülme sonrası 30 dakikaya kadar) oda sıcaklığının üzerine çıkarılmayacaktır. Bu nedenle, çözüldükten hemen sonra ROCKi'nin ortama eklenmesi ve bunun iki santrifüj adımı sırasında (2.1--2.7 ve 1.3.15-1.3.20 adımları) dahil edilmesi, hücre stres yollarını inhibe etmek için zorunludur, bu da daha düşük canlılık seviyelerine neden olur24. Ayrıca, ROCKi'nin nörit büyümesini teşvik ettiği ve nöronal olgunlaşmayı iyileştirdiği gösterilmiştir25. Bu nedenle, biyobaskı sonrası 48 saat boyunca ROCKi takviyesine devam edilir. Bununla birlikte, hücreler tahlil için kullanılmadan önce sonraki ortam değişiklikleri sırasında tam yıkamayı sağlamak için 48 saat sonra ROCKi takviyesinin çıkarılması zorunludur.
Kritik dikkat gerektiren bir diğer adım, baskı sonrası medya ekleme ve medya değişiklikleri sırasındadır (adım 2.8-2.13). Biyobaskılı hidrojel iskele, gri maddeye eşdeğer, yalnızca 1,1 kPa'lık eşdeğer bir biyomekanik sertliğe sahiptir. Adım 2.10'da açıklandığı gibi, rahatsızlığı önlemek için ortam ekleme ve aspirasyon sırasında kuyunun kenarına nazikçe pipetlemek çok önemlidir. Bu, jel seviyesinin toplam kuyu hacminin daha yüksek bir oranını kapladığı 384 oyuklu plakalar için özellikle önemlidir. Bu yöntem, hücrelerin kenar kaldırmasını ve nörit büyümelerinin kesilmesini önlemek için 2D kontrol kuyularında da kullanılmalıdır. Yazarlar ayrıca, iPSC'den türetilmiş hücre kültürleri için kullanılan bir biyogüvenlik kabinininkine eşdeğer bir dikkatle ele alınması gereken biyo-yazıcı içindeki steril tekniğin önemini vurgulamak istemektedir. Bu, yeşil ışık yakma ve baskı prosedürlerinde kullanılan %70 EtOH ve dH2O'nun steril filtrelenmesini, elleri biyoyazıcının içine ve dışına hareket ettirirken kartuşların ve plakaların kapaklarının tutulmasını ve baskıdan önce ve sonra biyoyazıcının içindeki yüzeylerin %70 etanol mendille dekontamine edilmesini içerir.
Bu modeli geliştirmek için seçilen biyomürekkep ve aktivatör solüsyonlarından oluşan biyo-baskılı hidrojel iskelesi, RASTRUM biyoyazıcısında kullanılmak üzere Inventia Life Science tarafından geliştirilen bir dizi biyomürekkep ve aktivatör solüsyonundan seçilmiştir. Laminin ve hyaluronik asit, aksonal rehberlik, sinaps oluşumu ve perinöronal ağın oluşumundaki rolleri nedeniyle iPSC kaynaklı nöronal olgunlaşma ile ilgili moleküller olarak tanımlanmıştır26,27. Ayrıca, daha düşük yoğunluklu hidrojellerin nöronlardan12 daha iyi nörit büyümesi sağladığı gösterildiğinden, 1.1 kPa'lık bir biyomekanik sertlik seçilmiştir. Şirket içinde veya farklı bir ticari tedarikçiden farklılaştırılan nöronlar ve astrositler kullanılarak protokolde değişiklikler yapılırsa, en destekleyici hidrojel iskelesini belirlemek için bir matris seçim testi yapılması önerilir15. Ayrıca, optimum canlılığı sağlamak ve hidrojel aşırı kalabalıklaşmasını önlemek için hücre kaynaklarında değişiklikler yapılırsa hücre yoğunluğunun da optimize edilmesi gerekebilir. Biyoyazıcı işleviyle ilgili tüm değişiklikler ve sorun giderme için yazarlar, üreticilerle iletişime geçmenizi ve üretici protokollerine başvurmanızı önerir.
