Name: İnsan Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Keşfedin insan ADSC'lerinden ekstraselüler veziküllerin saflaştırılması ve karakterizasyonu için standart ultrasantrifüjasyon protokolleri. Bu yöntem gen aktarımı ve hücre iletişimi araştırmalarında terapötik uygulamalar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82202473) tarafından desteklenmiştir.

Protokol adımlarına genel bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Medya hazırlığı
<ol><li>450 mL bazal kültür ortamı, 50 mL eksozomsuz fetal sığır serumu ve 5 mL üçlü antibiyotik kullanarak eksozomsuz ADSC için bir kültür ortamı hazırlayın.</li>
</ol>2. ADSC'lerin canlandırılması ve kültürlenmesi
NOT: ADSC'leri yeniden canlandırın.
<ol><li>Ultra temiz masanın UV radyasyonunu önceden açın ve 30 dakika dezenfekte edin.</li>
	<li>Ortamı önceden 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın.</li>
	<li>Sıvı nitrojenden 2 tüp donmuş ADSC (P3) alın ve tamamen çözülene kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda sabit sıcaklıkta çalkalayın. NOT: Kontaminasyonu önlemek için dondurucu borusunun açıklığı su ile temas etmemelidir.</li>
	<li>Kriyoprezervasyon tüpünü %75 alkol kullanarak dezenfekte edin ve ardından ultra temiz masaya taşıyın. Hücre süspansiyonunu bir pipet kullanarak aspire edin ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Santrifüj tüpünü düşük hızlı bir santrifüj makinesine yerleştirin ve 250 x g'da 5 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Dört adet 10 cm'lik kültür kabı hazırlayın ve her tabağa 9 mL orta boy koyun. Adını, hücre tipini, üretimini ve deney tarihini işaretleyin ve ardından bunları 37 °C termostatik hücre inkübatörde önceden ısıtın.</li>
	<li>Santrifüj tüpünü dezenfekte edin ve ultra temiz masaya taşıyın. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>4 mL ortam ekleyin ve çözeltiyi (1 x 105 hücre / mL) eşit şekilde dağılana kadar hafifçe çalkalayın. NOT: Süpernatanı çıkarırken hücre peletini ortadan kaldırmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Her yemeğe 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Bulaşıkları çapraz yöntemle çalkalayın. NOT: Plakayı düz bir yüzeye yerleştirin ve 5-6 tekrar için çapraz bir düzende (yukarı, aşağı, sola ve sağa hareket ettirerek) çalkalayın. Merkezde hücre birikimine neden olabileceğinden dairesel hareketlerden kaçının.</li>
	<li>Optik mikroskopla hücreleri 40x büyütmede gözlemleyin ve ardından bulaşıkları inkübatöre yerleştirin. NOT: Hücreleri gözlemlemenin birincil amacı, eşit olmayan dağılım sonraki büyümeyi etkileyeceğinden, eşit dağılıp dağılmadıklarını belirlemektir.</li>
	<li>Hücreler için değişim ortamı hazırlayın.<ol><li>Ultra temiz masanın UV radyasyonunu önceden açın ve 30 dakika dezenfekte edin.</li>
		<li>Ortamı önceden 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın.</li>
		<li>Optik mikroskop altında 40x büyütmede hücre durumunu gözlemleyin. Birleşme seviyesi yaklaşık% 50'dir. NOT: Birleşme seviyesi, hücreler duvara yapıştıktan ve tamamen gerildikten sonra hücrelerin kapladığı alanın petri kabının yüzey alanına oranı olarak hesaplanır.</li>
