İnsan Pluripotent Kök Hücrelerini Kullanarak Astrosferlerin Üretilmesi ve Bakımı

ECM kaplı bir plaka ve Rho-kinaz inhibitörleri içeren bir büyüme ortamında insan pluripotent kök hücrelerinin tohum kümeleri ile başlayın.

ECM hücre bağlanmasını artırırken, inhibitörler Rho-kinazları bloke ederek apoptotik hücre ölümünü önler ve hücre sağkalımını ve çoğalmasını destekler.

Nöral progenitör hücrelere kök hücre farklılaşmasını indüklemek için bir nöral farklılaşma ortamı tanıtın.

Bir ayırma çözeltisi ile muamele edin; bu çözeltideki enzimler ECM'yi ve hücre temasını bozarak hücreleri serbest bırakır.

Bunları Rho-kinaz inhibitörleri içeren kaplanmamış bir şişeye aktarın.

İnhibitörler, hücre sağkalımını ve üç boyutlu yapılara veya sferoidlere spontan agregasyonu kolaylaştırır.

Sferoidleri, büyüme faktörü açısından zengin bir nöral farklılaşma ortamı ile destekleyin, bu da nöral progenitör hücrelerin astrosit progenitörlerine farklılaşmasına ve astrosferler oluşturmasına izin verir.

Düzenli olarak, astrosferleri daha küçük kümelere ayırmak için bir ayırma çözümü ekleyin. Bu, besinlerin sferoidin iç hücrelerine ulaşmasını ve canlılıklarını korumasını sağlar.

Ataların astrositlere dönüşmesi için astrosferleri taze bir ortamda tutun.

Rho-kinaz inhibitörü Y-27632 içeren 2 mililitre hPSC ortamında, ECM kaplı altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna hPSC kümelerini tohumlayarak başlayın. Kök hücreleri yaklaşık% 50 birleşene kadar koruyun. Ardından, nöral indüksiyonu teşvik etmek için ortamı SP-431542 ve DMH1 içeren nöral ortam olarak değiştirin.

Hücreler yaklaşık% 95 birleştiğinde, her bir oyuğu 1'den 6'ya kadar yeni ECM kaplı oyuklara bölün. 14. günde, hücreleri ayırma çözeltisi ile ayırın ve agrega oluşumunu teşvik etmek için her bir oyuğun içeriğini, Y-27632 içeren ortam ile kaplanmamış bir T-25 şişesine aktarın.

Kendiliğinden oluşan 3D agregalarda astrosit progenitörleri ve astrositler oluşturmak için, EGF ve FGF2 içeren nöral ortama geçin ve astrosit kimliği dört ila altı ayda doğrulanana kadar her üç ila dört günde bir besleyin.

Varsayılan olarak, bu protokol dorsal kortikal astrositler üretir. Bununla birlikte, astrosit alt tipleri, istenirse desen morfojenlerinin eklenmesiyle bölgesel olarak belirlenebilir.

Haftada bir kez, karanlık merkezler ortaya çıktığında, küreleri santrifüjleme ile toplayın, ardından H-astro agregalarını ayırma çözeltisi ile nazikçe ayırın. CNS olmayan ve nöral olmayan hücrelerin geçmesini önlemek için sadece kendiliğinden bağlanmayan küreleri yeniden plakalayın.