CNS, hepsi farklı beyin nişlerinde bulunan ve nöral fonksiyona katkıda bulunan belirli rollere sahip çok çeşitli nöronal alt tipler ve glial hücreler içerir28. Bu geniş kapsam bağlamında, bu model yalnızca en bol bulunan iki hücre tipini (astrositler ve uyarıcı glutamaterjik nöronlar) temsil eder. Mikroglia, oligodendrositler ve kan-beyin bariyeri oluşturan endotel hücreleri gibi önemli hücre tipleri bu sistemden çıkarılır. Mikroglia'nın dahil edilmesi, nöroimmün etkileşimlere odaklanmada önemli olabilir ve oligodendrositler, merkezi miyelinasyonu etkileyen hastalıklarda ilgi çekici olabilir. Patolojideki rollerine ek olarak, kan-beyin bariyeri oluşturan endotel hücreleri gibi hücreler, bu modelin farmakokinetik tahliller için kullanımını etkileyebilecek ilaç metabolize edici enzimler salgılar29. Modelin bir başka sınırlaması, astrositlerin nöronlara oranı olabilir; Astrositlerin nöronlara oranı, beyin bölgeleri arasında büyük farklılıklar gösterir ve önerilen değerler 1:1 ile 1:330,31 arasındadır. Bu model, nöronlara yaklaşık 1:1.5 astrosit oranına sahiptir; Bu nedenle, bu model, beyaz cevher alanları30 gibi astrositlerin daha bol olduğu beyin bölgelerini modellemekle ilgili olmayabilir.
Son yıllarda 3D biyo-baskılı kokültür modelleri geliştirmek için başka protokoller de yayınlanmıştır. Sullivan ve ark., 2021 tarafından yayınlanan bir yayın, 2D kültürlere kıyasla yüksek baskı sonrası canlılık ve nöronal fonksiyonun iyileştirildiğini gösteren, iPSC'den türetilmiş nöral progenitör hücreleri kullanan bir 3D biyobaskılı nöral model sundu32. Ancak bu protokolde hücre kaynağı olarak nöral progenitör hücreler kullanılmış ve 4 hafta kültürde tutulmuştur. Bu protokolde, ticari olarak temin edilebilen iPSC türevi glutamaterjik nöronlar ve astrositler kullanıldı. Bu, 7 gün gibi kısa bir sürede birlikte kültürlenmiş hücrelerden oluşan bir 3D ağın kurulmasına izin verir; Nörit büyüme analizinin gösterdiği gibi, nörit büyümesi 24 saat içinde başlar ve hücre büyümesinin izlendiği 156 saatlik periyot boyunca doğrusal bir şekilde devam eder. Bu ağların hızlı bir şekilde kurulması kısmen, 2D kültürde bile 7 gün içinde olgun nöronal alt tip belirteçlerinin ekspresyonunu gösteren NGN2'nin optimize edilmiş doksisiklin ile indüklenebilir gen ekspresyonunu kullanan glutamaterjik nöronların kullanımına bağlanabilir33. Bu tekniği kullanarak bu büyüme periyodunun kısaltılması, biyofarmasötik endüstrisinde modellerin uygulanması için önemlidir, çünkü tahlil geliştirme, hücre modellerinin hızlı bir şekilde geri dönüşünü ve geliştirilmesini gerektirir15.
Sonuç olarak, bu model, tarama amacıyla hızlı ve uygun bir şekilde kurulan bir 3D nöron ve astrosit modeli için potansiyel göstermektedir. Bu model türü için gelecekteki uygulamalar, hasta veya gen düzenlenmiş hastalık iPSC hatlarını kullanarak farklı hastalıklara genişleme fırsatı ile farklı CNS hastalıklarında ilaç keşif çabaları için olabilir. Ayrıca, doksisiklin ile indüklenebilir NGN2 ekspresyonu iPSC'den türetilen glutamaterjik nöronların kullanımı, hücrelerin daha kısa sürede olgunluğa ulaşmasını sağlar ve bu, nörodejenerasyon araştırmaları için yaşlanan beynin modellerini geliştirmek için kullanılabilir. Bu sistem, mikroglia ve oligodendrositler dahil olmak üzere kokültürde ek hücre tiplerinin kullanılmasıyla da genişletilebilir.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated from:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD R&#38;D Innovation Centre Ltd 
2Merck &#38; Co., Inc.
to:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD Research Laboratories, London, UK 
2Merck &#38; Co., Inc., Rahway, NJ, USA

