Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, bağışıklık organları ve hücrelerindeki gliko parmak lipid antijenlerinin ekspresyon profili hakkında bilgi edinmek için spesifik ve hassas bir yöntem oluşturmaktır. Bu, önce hücrelerden glikok liflerinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, nötr gliko parmak lipidlerini asidik gliko fingal lipidlerden ayırmaktır.

Fosfolipitler nötr lipitlerden uzaklaştırıldıktan sonra, ekstrakte edilen gliko lipitler, heksozların tüm hidroksil gruplarının metoksi grupları ile değiştirildiği bir perma metilasyon reaksiyonu kullanılarak kimyasal olarak modifiye edilir. Sonuç olarak, ekstrakte edilen gliko parmak lipidleri, matris destekli lazer, DESORPSIYON iyonizasyonu, uçuş süresi, kütle spektrometresi, kısaltılmış kalıp TOF MS ve demir tuzağı kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilir. Bu tekniğin analitik HPLC ve antikor boyama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, kütle spektrometresinin daha hassas olması ve doğru masif molekülleri ölçmesidir.

Bu yöntem, glikolipid antijenlerinin düşük bolluğunun ölçülmesi gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, kanserin tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü GD iki ve global H gibi birçok glikolipid antijeni kanser biyobelirteçleri olarak ifade edilir. Profesör DA Pen Zoe'nin laboratuvarından bir lisans öğrencisi olarak prosedürü göstereceğim.

Dr.David Hawk, bu işleme başlamadan önce kütle spektometrisi cihazları üzerinde prosedürler gerçekleştirecektir. Sıçan bazofil lösemi hücrelerini hazırlayın, hücreleri bir hemo sitometre ile sayın. Tripper mavi boyamadan sonra, hücrelerin canlılığı %95'ten daha yüksek olmalıdır Hücrelere önce altı mililitre bire bir hacimsel kloroform metanol oranı ekleyerek lipitleri çıkarın.

Karışık polarite çözücü ile bir ila iki saat boyunca kapsamlı sonikasyon kullanın. Bu prosedürü, yazılı prosedürde açıklandığı gibi hazırlanan 55 ila 25 ila 20 hacimsel izopropanol heksan suyu oranı ile iki kez tekrarlayın. Önce altı mililitre kloroform, metanol ve sonikat ekleyin.

Çözünmeyen malzemeyi beş dakika boyunca 4.000 RPM'de peletlemek için santrifüjleme ile sonikasyonu takip edin. Sinameki'yi dört saat boyunca hızlı bir elektrikli süpürgede kurutmadan önce çekin. Nötr lipitleri asidik lipitlerden ayırmak için, küçük bir de A e sedex A 20 sütunu üzerinde anyon değişim kromatografisi kullanın.

DEAE SEDEX A 25'i bu videoya eşlik eden yazılı prosedürde açıklandığı gibi hazırladıktan sonra, sütunu cam duvar ve dokuz inçlik bir makarna pipeti kullanarak hazırlayın. Reçine tozu kolondan geçmeyecek şekilde cam duvarı dikkatlice paketleyin. DEAE sedex A 25 reçinesini, kolonun kurumasına izin vermeden dokuz inçlik geçmiş hava pipetinin boynuna ekleyin.

Yılanda reçine olmadığından emin olun. Sonikatı çözün ve lipitleri 30 ila 60 ila sekiz hacimsel kloroform metanol su oranında yeniden askıya alın ve çözünmüş numuneleri kolona uygulayın. Nötr lipitler kolondan akarken, yüklü lipitler kolonda kalacak ve asidik lipit fraksiyonunu metanol içinde sekiz mililitre sodyum asetat ile elüte edecektir.

Burada gösterilen, sodyum asetat ile muamele edildikten sonra kurutulmuş negatif yüklü fraksiyondur. Diyalizi takiben slayt Eliza diyaliz kasetini kullanarak fraksiyonları diyaliz ile tuzdan arındırın. H-P-T-L-C'yi gerçekleştirmek için yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi veya H-P-T-L-C kullanarak lipitlerin ön analizinden önce fraksiyonları hızlı bir şekilde kurutun, izole edilmiş nötr gliko parmak lipitlerini veya gsl'yi 200 mikrolitre içinde çözün bire bir hacimsel kloroform metanol çözücüsü.