		<li>Dezenfeksiyondan sonra kültür kabını ultra temiz masaya (Biyogüvenlik seviyesi 2) aktarın ve ortamı çıkarın.</li>
		<li>Her kültür kabını 2 mL PBS çözeltisi ile iki kez nazikçe durulayın.</li>
		<li>Her yemeğe 10 mL orta boy ekleyin. Bulaşıkları kuluçka makinesine aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Süpernatan ADSC'lerin toplanması ve EV'lerin çıkarılması
<ol><li>Ultra temiz masanın UV radyasyonunu önceden açın ve 30 dakika dezenfekte edin.</li>
	<li>Hücre durumunu mikroskop altında gözlemleyin. Birleşme seviyesi yaklaşık% 80'dir.</li>
	<li>Dezenfeksiyondan sonra çanağı ultra temiz masaya aktarın. Süpernatanı bir pipetle dikkatlice toplayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. NOT: Hücreler dondurulabilir veya atılabilir. Sterilite gerekli değilse, ameliyat masasında aşağıdaki adımlar gerçekleştirilebilir. Bu noktada, deneme duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir. Deney durdurulursa, süpernatanı bir haftadan fazla olmamak üzere 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. EV'lerin aktivitesini etkileyebileceğinden uzun süreli depolama önerilmez. En uygun yaklaşım, EV'leri hemen çıkarmaktır.</li>
	<li>Asılı hücreleri çıkarmak için santrifüjleyin (300 x g, 10 dakika, oda sıcaklığında). Süpernatanı bir pipetle toplayın. NOT: Dökmeyin. Peletin emilmesini önlemek için biraz süpernatan bırakın.</li>
	<li>Hücresel kalıntıları (2000 x g, 10 dk, 4 °C) çıkarmak için santrifüjleyin, ardından süpernatanı bir pipetle toplamaya devam edin. NOT: Önemli noktalar adım 3.4'teki ile aynıdır.</li>
	<li>Büyük parçacıkları ve hücre kalıntılarını gidermek için süpernatanı 0.22 um membranla filtreleyin. NOT: Filtrasyondan önce filtre membranını nemlendirmek için süpernatanı 2 mL steril PBS ile filtreleyin.</li>
	<li>Ultrasantrifüj makinesinde santrifüjleyin (10.000 x g, 30 dk, 4 °C).</li>
	<li>Daha sonra, peleti çıkarmak ve süpernatanı toplamak için 1,00,000 ° C'de 70 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. NOT: Elde edilen EV'ler, saflıklarını artırmak için birçok kez santrifüjleme ile saflaştırıldı. Pelet çıplak gözle görülemeyebilir. Bu nedenle, pelet toplanmasını önlemek için pipeti nazikçe çalıştırmak ve altta biraz süpernatan bırakmak çok önemlidir.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle çıkarın. Peleti PBS ve santrifüj (1,00,000 x g, 70 dk, 4 °C) ile yeniden süspanse edin. NOT: Pelet çıplak gözle görülemeyebilir. Bu nedenle, süpernatanı bir pipetle aspire ederken, EV'lerin saflığını en üst düzeye çıkarmak için süpernatanı nazikçe ve iyice çıkarmak çok önemlidir.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve EV peletini elde edin. 1 mL PBS ile tekrar süspanse edin, 1 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve sonraki algılama için 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. NOT: Pelet çıplak gözle görülemeyebilir. Sonuç olarak, süpernatanı bir pipetle aspire ederken, EV'nin saflığını en üst düzeye çıkarmak için süpernatanı nazikçe ve iyice çıkarmak çok önemlidir. Numunelere uzun süre ihtiyaç duyulmayacaksa, -80 °C'lik bir buzdolabında saklayın.</li>
</ol>

