İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Bu prosedürün genel amacı, iki yöntem kullanarak insan gentil nabız kök hücrelerini kalıcı dişlerden izole etmek, karakterize etmek ve ayırt etmektir. Bu, sağlıklı gömülü yirmi yaş dişlerinin toplanması ve başlangıçta mine kavşağına kadar siman etrafında kesilmesi ile gerçekleştirilir. Dental poli kök hücreler D PSC'ler iki farklı yöntemle izole edilir.

Birinci yöntemde polip dokuları kollajenaz tip one plus disk boşluğu solüsyonunda inkübe edilerek enzimatik olarak sindirilir. Burada onlara ed diyoruz. İkinci yöntemde izolasyon yöntemine bakıldığında avuç içi dokular herhangi bir sindirim yapılmadan sadece matara içerisine yerleştirilir.

Bu şekilde dpss dokudan şişeye göç etmeye başlar. OG adı verilen bu hücreler dış büyüme izolasyon yöntemini ifade eder. İşlemin ikinci adımı, düşme sitometrisi kullanılarak kök hücrelerin tanımlanmasıdır.

İşlemin üçüncü adımı, odontoblast farklılaşmasının indüksiyonudur ve işlemin son adımı, iki grup arasındaki odontoblast farklılaşmasının kırmızı boyama ve QBCR ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesidir. Rian Enstitüsü Kök Hücreler ve Gelişim Biyolojisi Bölümü'nden RA Kde'yim. Bugün size insan mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonunu, karakterizasyonunu ve karşılaştırmalı farklılaşmasını iki yöntem kullanarak göstereceğim.

Merhaba, ben Rio Enstitüsü'nden Dr.Rezaian. İnsan diş pulpası kök hücreleri ile ilgili bir proje üzerinde çalışıyoruz. Bu hücreler en az ağrı ve morbidite ile elde edilmesi kolay olan bir nevi mechy kök hücrelerdir.

Mekanik kök hücreler plastik aranma yeteneği, koloni oluşturma ve çoklu farklılaşma kapasitesi ile kendini gösterir. Merhaba, ben Kök Hücre Anabilim Dalı'ndan Dr.Ami. Enstitümüzde, araştırma çalışmaları ve gelecekteki uygulamalar amacıyla kök hücreleri izole etmek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz.

Rejeneratif tıpta, gelecekteki kök hücre bazlı tedavi için bu kök hücre kaynağını kullanmanın ilk adımı, kök hücreleri insan parça dokusundan izole etmek için en iyi protokolü seçmektir. Bu amaca ulaşmak için, farklı kök hücre izolasyon koşulları altında hücresel davranışın belirli yönlerini araştırmak çok önemlidir. İlk olarak, insan diş pulpası kök hücrelerini, pulpanın enzimatik ayrışmasını veya kök hücrelerin doku implantlarından çıkmasını kullanarak izole edeceğim.

Daha sonra bunları ojen patlamasına karakterize edin ve farklılaştırın. Öyleyse başlayalım. İlk yol, boşluk ve kollajenaz Tip bir, her ikisini de PBS'de çözer.

Daha sonra 0.2 mikron şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Her ikisini de konik boruya çekin. Daha sonra nihai konsantrasyonu elde etmek için kalem ve PBS ekleyin.

Sağlıklı yirmilik dişleri çelik koşulu altında soğuk bazik ortamda laboratuvara aktarın. Çalışmadan önce dişin yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin. Diş yüzeyindeki esintiyi temizlediğinizden emin olun.

Pulpa odasını ortaya çıkarmak için sterilize edilmiş diş diski kullanarak çimento emaye bağlantısının etrafındaki dişi kesin. Diş dokusunun aşırı ısınmasını azaltmak için kesme işleminin yavaş yapılması gerektiği göz önünde bulundurulmalıdır. Daha sonra pulpa dokusunu Scarpa bıçağı ile hamur dokusunu taç anlamına gelen hamurdan nazikçe bir ila iki milimetrelik parçalara ayırın.

Pulpa dokularının parçalanmasına yardımcı olmak için küçük hamur dokuları parçalarını her 30 dakikada bir 37 santigrat derece girdapta bir saat boyunca bir mililitre enzim çözeltisine aktarın. Daha sonra büyük agregaları 70 mikronluk bir hücre suşundan geçirerek çıkarın. Daha sonra beş dakika boyunca 1.200 RPM'de PENER santrifüjleri içeren PBS'yi ekleyin.

Supernat'ı dikkatlice çıkarın. Daha sonra plakayı proliferasyon ortamında askıya alıyoruz, pm kültür şişesine aktarıyoruz ve besiyeri ekliyoruz. Sonra kuluçkaya yatırın.

Outwork yöntemi için hücre birleşmesi elde edilene kadar ortamı her üç günde bir değiştirin. Kesme işlemini tekrarlayın. Dişi kestikten sonra dokuları bir ila iki milimetrelik parçaya patlatmak anlamına gelir.

Sonra onları kültürün içine yerleştirin. Proliferasyon ile flaş, orta ve inkübe edilmiş. Proliferasyon ortamının toplam hacminin, daha fazla hücre büyümesi için tüm parçaların bağlanmasını desteklemesi gerektiği düşünülmelidir.