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

İlaç keşif endüstrisinde merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıklarına yönelik araştırmalar genişliyor1. Bununla birlikte, epilepsi, şizofreni ve Alzheimer hastalığı gibi birçok yaygın CNS hastalığının hala iyileştirici tedavileri yoktur 2,3,4. CNS hastalıklarında etkili terapötiklerin eksikliği, en azından kısmen, beynin doğru in vitro modellerinin eksikliğine bağlanabilir5. Bu, mevcut in vitro modeller ile in vivo veriler arasında bir translasyon boşluğuna ve ardından araştırma çabalarında bir darboğaza neden oldu.
Bu translasyonel boşluktan hareketle, son yıllarda nöral organoidler, nörosferoidler ve iskele tabanlı modeller dahil olmak üzere yeni 3D hücre modellerinin geliştirilmesinde önemli bir artış olmuştur6. Bu modellerin 3B yapısı, biyomekanik stresler, hücre-hücre temasları ve beyin hücre dışı matrisi (ECM) dahil olmak üzere nöral mikro çevrenin özetlenmesine yardımcı olur7. Beyin ECM'si, nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve nörovasküler ünite7 dahil olmak üzere nöral hücre tipleri arasındaki boşluğu kaplayan nörofizyolojinin dinamik bir unsurudur. Beyin ECM'sinin rekapitülasyonunun nöronal morfolojiyi ve nöronal ateşlemeyi etkilediği gösterilmiştir ve beynin birçok karmaşık 3D modeli, ECM proteinlerinin nöral hücre tipleri 8,9,10,11 tarafından biriktirildiğini göstermiştir. İskele tabanlı modeller, beyin ECM12'yi temsil eden gözenekli bir sentetik veya biyolojik hidrojel matrisi içinde süspanse edilmiş olgun nöral kokültürlerden oluşur. Organoid ve sferoid sistemlerden farklı olarak, iskele tabanlı 3D modeller, mevcut ECM proteinlerinin özelleştirilmesine izin verir ve biyomekanik stresleri taklit etmek için hidrojel sertliğinin ayarlanabilirliği avantajına sahiptir13,14.
3D nöral modellerin ezici bir çoğunluğu beyin mikroçevresinin artan bir özetini gösterse de, tüm modeller ilaç keşif uygulamalarını uygulamak için uygun değildir15. Bir 3D modelin endüstriyel süreçlere uygulanabilmesi için, sistemin tarama uygulamaları için verim gereksinimlerini karşılaması ve nispeten kısa bir geliştirme süresinesahip olması gerekir 16. 3D Biyobaskı, insan hatasının neden olduğu değişkenliğin ortadan kaldırılmasının yanı sıra hızlı geliştirme süresi, artan verim ve daha yüksek düzeyde hassas kontrol ile 3D iskele tabanlı nöral modeller oluşturma potansiyeli sunan yeni bir teknolojidir17. Bu protokol, bir hidrojel iskelesinde insan iPSC'den türetilmiş glutamaterjik nöronların ve astrositlerin 3 boyutlu bir kokültür modelini sunar. Bu hidrojel iskelesi, mimetik bir biyomekanik sertlik içinde fizyolojik olarak temsili biyoaktif peptitler (RGD, IKVAV, YIGSR) ve ECM proteinleri içerir. Bu tam uzunluktaki ECM proteinleri, insan korteksinde bol miktarda bulunan tam uzunlukta laminin-211 ve hyaluronik asidi içerir ve in vivo ölçümlere göre 1.1 kPa sertliğesahiptir 18. Bu model, ilaç keşfi için pratiklik ile tasarlanmıştır ve nörit büyüme tahlillerinin yanı sıra hücre boyaları ve antikorlarla görüntüleme teknikleri kullanılarak tarama analizine uygun 96 oyuklu veya 384 oyuklu plaka formatında bir 3D biyoyazıcı kullanılarak oluşturulmuştur. Hücreler, kültürden sonraki 7 gün içinde nöral hücre tipi belirteçlerinin ekspresyonunu ve nörit ve astrositik projeksiyonların büyümesini gösterir. Bu nedenle, bu protokol, ilaç keşif uygulamalarında kullanılmak üzere yüksek verimli bir 3D nöral kokültür modeli geliştirme metodolojisini sunacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig01.jpg"> Şekil 1: 3D biyobaskı kokültürleri için kullanılan metodolojiye açıklayıcı bir genel bakış. İnsan iPSC'den türetilen nöronlar ve astrositler, biyoaktif peptitler içeren aktivatör ve biyomürekkep çözeltileri ile birleştirilir ve isteğe bağlı biyo-baskı teknolojisi kullanılarak 96 kuyucuklu veya 384 oyuklu formatlarda hidrojel iskelelere biyolojik olarak basılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermofisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>384 oyuklu plaka</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>PerkinElmer</td><td>6055300</td><td></td></tr><tr><td>Aktivatör sıvısı F299</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td> Aktivatör sıvısı F3 Inventia Life Science N/A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x) eksi Vit A</td><td>Thermofisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Bioink sıvısı F261</td><td>Inventia Yaşam Bilimleri</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bioink sıvısı F32</td><td>Inventia Yaşam Bilimleri</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5207</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Thermofisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG H & L Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150115</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG H & L Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Abcam</td><td>ab228551</td><td></td></tr><tr><td>İnsan BDNF Rekombinant Protein</td><td>Thermofisher</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>İnsan NT3 Rekombinant Protein</td><td>Thermofisher</td><td>PHC7036</td><td></td></tr><tr><td>iCell Astrositler</td><td>Fujifilm CDI</td><td>1434</td><td></td></tr><tr><td>INCell Analizörü 6500HS</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>N/A</td><td>yüksek içerikli görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Incucyte S3</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ioGlutamaterjik Nöronlar (Büyük şişe)</td><td>Bit.bio</td><td>e001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (1 mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Canlı/ölü kiti (Calcein-, Ethidium homo-dimer-1)</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-BIII tübülin NL637 konjuge</td><td>R& D sistemleri</td><td>SC024</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal medya</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live (Hoechst 33342)</td><td>Thermofisher</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermofisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PEI %50 H'de2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181978</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Borat Tamponu 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28341</td><td></td></tr><tr><td>Prizma</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Veri analizi yazılımı</td></tr><tr><td>Tavşan anti-iyonotropik glutamatre reseptörü 2 (GluR2)</td><td>Abcam</td><td>ab206293</td><td></td></tr><tr><td>RASTRUM(TM) Biyoyazıcı</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A Biyoyazıcı</td><td></td></tr><tr><td>RASTRUM(TM) Biyoyazıcı Kartuşları</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td>Biyoyazıcı Kartuşları</td></tr><tr><td>RASTRUM(TM) Hedefleme plakası</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td>Hedefleme plakası</td></tr><tr><td>Rho kinaz (ROCK) inhibitörü</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Koyun anti-GFAP NL493 konjuge</td><td>R& D sistemleri</td><td>SC024</td><td></td></tr><tr><td>Sinyaller Görüntü Sanatçısı&nbsp;</td><td>PerkinElmer&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Görüntü analiz platformu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Ters mikroskop platformu&nbsp;</td></tr></tbody></table>