İnsan ADSC'lerinden Hücre Dışı Veziküllerin Ultrasantrifüj Tabanlı İzolasyonu

<ol><li>Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+Looking+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).</li>
<li>Xin, H., Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2FmiRNAs+as+mediating+cell-based+therapy+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke.</a> Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tissue+origin+effect+of+extracellular+vesicles+on+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration.</a> Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).</li>
<li>Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+adipose+tissue-a+potential+role+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+biological+effects+of+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+were+markedly+increased+by+low-intensity+ultrasound+stimulation+for+promoting+diabetic+wound+healing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing).</a> Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).</li>
<li>Mou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+human+adipose-derived+stem+cells+for+the+improvement+of+angiogenesis+and+fat-grafting+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application.</a> Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+bone+immobilized+with+human+adipose+stem+cells-derived+exosomes+promotes+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).</li>
<li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+inhibit+the+fibrosis+of+fibrotic+buccal+mucosal+fibroblasts+via+the+microRNA-375%2Ffoxf1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis.</a> Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).</li>
<li>Brezgin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+aspects+of+manufacturing+and+analytical+control+of+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles.</a> Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Character+comparison+of+abdomen-derived+and+eyelid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells.</a> Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).</li>
<li>Gan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+improve+liver+fibrosis+by+regulating+the+miR-20a-5p%2FTGFBR2+axis+to+affect+the+p38+MAPK%2FNF-%CE%BAB+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway.</a> Cytokine. 172, 156386(2023).</li>
<li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+and+imaging+of+exosomes+by+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (131), e56482(2018).</li>
<li>Han, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+exosomes+derived+from+hypoxia-preconditioned+adipose+mesenchymal+stem+cells+promotes+neovascularization+and+graft+survival+in+fat+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).</li>
<li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+from+blood+plasma%3A+Qualitative+and+quantitative+comparison+of+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+extracellular+vesicles+by+three-dimensional+dynamic+culture+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).</li>
<li>Eguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+with+cancer+stem+cell-like+properties+secrete+exosomes+and+HSP90+in+a+3D+nanoenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment.</a> PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir mali çıkarı yoktur.

Resmi deney süreci sırasında, en iyi deneysel sonuçları elde etmek için birkaç nokta çok önemlidir. Önceki deneyimlerimize dayanarak, mümkün olan en iyi hücre durumunu sağladıkları için geçiş 3-6 ADSC'lerin tercih edilmesi önerilir. P3'ten önce, kırmızı kan hücreleri, endotel hücreleri ve diğer çeşitli hücreler taranmamış olabilir. P6'dan sonra, hücreler yavaş yavaş yaşlanabilir ve bu da salgılanan EV'lerin durumunu etkileyebilir. İkinci olarak, mümkün olduğu kadar çok EV'nin yeterli salgılanmasını sağlamak için hücre birleşme derecesi %80 ile %90 arasında olduğunda süpernatant toplanmalıdır. EV'lerin maksimum saflığını korumak için, araştırmacılar ilk üç santrifüjleme sırasında dikkatli olmalı ve safsızlıkların ve peletlerin aspirasyonunu önlemek için sıvı kalıntısı kalmadığından emin olmalıdır. Son iki santrifüj sırasında, peleti korurken süpernatantın tamamen çıkarıldığından emin olun.
Ultrasantrifüj uygun maliyetlidir ve daha fazla tedavi gerektirmez. Bu teknik, EV çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ve karakterizasyon deneyleri ile onaylandığı gibi, EV'lerin elde edilmesinde tatmin edici bir verimlilik göstermiştir. Bununla birlikte, bazı kaçınılmaz dezavantajlar vardır. İlk olarak, EV'lerin geri kazanım oranı düşüktür. İkincisi, EV'ler bazen toplanma eğilimindedir. Ek olarak, hücresel olmayan bileşenler izole edilebilir ve bazı EV'ler işlem sırasında yırtılarak döküntü birikimine yol açabilir 14,15,16. Bu kusurları gidermek için çoğu araştırma EV'leri saflaştırmaya odaklanmaktadır 12,13. Bununla birlikte, bu protokol hücre kültüründen eksozom saflaştırmasına kadar tüm süreci kapsar, çünkü tüm sürecin nihai ekstrakte edilen EV'lerin durumunu ve saflığını etkilediğine inanıyoruz. Çalışma sırasında yukarıda belirtilen yönergelere uymak çok önemlidir. Ek olarak, çok sayıda çalışma, 3D kültürün 2D kültüre kıyasla EV'lerin salgılanmasını uyarmada daha etkili olduğunu gösterdiğinden, daha fazla süpernatant toplamak ve 3D hücre kültürü uygulamak faydalı olabilir17,18.
Bu protokol, ultrasantrifüjleme kullanarak EV'leri ADSC'lerden çıkarma sürecini ana hatlarıyla belirtir. Pratik rehberlik sağlar ve deneycilerin işlem sırasında mümkün olduğunca ayrıntılardan kaçınmasını sağlar. Özetle, protokol deneycilere numunelerin kalitesini iyileştirmede yardımcı olur ve sadece her adımın ayrıntılarına odaklanmamamız gerektiğini, aynı zamanda deneyi bir bütün olarak düşünmemiz gerektiğini hatırlatır.