Büyümeyi gözlemledikten sonra ve daha sonra hücre birleşmesi sağlanana kadar her üç günde bir ortamı değiştirin. İmmünofenotipleme için, her iki tip D PSC'yi de karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika boyunca PE veya FITC konjuge antikorlarla inkübe edin. Ardından, beş dakika boyunca 1.200 RPM'de PBS ve santigrat görünümleri ekleyin.

Süpernatanı ve resüsanı çıkarın, plakayı PBS'de askıya alın ve son olarak akış sitometresi alt kültürünü, her iki DPC tipini üç geçiş için kullanarak yüzey belirteçlerini değerlendirin. Daha sonra buza tripler ve bunları %60 Co akıcılığında altı kırmızı kültür kabına aktarın, PM'yi odontojenik besiyeri ile değiştirin. Üç kuyu pm eklenerek negatif kontrol olarak kalır.

Ortamı her üç günde bir, 21. günde bir değiştirin. PBS ile hücreleri yıkayın. Sonra bunları kuyu başına bir mililitre sabitleyin. Ev sıcaklığında 15 dakika boyunca% 10 resmi jel yüksekliği.

15 dakika sonra, sabitleyiciyi dikkatlice çıkarın ve hücreleri damıtılmış suyla üç kez sarın. Daha sonra suyu kırmızı leke çözeltisinde kırmızı alza başına bir mililitre ile değiştirin. 20 dakika sonra fazla boyayı çıkarır ve hücreleri dört kez deiyonize su ile yıkarız.

Daha sonra hücrelerin kurumasını önlemek için kuyu suyu başına bir milimetre ekleyin. Boyamadan sonra, mikroskop altındaki kontrollere kıyasla üç yukarı rayın kırmızıya dönüştüğünü görebilirsiniz, kırmızı lekelenmenin nicelleştirilmesi için büyük büyütme ile hücre çevresinde leke rengi emilimini görebilirsiniz. Suyu çıkardıktan sonra, oyuk başına bir mililitre,% 10 asidik asit ekleyin, ardından çalkalayarak 30 dakika inkübe edin.

Ardından, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri plakadan nazikçe kazıyın. Sonra bunları ayrı tüplere aktarın. VOR 30 saniye boyunca kuvvetlice alır.

Sonra 10 dakika boyunca 85 santigrat dereceye ısıtın. Buharlaşmayı önlemek için, ParaView transfer tüpü ile tüpleri beş dakika boyunca buza kapatmak için, bunları 15 dakika boyunca 20.000 G'de kullandılar. Bu arada, bölge protokolüne göre Alzheimer kırmızı standart seri seyreltme yapın.

Santrifüjlemeden sonra snat'ı çıkarın ve yeni tüplere aktarın. PH'ı %10 amonyum hidrosit ile nötralize edin. Ardından standartları ve ayrıca örnekleri 96'ya ekleyin.

Kuyu plakası daha sonra absorbansı 405 nanometrede ölçün ve verileri standart seri seyreltmeye göre analiz edin. Burada 10., 15. ve 18. günlerde enzimatik ayrışma ile izole edilen DPC'leri ve ayrıca beşinci, 10., 13. ve 18. günlerde büyümüş DPC'leri görebilirsiniz. SASE üçteki her iki dpss tipi de hemen hemen aynı boyutta ve morfolojidedir İmmünofenotipleme sonuçları, CD 44, CD 73 ve CD 19 gibi mezenkimal kök hücre belirteçlerinin varlığını ve CD 34, CD 45 ve CD 11 gibi hematopoietik ve endotelyal belirteçlerin yokluğunu göstermektedir B.İlginç bir şekilde, CD 1 0 5 ve CD 146'nın ifadeleri, D-P-S-C-E-D ile karşılaştırıldığında, eski d PSC'lerde daha fazladır, odontoblast farklılaşmasının 21. gününde enzim kırmızı boyanmasının miktar tayini, kök hücrelerin konddental üst kısmı olmayanlara kıyasla D-P-S-C-E-D'de daha fazla kalsiyum birikimi olduğunu göstermektedir.

QPCR sonuçları ayrıca, kök hücrelerin giden dişlerine kıyasla D-P-S-C-D'deki mineralizasyon belirteçleri olarak MEP ve A LP'nin önemli ölçüde daha yüksek ekspresyonlarını göstermektedir. Bu arada, her iki gen de farklılaşma sırasında düzenlenir ve ayrıca farklılaşma sırasında odontojenik belirteç olarak DSPP'nin ekspresyonu artmıştır. Bununla birlikte, ED ve OG grupları arasında farklılaşmış hücrelerde DSVP ekspresyonunda önemli bir değişiklik yoktur.

Az önce size, pulpanın enzimatik ayrışmasını veya kök hücrelerin doku ekstansından çıkmasını kullanarak insan diş parçaları kök hücrelerini nasıl izole edeceğinizi gösterdik. İşte bu kadar. Deneyinizde bu prosedürü kullanmayı denemeniz için size iyi şanslar dilerim.

Teşekkür ederim.