tarama uygulamaları için İnsan ipsc'den elde edilen nöron-astrosit kokültürlerinin Üç boyutlu biyobaskısı

Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

Bir hücre modelinin ilaç taraması için uygun olması için, sistemin verimli bir geliştirme süresine sahip olmasının yanı sıra verim ve homojenlik gereksinimlerini karşılaması gerekir. Ancak, yayınlanan birçok 3B model bu kriterleri karşılamamaktadır. Bu nedenle, erken ilaç keşif uygulamalarında kullanışlılıklarını sınırlar. Üç boyutlu (3D) biyo-baskı, geliştirme süresini hızlandırmak, standardizasyonu artırmak ve verimi artırmak için 3D modellerin geliştirilmesine uygulanabilen yeni bir teknolojidir. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı glutamaterjik nöronların ve astrositlerin 3D biyobaskılı kokültür modellerini geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu kokültürler, biyoaktif peptitler, tam uzunlukta hücre dışı matris (ECM) proteinlerinden oluşan bir hidrojel matrisi içine ve 1.1 kPa'lık bir fizyolojik sertliğe sahiptir. Model, 96 kuyucuklu ve 384 kuyucuklu formatlarda hızlı bir şekilde kurulabilir ve ortalama %72'lik bir baskı sonrası canlılık sağlar. Bu modeldeki astrosit-nöron oranının, insan beyni için fizyolojik aralık içinde olan 1: 1.5 olduğu gösterilmiştir. Bu 3D biyobaskılı hücre popülasyonları ayrıca olgun nöral hücre tipi belirteçlerinin ekspresyonunu ve kültürden sonraki 7 gün içinde nörit ve astrosit projeksiyonlarının büyümesini gösterir. Sonuç olarak, bu model, nörit büyüme testlerinin yanı sıra hücre boyaları ve immün boyama teknikleri kullanılarak analiz için uygundur. Bu fizyolojik olarak temsili modelleri geniş ölçekte üretme yeteneği, onları sinirbilim hedefleri için orta ila yüksek verimli tarama testlerinde kullanım için ideal hale getirir.