Numuneyi bir silika jel ince tabaka kromatografi plakasına yükleyin. Plakayı kuruttuktan sonra plakaları 60 ila 35 ila sekiz hacimsel oranda kloroform metanol suyunda çalıştırın. Asidik lipitler veya gangliositler için 300 santigrat derecede arsenal sülfürik asit ile gliko parmak lipitlerini görselleştirin.

Çözücü olarak 55 ila 25 ila 20 hacimsel oranda izopropanol hekzan suyu kullanın ve aynı şekilde H-P-T-L-C'de çalıştırın. Bu noktada, nötr fraksiyon sadece nötr gliko parmak lipitlerini değil, aynı zamanda asetilasyon ve para asetilasyon reaksiyonu ile uzaklaştırılması gereken fosfolipidleri de içerir. İlk olarak, DEAE sedex A 25 geçiş fraksiyonunu VAC hızında dört saat boyunca soğutarak kurutun.

Numuneler kuruduktan sonra, tekrar hıza koyun ve dört saat daha kurutun. Herhangi bir kalıntı su para asetilasyon reaksiyonunu önleyeceğinden bu numunelerin tamamen kuru olduğundan emin olun. 200 mikrograma kadar gliko fing lipidlerinin para asetilasyon reaksiyonu için numunelere bir mililitre PERINE ve 0.5 mililitre asetik bir hidrit ekleyin ve karanlığı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

GSL'nin tam buharlaşmayı sağlamak için bir mililitre toluen eklemesi ve parçalanmış malzemeyi üç saat boyunca hızlı vakum ile kurutması daha iyi olan bir sıcaklık. Numuneler hala tamamen kurumamışsa, burada gösterilen kurutulmuş parasetik numune kuruyana kadar VAC'yi hızlandırın. Bu arada, önce floris mühür boncuklarını 110 derecelik bir fırında inkübe ederek tamamen kurutarak bir Floris mühür sütunu hazırlayın.

Daha sonra kolonu cam yünü ile bir makarna pipetinde hazırlayın, boncukları makarna pipetine boyuna kadar doldurarak ve baca hücresi kolonundan dörde bir hacimsel oranda iki di kloro Etan Hekzan Elüsyonu çok hızlıdır. Solventlerin hızlı uçuculuğu kolon kurumasına neden olabilir. Bu nedenle, tüm çözücü karışımları kolonu çalıştırmadan önce hazırlanmalıdır.

Elüsyon sırasında kolonu durdurmak mümkün olmadığından. Percet örneğini bir mililitrede bir, iki di, kloro, ETH, Ethan, Heksan'ın dörde bir hacimsel oranına uygulayın. Sütunu altı mililitre aynı çözücü ile yıkayın, ardından 10 mililitre bir iki di kloro etan elu ile yıkayın.

Nötr, GSL'yi altı mililitre bir, iki diklor asetonun bire bir hacimsel oranıyla algılar. Bu adım, percet fosfolipidlerini gliko parmak lipidlerinden uzaklaştırır, çünkü percet gliko parmak lipidleri florol kolonuna bağlanırken percet fosfolipidleri bağlanmaz. Fraksiyonları iki saat boyunca hızlı bir şekilde kuruttuktan sonra, oda sıcaklığında üç saat boyunca iki mililitre 0.5 molar sodyum, metamfetamin oksit ve iki mililitre metanol ile deasetilat edin.

İnkübasyonun ardından, karışımı üç mililitre metanol, asetik asit ile nötralize edin ve hızlı geri dönüşle kurutun, dizel ile diyaliz ile kurutun, kurutulmuş ürünleri üç mililitre su içinde çözerek ve slayta enjekte ederek Eliza diyaliz kaseti ve ardından 24 saat boyunca suya karşı diyaliz yapın, suyu değiştirerek diyaliz edilmiş gsl'yi numuneler tamamen kuruyana kadar hızlı vakum ile en az iki kez kurutun Perma metilasyonu için. İlk olarak, kimyasal davlumbazda özel kurutma koşulları veya inert gaz atmosferi kullanmadan 150 mikrolitre dimetil sülfoksit ile vidalı kapaklı ve Teflon astarlı bir cam tüpe GSL'yi tanıtın, sodyum hidroksit parçacıklarından toz haline getirilmiş sodyum hidroksiti havan tokmağı ile kimyasal bir havanda öğüterek hazırlayın. Daha sonra, sodyum hidroksit tozunu bir spatula ile numune çözeltisine ekleyin.

