Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi Kullanılarak Permetillenmiş Müsin O-glikanlarının Profillenmesi

Gastrointestinal sistemdeki konak mikrop etkileşimlerinin glikobiyolojisini, özellikle de sağlık ve hastalıkta müsinler ve glikanlarının rolüne odaklanarak giye-bağırsak sistemindeki konak mikrop etkileşimlerinin glikobiyolojisini inceliyoruz. Müsin glikanları, bakteriler için besin ve bağlanma noktaları sağladıkları için konak-mikrop etkileşimlerinde giderek önemli faktörler olarak kabul edilmektedir. Glikozilasyon profilindeki bir değişiklik, mikrobiyotik bileşimde bozulmaya yol açabilir ve hastalık durumlarında yaygın olarak gözlemlenen fenotipler de buna yol açabilir.

Ancak, müsinler yoğun şekilde glikozillenmiş oldukları için çalışması zor olduğu için ünlü bir şekilde zordur. Örnekleme tekniklerindeki yenilikler ve takip biyoinformatik analizler, alanı ileriye taşıyabilir; ayrıca yeni örnek işleme yaklaşımları da veri verimini artırabilir ve örnek toplamadan sonuçlara kadar süreyi kısaltabilir. Diğer analitik teknikler glikanların daha ayrıntılı yapısal karakterizasyonuna olanak tanır, ancak uzun çalışma ve analiz süresi gerektirir.

Burada MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak tanımlanan teknik, hız avantajına sahiptir; bu da onu yüksek verimliliğe sahip ve tarama ile profilleme için uygun kılar. Başlamak için, saflaştırılmış müsinleri 250 mikrolitre beta-eliminasyon tamponu ile dört mililitrelik cam şişede karıştırın. Şişeyi politetrafloroetilen kaplı kapağa sıkıca kapatın ve reaksiyonu 45 derece Celsius'ta 16 saat boyunca inkübe edin.

Buz üzerinde, reaksiyon karışımına damla-damla bir mililitre %5 asetik asit çözeltisi ekleyin. Numuneyi tuzdan arındırmak için, cam pipette az miktarda cam yünü ekleyin. Cam pipetin üstüne 1,5 mililitre reçine süspansiyon ekleyin, sonra çökmesini ve süzmesini bırakın.

Şimdi, reçineyi iki mililitre %5 asetik asitle yıkayın ve akış akışını atın. Sonra, müsin örneğini tuz giderme kolonuna ekleyin ve akışı beş mililitrelik bir tüpte toplayın. Akıntıyı toplamak için kolonu bir mililitre %5 asetik asit ile iki kez yıkayın.

Sonra santrifüj evaporatörü kullanarak asetik asidi çıkarır ve örneği beş milibar ve 30 derece Celsius sıcaklığında iki saat boyunca konsantre eder. Örneği 0,5 mililitre metanol asetik asitte çözüp azot akışı altında kurutun. Cam bir şırınga kullanarak, sodyum hidroksit ve metanol karışımı içeren şişeye dört mililitre DMSO ekleyin.

Vortekslemeden sonra, çözeltiyi 2.000 G ile iki dakika boyunca santrifüjlendirin. Süpernatantı dikkatlice boşaltın ve jeli rahatsız etmeden tuzları çıkarın. Daha fazla tuz oluşmadığından emin olunduktan sonra, jeli dört mililitre susuz DMSO'ya tekrar süspansiyona bırakarak permetilasyon baz süspansiyonu hazırlanır.

Sonra, kurutulmuş müsin örneğine susuz DMSO ve permetil bazı, hemen ardından iyodometan ekleyin. Permetilasyon reaksiyonunu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yoğun bir şekilde sallayarak inkübe edin. Sonra, reaksiyonu sonlandırmak için 0,5 mililitre su ekleyin.

Numune bulanıklaştıktan sonra, azotla durulayın ve berrak hale gelsin. Örneği hidrofilik lipofilik denge 96 kuyuyla ekstraksiyon plakasına yükleyin. Örnekleri katı faza yaklaşık dakikada bir mililitre akış hızıyla itmek için pozitif basınç uygulayın.

Akış atıktan sonra, kuyuları bir mililitre suyla iki kez yıkayın. Glikanları plakadan iki kez bir mililitre metanol ile elüasyon yapın. Sadece metanol plakadan çıkmaya başlayana kadar basınç uygulayın, ardından yerçekimi akışının gerekli hızı korumasına izin verin.