Nörit büyüme analizi Bu protokolde, iPSC'den türetilen glutamaterjik nöronlar ve astrositler, 3D biyoyazıcı kullanılarak bir hidrojel matrisine kokültürde biyo-basıldı. Baskıdan sonraki ilk 7 gün boyunca, hücreler her 12 saatte bir canlı hücre mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Biyo-baskı sonrası, hücreler yuvarlak bir morfolojiye sahip olmalı ve hidrojel matrisi boyunca dağılmalı, kültürün ilk birkaç günü boyunca birkaç çıkıntı ile daha küçük hücre kümeleri oluşturmak üzere kademeli olarak değişmelidir (temsili sağlıklı hücre büyümesi için Ek Video 1'e bakın). 4. günde, sağlıklı hücreler, nörit çıkıntıları ile birbirine bağlanan daha büyük kümeler oluşturmak için jel boyunca göç edecektir. 7. günde, neredeyse hiç tek hücre kalmamalı, birbirine bağlanan nörit demetleri ve astrositik çıkıntılar güçlendirilmiş görünmelidir ve kümelerden birçok küçük nörit çıkıntısı görülebilir (Şekil 2A). 7 günlük büyüme periyodu boyunca alınan bir dizi canlı hücre parlak alan görüntüsü kullanılarak, bölüm 3'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi nörit büyümesinin bir analizi yapıldı. Bu analiz, nörit büyümesinin 12 saat ile 156 saat arasında neredeyse doğrusal bir şekilde (R2 değeri = 0.84) arttığını göstermiştir (Şekil 2B). Bu nörit büyümesi döneminde, hücre gövdesi kümeleri de boyut olarak artar (bkz. Ek Video 1), bu da hidrojel boyunca hücre göçünün göstergesidir.
Hücre canlılığı ve popülasyon oranı Bu protokolde, hücre modellerinin biyo-baskısı için 15 milyon nöron/mL ve 5 milyon astrosit/mL'den oluşan 20 milyon hücre/mL konsantrasyon kullanılır. Kalsein-(canlı hücreler), etidyum homodimer-1 (ölü hücreler) ve bir nükleer boyama ile canlı hücre boyama kullanılarak, 7 günlük bir süre boyunca hayatta kalan hücre sayısı bölüm 4'e göre hesaplanabilir (Şekil 3A). Temsili kültürler için hücre canlılığı sonuçları, toplam hücrelerin r ± %1'inin (ortalama ± SEM) canlı olduğu ve Calcein-için boyanma gösterdiği, ) ± %2'sinin (ortalama ± SEM) toplam hücrelerin öldüğü ve etidyum homodimer-1 ile boyanma gösterdiği 4. gün için gösterilmiştir (Şekil 3B). Calcein-ve etidyum homodimer-1 ile hücre boyamanın temsili görüntüleri Ek Şekil 1'de görülebilir. Ölü hücreler hidrojelde tutulduğundan ve hücre besleme işlemleri sırasında uzaklaştırılmayacağından, 3D kültürler için hücre sağkalım değerlerinin doğrudan 2D kültürlerle karşılaştırılamayacağına dikkat edilmelidir.
Bölüm 5 ve Şekil 4'te açıklandığı gibi Β-III tübülin ve GFAP için immünofloresan boyama kullanılarak, nöronlar ve astrositler arasındaki hücre popülasyon oranlarını belirlemek için görüntü analizi yapılabilir (Şekil 3A). Temsili kültürlerde model başına toplam hücrelerin Β-III tübülin pozitif nöronları I ± %3'ünü (ortalama ± SEM) temsil ederken, GFAP pozitif astrositler 0 ± %4'ü (ortalama ± SEM) temsil eder. Bu, sırasıyla 1: 1.5, astrositlerin nöronlara oranını verir. Bu, model başına toplam !'lik bir hücre kalanı bırakır ve bu da her iki hücre işaretleyicisi için de lekelenmez. Hücre canlılığı analizi, hücrelerin ortalama )'unun 4. günde canlı olmadığını gösterdiğinden, bu hücrelerin hidrojel içinde ölü olması muhtemeldir.
Hücre işaretleyicilerinin ifadesi Biyobaskılı nöronların ve astrositlerin morfolojisi, nöronal hücre tipi belirteci (Β-III tubulin) ve astrositik belirteç (GFAP) için immün boyama yoluyla değerlendirildi. Gösterilen temsili kültürlerde, immün boyama, sağlıklı hücre morfolojisi gösteren, her iki hücre tipinin de hücresel çıkıntıların büyümesini sergilediği bireysel hücre tiplerine lokalizedir (Şekil 4A, B). Hidrojel ve hücre yapıları üç boyutlu olduğundan, her görüntü Şekil 4A,B'deki yapı boyunca yalnızca bir dilimi temsil eder. Şekil 4C, X, Y ve Z düzlemlerinde hücre lokalizasyonunun görünümlerini gösteren, hidrojel boyunca birleştirilmiş bir görüntü yığınını göstermektedir. Şekil 4D, sadece Β-III tübülin için immün boyamayı göstermektedir; hücre gövdesi kümelerinden daha ince nörit büyümelerini vurgulamak. Glutamaterjik nöronların fenotipini daha fazla incelemek için, glutamaterjik iyonik reseptör belirteci GluR2 için immün boyama gerçekleştirilebilir. Şekil 4E'de, nörit demetleri boyunca daha yüksek çözünürlüklü noktasal lekelenme göstermek için alan 4E.1 (iç) vurgulanmıştır. Bu nedenle, bu kokültürdeki nöronların glutamaterjik bir fenotipe sahip olduğunu doğrular. Tüm immün boyama görüntülerinde, hücre kümelerini ve nöritleri çevreleyen immünofloresan boyalı hücre dışı yapılar gözlemlenebilir. Bu yapıların, hidrojele bağlanan az miktarda spesifik olmayan antikor ile kombinasyon halinde hidrojel içinde tutulan kalıntıları temsil etmesi muhtemeldir. Bu, 3D iskele modellerinde olduğu gibi, hücre beslemesi sırasında ölü hücreler ve döküntüler uzaklaştırılmadığı için biyobaskılı kültürlerde beklenir. İkincil antikorların hidrojel spesifik olmayan bağlanmasının