Çoğu ADSC yağ dokusundan türetilir ve miyokard, kemik ve deri1 dahil olmak üzere çeşitli doku ve organların rejenerasyonunu ve yeniden inşasını teşvik ettiği gösterilmiştir. Son araştırmalar, ADSC'lerin rejeneratif fonksiyonunun hücreler arası temasa ve hücrelerin parakrin etkilerine bağlı olabileceğini düşündürmektedir2. Parakrin etkisi, hücrelerin kısa mesafelerde etkileşime girmesi ve bilgi aktarması için önemli bir araçtır ve bu işlev, hücre dışı veziküller (EV'ler) aracılığıyla sağlanır.
EV'ler, hücreler tarafından üretilen, çapı 40 nm ila 160 nm arasında değişen (ortalama yaklaşık 100 nm ile) çift katmanlı zar yapılarıdır. Sitokin üretimi, hücre proliferasyonu, apoptoz ve metabolizma gibi farklı hücresel fonksiyonları etkilerler 3,4. Kemik rejenerasyonunun teşvik edilmesi, oral mukozal doku rejenerasyonu, doku nakli sonrası yağ dokusu sağkalımı ve cilt yara onarımı dahil olmak üzere ADSC EV'lerin işlevleri üzerine çok sayıda çalışma yapılmıştır 5,6,7,8. ADSC EV'lerin rejeneratif tıptaki muazzam potansiyeli açıktır. EV'leri süpernatanttan çıkarmak ve ayırmak için santrifüjleme, çökeltme, moleküler büyüklük, afinite ve mikroakışkanlara dayalı teknikler gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Ultrasantrifüjleme yöntemi, EV'leri izole etmek için yaygın olarak altın standart olarak kabul edilir9. EV ayırma için ultrasantrifüjlemenin temel prensibi, numunedeki partiküllerin değişen sedimantasyon katsayılarına sahip olması ve bunun sonucunda bunların farklı ayırma katmanlarında sedimantasyon ve agregasyon ile sonuçlanması gerçeğine dayanmaktadır. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme sırasında önlemleri vurgulayan ayrıntılı bir protokol henüz oluşturulmamıştır.
Bu nedenle, bu çalışma, ADSC kültürünü, süpernatant koleksiyonunu ve EV'lerin ultrasantrifüj prosedürlerini ve kilit noktalarını mantıklı bir bilgi akışı ve açık, resmi bir dille objektif bir şekilde özetlemektedir. Bu, gelecekteki deneyler için değerli bir referans sağlar.

<table><tbody><tr>Supor Membran <td>Acros Organics</td><td>4652</td> 0.22 & <td>mu'nun Akrodisk İğneli Filtresi</td><td>; </td></tr><tr><td>Hücre Kültürü için m Bazal Ortam</td><td>OriCell</td><td>BHDM-03011</td><td></td></tr><tr><td>EXO + Kültür Takviyesi Olmadan Fetal Sığır Serumu (İnsan Yağ Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler için)</td><td>OriCell</td><td>HUXMD-05002</td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>Lx70-S8F2</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Hızlı Santrifüj</td><td>Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.</td><td>SC-3612</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP Masaüstü Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin-Gentamisin Çözeltisi (100x)</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden hücre dışı veziküllerin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