Numuneyi santrifüj evaporatörü ile kurutup 10 mikrolitre TA50 içinde çözürün. Bir mikrolitre numune ile matrisi karıştırdıktan sonra, onu çelik bir MALDI hedef plakasına yükleyin ve kurumasına izin verin. Veri analizi için, kütle spektrumunun dışa aktarılan ASCII dosyasını GlycoWorkbench'e yükleyin.

Temel düzeltme yaptıktan sonra tepe merkez noktalarını hesaplayın ve açılır pencerede uygun kütle aralığını, minimum sinyal-gürültü oranını ve minimum kütle spektrometrisi tepe yoğunluğunu seçin. Sonra, zirve listesine uyan yapı bileşimlerini belirlemek için Glyco-Peakfinder aracını kullanın. Teşif olarak perMe, redEnd'i indirgeme uç olarak seçin ve minimum ve maksimum beklenen kalıntı sayısını belirleyin.

Müsinler için Hexose, N-Asetil-Hexosamin, Deoxy-Hexose ve N-Asetilnöraminik Asit seçin. Sülfatlı glikanlar için, 87.9 kütleli Diğer Kalıcı seçeneğini kullanın. MALDI-TOF verileri için, maksimum sodyum iyon ve yük sayısını birer olarak ayarlayın ve doğruluğu 0,5 Dalton olarak ayarlayın.

Control tuşu ile tüm doğru açıklamaları seçin ve her birine tıklayın. Seçilen notasyonlara sağ tıklayın ve Açıklamalı zirve listesine ekle seçeneğini seçin. Birden fazla notlanmış spektrumu karşılaştıran bir rapor oluşturmak için, Araçlar ve ardından Raporlama bölümine gidin ve farklı profilleri karşılaştıran bir rapor oluşturun.

Raporu PDF olarak yazdırarak kaydedin. Parçalanma spektrumları analizi için, spektrumları GlycoWorkbench'e yükleyin ve daha önce gösterildiği gibi tepe listesini oluşturun. Açıklamalı glikan bileşimlerine karşılık gelen varsayılan glikan yapıları çizin.

Her yapı için parça oluşturmak için, sağ tıklayarak Fragments Copy in Canvas'ı seçin ve Fragments aracı altında Compute fragments seçin. Daha fazla parçalanma analizi için, spektrum görüntüleyicideki ilgi zirvesine tıklayın. Sağ tıklayın ve Seçilen zirvenin ana şarj oranını çevrimiçi veritabanlarına göre sorgulamak için Tüm zirveleri eşleştiren tüm yapıları bul'u seçin.

İlgi çekici yapıları seçin ve uygun seçenekle onları tuval penceresine kopyalamak için sağ tıklayın. Her glikan yapısından olası parçaları hesaplamak için, tuvaldeki yapıyı seçin. Daha sonra, araçlar ve parçalar altında, mevcut yapı için hesaplama parçalarını seçin.

Birden fazla glikan yapısı için parçalar hesaplandıysa, Özet sekmesinin altındaki Fragments tablo görünümüne gidip karşılaştırma tablosunu görebilirsiniz. Her potansiyel glikan yapısı için zirve listesine uygun parçaları seçin. Sağ tıklayın ve açılır menüden Kopya parçalarını tuvalize etmek için seçin.

Son olarak, Araçlar sekmesinde Profiler'a gidin ve ardından tüm yapıları içeren zirveleri Annotate ekleyin. Sonra Araçlar, Raporlama ve Açıklamalar için bir rapor oluştur seçeneğini seçin. İyon değişimiyle tuzdan arındırma, daha büyük glikanların daha iyi geri kazanılmasına yol açtı; bu daha büyük yapılar toplam glikanların %31'ini oluştururken, PGC ekstraksiyonu %21'i oluşturuyordu.

Tanımlanan glikan yapıları arasında, bir glikan yalnızca iyon değişimiyle tuzdan arındırılmış numune aracılığıyla tespit edilmiştir. Ayrıca, iyon değişimi ve borat uzaklaştırmasıyla tuzdan arındırma, PGC ile katı faz ekstraksiyonu sonrası üretilen spektrumlara kıyasla daha yüksek sinyal-gürültü oranlarına yol açtı. 30 ve 90 dakikalık permetilasyon reaksiyon süreleriyle 33 glikan zirvesi tespit edilirken, beş dakikalık reaksiyonda sadece 31 zirve tespit edildi.