bir gösterimi için Ek Şekil 2'de temsili bir negatif kontrol immün boyama görüntüsü gösterilmektedir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig02.jpg"> Şekil 2: Glutamaterjik nöronlar ve astrositler, biyoyazıcı kullanılarak hidrojel matrisine biyo-basıldı ve her 12 saatte bir parlak alan mikroskobu kullanılarak görüntülendi . (A) Analiz sırasında hücre kültürlerinden alınan örnek bir parlak alan görüntüsü. Görüntü 156 saatlik zaman noktasını temsil eder ve ölçek çubuğu 400 μm'yi temsil eder. (B) ImageJ için NeuronJ paketi kullanılarak ölçülen kültürlerden nörit büyümelerinin ortalama uzunluğu (μm). Her veri noktası n = 3 nörittir ve veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig02large.jpg" target="_blank">rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig03v2.jpg"> Şekil 3: Hücre modellerinin biyo-baskısı için 20 milyon hücre/mL aktivatör çözeltisi konsantrasyonu kullanıldı . (A) Hücre canlılığı, canlı/ölü hücre boyaları (sırasıyla Calcein-ve etidyum homodimer-1) kullanılarak hesaplandı. Değerler, oyuk başına toplam hücrelerin r ± %1'inin (ortalama ± SEM, n = 3) canlı olduğunu ve hücrelerin )'unun ± %2'sinin (ortalama ± SEM, n = 3) 4. günde kuyucuk başına toplam hücre popülasyonunun öldüğünü göstermektedir. Gösterilen değerler ortalama ± SEM'i temsil eder. (B) Hücre popülasyonlarının oyuk başına nöron ve astrosit yüzdesi, Şekil 4'te gösterilen boyamanın görüntü analizi ile hesaplanmıştır. Nöronlar, 7. günde Β-III tübülin için pozitif boyanan hücrelerin yüzdesini temsil eder (I ± %3, ortalama ± SEM, n = 3), astrositler ise 7. günde GFAP için pozitif boyanan hücrelerin yüzdesini temsil eder (0 ± %4, ortalama ± SEM, n = 3). Gösterilen değerler ortalama ± SEM'i temsil eder. Şekil 3'te gösterilen hesaplamalar için tüm görüntülemeler konfokal görüntüleme sisteminde, tüm analizler görüntü analiz platformunda ve GraphPad Prizma'da yöntemlere göre gerçekleştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig04.jpg"> Şekil 4: 7. günde glutamaterjik nöronların ve astrositlerin 3D biyobaskılı kokültürlerinde nöral hücre tipi belirteçlerinin ekspresyonu . (A,B) Nöronal belirteç Β-III tübülin ve astrosit işaretleyici GFAP'nin immünofloresan boyama, 10x büyütmede ters mikroskop platformunda görüntülendi. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. (C) Nöronal belirteç β-III tübülin ve astrosit belirteci GFAP'nin Hoechst ile birlikte boyanmış immünofloresan boyaması, XYZ düzlem görünümünde gösterilen, 10x büyütmede bir konfokal görüntüleme sisteminde görüntülendi. Görüntü analiz platformunda oluşturuldu. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. (D) Hoechst ile birlikte boyanmış nöronal belirteç β-III tübülinin immünofloresan boyama, 20x büyütmede konfokal görüntüleme sisteminde görüntülendi. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. (E) Hoechst ile birlikte boyanmış glutamaterjik belirteç GluR2'nin immünofloresan boyama, 10x büyütmede ters mikroskop platformunda görüntülendi. Kutu 3E.1, GluR2 boyamanın vurgulanan alanlarını gösterir. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 1: Glutamaterjik nöronlar ve astrositler, biyoyazıcı kullanılarak hidrojel matrisine biyo-basıldı ve her 12 saatte bir parlak alan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Analiz sırasında hücre kültürlerinden alınan parlak alan görüntülerinin videosu, zaman noktaları sağ alt köşede gösterilir ve ölçek çubukları 400 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Video%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: 4. Günde biyo-baskılı nöronların ve astrositlerin canlı/ölü analizinin örnek görüntüleri. Calcein-boyası yeşil (488 nm) ve etidyum homodimer boyası kırmızı (647 nm) ile gösterilmiştir. Görüntü, görüntü analiz platformunda oluşturulan XYZ düzlem görünümünde gösterilir. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. (A) Görüntüleme, 4x büyütmede konfokal görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. (B) Görüntüleme, 10x büyütmede konfokal görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: İmmünofloresan boyama sonrası negatif kontrol görüntüsü örneği. Primer antikorlar ihmal edildi ve immün boyama protokollerine göre yeşil (488 nm) ve kırmızı (647 nm) sekonder antikorlar kullanıldı. Görüntü, görüntü analiz platformunda oluşturulan XYZ düzlem görünümünde gösterilir. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. Görüntüleme, 10x büyütmede konfokal görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, iPSC'den türetilen nöronların ve astrositlerin 3D biyobaskılı kokültürlerini üretmek için bir protokol sunuyoruz. 96 veya 384 oyuklu formatlarda bir hidrojel iskele içinde üretilen bu kokültür modeli, 7 gün içinde yüksek baskı sonrası canlılık ve nörit büyümesi gösterir ve her iki hücre tipi için olgunluk belirteçlerinin ekspresyonunu gösterir.