İnsan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücreler (ADSC'ler), çeşitli doku ve organların yenilenmesini ve yeniden yapılandırılmasını teşvik edebilir. Son araştırmalar, rejeneratif işlevlerinin hücre-hücre temasına ve hücre parakrin etkilerine atfedilebileceğini düşündürmektedir. Parakrin etkisi, hücrelerin, hücre dışı veziküllerin (EV'ler) taşıyıcı olarak işlevsel bir rol oynadığı kısa mesafelerde etkileşime girmesi ve bilgi aktarması için önemli bir yoldur. Rejeneratif tıpta ADSC EV'ler için önemli bir potansiyel vardır. Bu yöntemlerin etkinliği hakkında çok sayıda çalışma bildirilmiştir. EV'lerin çıkarılması ve izole edilmesi için çeşitli yöntemler şu anda santrifüjleme, çökeltme, moleküler boyut, afinite ve mikroakışkanlar gibi ilkelere dayalı olarak tanımlanmaktadır. Ultrasantrifüjleme, EV'leri izole etmek için altın standart olarak kabul edilir. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme sırasında alınacak önlemleri vurgulamak için titiz bir protokol hala mevcut değildir. Bu çalışma, ADSC kültürü, süpernatan toplama ve EV ultrasantrifüjlemesinde yer alan metodolojiyi ve önemli adımları sunmaktadır. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme uygun maliyetli olmasına ve daha fazla tedavi gerektirmemesine rağmen, düşük geri kazanım oranı ve EV agregasyonu gibi bazı kaçınılmaz dezavantajlar vardır.

İlk olarak, ADSC'ler, morfolojileri10 ve yüzey antikorları dahil olmak üzere karakterize edildi ve tanımlandı. Şekil 2A'ya dayanarak, ADSC'lerin bir iğ şeklinde düzenlendiği ve yoğun büyümeden sonra bir girdap oluşturduğu açıktır. Kültürlenen hücreler adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hücrelere ayrıldı ve Yağ Kırmızısı O, Alizarin Kırmızısı ve Alcian Mavisi11 ile boyandı. İndüklenmiş farklılaşma deneyi ve akış sitometrisi, bunların gerçekten çok yönlü farklılaşma potansiyeline sahip ADSC'ler olduğunu doğruladı. Bununla birlikte, sonuçlarda hücrelerin "'si CD45 pozitiftir, bu da yeterli pozitif ve negatif antikorlar onu desteklediği için sonucu etkilemeyecektir (Şekil 2A,B).
Daha sonra, çıkarılan EV'lerin tanımlanması esastır. Esas olarak üç yönü içerir: morfoloji, parçacık boyutu ve işaretleyici proteinler. TEM sonuçları, çift katmanlı bir membran12 ile fincan şeklindeki EV yapısını açıkça ortaya koymaktadır (Şekil 3A). NTA, EV'lerin yaklaşık 1,6 x 1010 parçacık/mL'lik bir konsantrasyonla yaklaşık 50-150 nm'lik bir parçacık boyutu dağılımına sahip olduğunu gösterir (Şekil 3B). Western Blot analizi ayrıca CD9, CD63 ve TSG10113 dahil olmak üzere EV'lerin belirteç proteinlerinin düzgün bir şekilde ifade edildiğini göstermektedir (Şekil 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig01v2.jpg"> Şekil 1: Protokol adımlarına genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig02.jpg"> Şekil 2: ADSC'lerin karakterizasyonu. (A) ADSC'lerin morfolojisi fusiformdur. ADSC'ler sırasıyla adipojenik, osteojenik ve kondrojenik farklılaşma için besiyerinde kültürlendi. Adipojenik farklılaşma, Yağ Kırmızısı O boyama ile tespit edildi. Osteojenik ve kondrojenik farklılaşma sırasıyla Alizarin Kırmızısı ve Alcian Mavisi boyaması ile doğrulandı. Ölçek çubuğu: 100 μm. (B) MSC yüzey belirteçleri (CD90, CD105, CD29 ve CD73) ve hematopoietik hücreye özgü belirteçler (CD31, CD34, CD45 ve HLA-DR) için ADSC'lerin akış sitometrisi analizi. Geçit stratejisi: önce boş grubu daire içine alın. Buna dayanarak, CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 ve HLA-DR'yi her grubun etiketli antikorlarına göre art arda daire içine alın. Bu şekil Han, Y. D. ve ark.13'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig03.jpg"> Şekil 3: EV'lerin karakterizasyonu. (A) TEM sonuçları, iki katmanlı zarın fincan şeklindeki EV yapısını açıkça ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu: 200 nm. (B) NTA, EV'lerin yaklaşık 50-150 nm'lik bir partikül boyutu dağılımına sahip olduğunu ve yaklaşık 1.6 x 1010 partikül / mL'lik bir konsantrasyona sahip olduğunu gösterir. (C) Eksozomlarda TSG101, CD9 ve CD63 ekspresyonlarının Western blot ile tespiti. Bu şekil Han, Y. D. ve ark.13'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, insan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (ADSC'ler) kültürlenmesinden ve süpernatantın toplanmasından ultrasantrifüjleme kullanılarak hücre dışı veziküllerin (EV'ler) çıkarılmasına kadar tüm prosedürleri açıklar.