Ardından 100 mikrolitrelik Hamilton şırınga ile 80 mikrolitre IO metan ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında bir saat çalkalayın, metilasyon reaksiyonunu iki mililitre su ile söndürdükten sonra, iki mililitre diklorometan ilavesiyle perma metillenmiş ürünleri çıkarın. Glikolipidler, alt faz olan diklorometan fazındadır, bu nedenle üst faz yeni bir cam tüpe aktarılabilir.

Perma metillenmiş ürünler daha sonra toplam üç ekstraksiyon için kloro metan ile tekrar ekstrakte edilebilir. Kombine di kloro metan ekstraktlarını iki mililitre su ile üç kez yıkayın, son yıkamayı takiben her yıkamadan sonra üst sulu fazı boşaltın, numuneleri yeni bir tüpe aktarın ve kurutun. Hız kullanılarak vac numuneleri daha sonra 100 ila 200 mikrolitre metanol içinde çözülebilir, yazılı prosedürde açıklandığı gibi gerçekleştirilen kütle spektrometresi analizi için numuneler Texas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi proteomik tesisine gönderildi ve MALDI ile MS MS kütle spektrometresine ve ayrıca bir iyon tuzağı LTQ kütle spektrometresine analiz edildi.

Burada, NKT hücrelerine gliko parmak lipid antijenleri sunan bir antijen sunan hücre tipi olan sıçan lösemi hücre hattı RBL'den alınan gliko parmak lipidlerinin MALDI MS analizinin bir örneği gösterilmektedir. İyonlar, gliko parmak lipid sentezini inhibe eden ilaçla tedavi edilen RBL hücrelerindeki spesifik gliko parmak lipid yapılarına atanabilir. Tüm gliko parmak lipidlerinde önemli bir azalma gözlendi.

Yapısal izomerler ayırt edilemez. Uygulanan biyosistemlerin msms kapasitesi 4, 700, MS bir iyonunun MS iki parçasına parçalanmasına izin verir ve sınırlı yapısal bilginin üretilmesine izin verir. Bununla birlikte, MS iki analizi genellikle oligosakkarit izomerlerini ayırt etmek için yeterli değildir, oysa gliko parmak lipidlerinin iyon tuzağı MS analizi, bu tür izomerleri tespit etmek için oligosakkarit izomerlerinin incelenmesini sağlar.

Standart IGB üç ve GB üç, bu özellikte gösterildiği gibi farklılıklar bulunana kadar çoklu parçalanma turları ile analiz edildi. IGB üç ve GB üç'ün farklı oranları karıştırıldığında IGB üç veya GB üçten türetilen MS dört iyon profili, Her izomerden türetilen imza iyonlarının iyon bolluğuna dayalı olarak standart bir eğri yapılabilir. Burada sunulan örnekte, IGB üç ve GB üç, standartlarla karşılaştırılarak ayırt edilebilir.

Bu spektrum, 1 3 2 5'in MS dört analizini temsil eder, GB üç IMR'leri temsil eden moleküler demir ve IGB üç için IGB üç imza iyonu ve GB üç için imza iyonları, iki izomerin bir karışımının varlığını düşündürür. IGB üçünün GB üçe oranı, standart bir eğri ile karşılaştırılarak hesaplandı. Bu prosedürü denerken, glikolipidlerin prometilasyonundan önce kromatografi sırasında glikolipidleri tamamen geri kazanmayı unutmamak önemlidir.

Saflaştırma sırasında en az 80 mikrogram glikolipidin geri kazanıldığından emin olun. Bu videoyu izledikten sonra, glikolipidlerin yarı kantitatif kütle spektometrisi yöntemiyle nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Glikolipid ekstraksiyonu, nötr ve asidik fraksiyonlara ayırma, perma metilasyon reaksiyonu ile modifikasyon ve modifiye glikolipidleri kütle spektometrisi tesisinize gönderme gibi temel adımlarda ustalaşacaksınız.

Bir, iki di, kloro, efan, klor, asetik asit ve I oto metan ile çalışmanın kanserojen olarak son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Kurallara saygı gösterin ve keşfinizin tadını çıkarın.