Tarama Uygulamaları için İnsan iPSC'den Elde Edilen Nöron-Astrosit Kokültürlerinin Üç Boyutlu Biyobaskısı

For a cell model to be viable for drug screening, the system must meet throughput and homogeneity requirements alongside having an efficient development ...

3D hücre modelleme, son on yılda katlanarak genişleyen yeni bir alandır. Bu modellerin hem nöronal büyümeyi kolaylaştırdığı hem de hastalık fenotiplerini daha doğru bir şekilde temsil ettiği gösterilmiştir. Ancak, bu modellerin daha yüksek verim elde etmesine yönelik bir kayma olduğuna ve geliştirme sürecinde otomasyonu benimseme gerekliliği olduğuna inanıyoruz.3D kültürleri geliştirmenin geleneksel yöntemlerinin kurulması zahmetli ve zaman alıcı olabilir, ancak 3D biyo-baskı, bu geliştirme süreçlerini büyütmek için uygulanabilecek bir teknolojidir. Bu teknoloji, yüzlerce özdeş modelin verimli ve insan hatası olmadan oluşturulmasına olanak tanır. Bu protokol karmaşık kültürler geliştirir çünkü nöral hücreler biyolojik olarak aktif hidrojel matrislerinde 3 boyutlu olarak büyütülür.Ancak kritik olarak, bu protokol, bu alanda eksik olabilecek ve endüstriye uygulanmasını engelleyebilecek model geliştirmede hız ve rahatlığa öncelik verir. Bu protokol, kullanıcılardan gelen sınırlı girdilerle birçok 3B kokültürü çok verimli bir şekilde oluşturmak için bir yöntem tanımlar. Bunun, yüksek verimli tahlillerde karmaşık hücre kültürü modellerinin kullanılmasının önündeki engelleri kaldıracağını ve 3D kültürün nöral hücre tipleri üzerindeki etkisinin daha fazla araştırılmasını kolaylaştıracağını umuyoruz.

three-dimensional-bioprinting-human-ipsc-derived-neuron-astrocyte

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, insan pluripotent kök hücrelerinden progenitörlerden astrosferler üretmenin bir yöntemini göstermektedir. Büyüme faktörleri ve kinaz inhibitörleri içeren besleyici ortamlarla kök hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını içerir. Bu hücreler daha sonra toplanır ve astrositlere farklılaşarak astrosferler oluşturur.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerini Kullanarak Astrosferlerin Üretilmesi ve Bakımı

Bu video, 3B küreler oluşturmak için astrositleri ve nöronları birlikte kültürlemek için bir prosedürü göstermektedir. Bu 3B küreler, sinaps oluşumunu ve sinir ağı entegrasyonunu incelemek için ayrı bir platform sağlar, böylece gelişimsel sinirbilim, nörodejeneratif hastalıklar ve nörofarmakolojik müdahalelerde araştırma için potansiyel bir model görevi görür.

Sinaps Oluşumunu İndüklemek için Astrositlerin ve Nöronların 3D Ko-Kültür Kürelerinin Oluşturulması

Video, bir biyomürekkep çözeltisinde süspanse edilmiş astrositleri kullanarak 3D biyo-baskılı bir yapı oluşturma sürecini göstermektedir. Biyobaskılı yapı, çapraz bağlandıktan sonra, astrosit yapışmasını ve yayılmasını kolaylaştırarak nöral benzeri doku oluşturur.

Murin Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskısı İçin Bir Yöntem

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Bu iletişim kuralı, ayrışmış birleştirerek insan pluripotent kök hücre elde edilen nöronlar için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamak için amacımız ve astrocytes 3D içine birlikte cocultures, bunlar yuvar ücretsiz kayan koşulları ve daha sonra korumak küre immunoanalysis ve multielectrode dizi kayıtları ile küre sinaptik devre etkinliğin ölçülmesi.

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Burada, merkezi sinir sistemindeki astrositlerin işlevselliğini ve nörolojik hastalık ve tedavilerde glial hücreleri içeren mekanizmaları incelemek için nöral benzeri dokuların biyofabrik olarak tanımlanması için 3D biyobaskı murine kortikal astrositlerin bir yöntemini rapor ediyoruz.

Mühendislik Nöral Benzeri Dokular için Murine Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskı

Bu makalede, bir tezgah üstü 3D süspansiyon biyoreaktöründe insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli nöronların üretimi için bir protokol açıklanmaktadır.

Üç Boyutlu Süspansiyon Biyoreaktöründe İnsan Nörojenin 2-İndüklenebilir Nöronların Üretimi

Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde...

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Bir yöntem özgürlük altı derece (6DF) hareket simülatörü kullanarak insanlarda üç boyutlu vestibulo göz refleksleri (3D VOR) ölçmek için açıklanmıştır. 3D açısal VOR kazanç ve kaymalar vestibüler fonksiyon kalitesinin doğrudan bir ölçüsü. Sağlıklı konularda Temsilcisi veri...

Özgürlük Hareket Platformu Six Degrees kullanarak Üç Boyutlu Vestibüler Oküler Refleks Testi

Keşfedin, iPSC kaynaklı nöron ve astrositlerin hidrojel içinde 3D biyobaskı ile yüksek verimli ko-kültür protokolü. Yedi günde yüksek canlılık ve nörit uzaması sağlayan bu yöntem, nörobilim araştırmalarında otomasyonu artırır.

Tarama Uygulamaları için İnsan iPSC'den Elde Edilen Nöron-Astrosit Kokültürlerinin Üç Boyutlu Biyobaskısı

Daha fazla video keşfet