İnsan Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...

Araştırmamız, insan adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden hücre dışı veziküllerin hazırlanması ve saflaştırılmasına odaklanmaktadır. Çözmek istediğimiz sorun, bu sürecin nasıl standartlaştırılacağı ve arıtma verimliliğinin nasıl artırılacağıdır. Şu anda, ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, hacim dışlama kromatografisi, polimer çökeltme, immünoaffinite yakalama, mikroakışkan teknolojisi vb. gibi hücre dışı vezikülleri çıkarmak için kullanılan birçok teknoloji vardır.Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme, kuşkusuz altın bir standart olarak kabul edilmektedir. Gelecekte, MRNA, plazmitler ve diğer küçük moleküllerin taşınması ve hücrelere transfekte edilmesi de dahil olmak üzere hücre dışı veziküllerin vektörler olarak uygulanmasına odaklanacağız.

purification-characterization-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu protokol, ekstrektif bir yöntem kullanılarak abdominoplasti ve lipoaspirate örneklerinden mezenkimal kök hücrelerin izole imal etmek için enzimsiz bir yöntem sağlar. Sert enzimlerin veya santrifüj adımlarının olmaması, in vitro çalışmalarda kullanılabilecek veya kliniğe geri transfer edilebilen klinik olarak ilgili kök hücreleri sağlar.

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV'ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.

Küçük Hücre Dışı Vezikülleri İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden İzole Etmek için Basit Bir Tezgah Üstü Filtrasyon Yöntemi

Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Bu protokol, mezenkimal stromal hücreler tarafından salınan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) sıralanmasının ayrıntılı bir tanımını sağlar. Özellikle, cihaz ayarına ve sıralama koşullarının optimizasyonuna odaklanır. Amaç, özelliklerini koruyarak hücre dışı vezikülleri sıralamaktır.

Hücre dışı vezikül izolasyonu için başarılı bir sıralama ayarlama

Protokol, adiposit kaynaklı ekstraselüler veziküllerin (EV) salgılanmasını görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek ve bunların adil hücreler tarafından alınmasını göstermek için adipositlere özgü CD63-GFP raporlayıcı fare hattı kullanır; böylece yağ dokusu içinde parakrin bir yol ortaya çıkarır.

CD63-GFP Raporlayıcı Fare Modeli Kullanılarak Adipositten Türetilen Ekstraselüler Vezikül Salgısının Karakterizasyonu In Vivo ve In Vitro

Burada, &gt;90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.

Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Bu protokol izolasyonu açıklar adipoz-türetilmiş lipoaspirate ve iskelet rejenerasyon değerlendirmek için 4 mm kritik ölçüdeki kalvaryal defekt oluşturmadan stromal hücreler.

Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu...

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Keşfedin insan ADSC'lerinden ekstraselüler veziküllerin saflaştırılması ve karakterizasyonu için standart ultrasantrifüjasyon protokolleri. Bu yöntem gen aktarımı ve hücre iletişimi araştırmalarında terapötik uygulamalar sağlar.

İnsan Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet