Name: Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Öğrenin, glikosfingolipid antijenlerinin kütle spektrometrisi ile hassas analiz yöntemini. Rat bazofil lösemi hücrelerinden ekstraksiyon, iyon tuzağı MS ve MALDI-TOF MS teknikleriyle immünolojik araştırmalar için uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DZ MD Anderson Kanser Merkezi ve NIH hibe AI079232 tarafından desteklenmektedir. MD Anderson Kanser Merkezi NIH hibe CA16672 tarafından kısmen desteklenmektedir.

1. Lab Güvenlik Endişeleri <ol><li> Tüm organik çözücüler anlaşılır etiketleme ile belirli alanlarda saklanmalıdır. Gerekli yangın söndürücüler türleri için üretici tarafından etiket bkz. </li><li> Kullanılan çeşitli reaktifler potansiyel kanserojendir, ve zihinsel depresyona neden olabilir. Bu reaktifler havalandırma olan bir kimyasal kaputu (spesifik reaktifler ve özellikleri için ekipman tabloya bakınız) ele alınmalıdır. </li><li> Tavsiye edilir organik çözücüler ve hücreler, eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması her zaman kullanılabilir gibi kişisel koruyucu ekipman ile çalışırken. </li></ol> 2. Sıçan Lösemi Hücreler Glikosifingolipidler Ekstraksiyon <ol><li> Mağaza RBL sıçan lösemi hücreleri -80 altında 16x100 mm cam tüpler içinde 8 (10000000-100,000,000) ° C koşulları. Hücreler tripan mavisi boyama sonrası hemasitometre ile sayılır. Hücre canlılığı% 95&#39;den daha fazla olmalıdır. </li><li> Geniş sonicat kullanılarak lipidler Özü1-2 saat karışık kutup çözücüler ile her biri için iyon dört kez. İlk ve son çözücü olarak kloroform-metanol 1:1 (v / v), 6 ml kullanımı. Izopropanol altı mililitresi: heksan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, kullanımdan önce aspirasyon ile üst faz kaldırmak) daha sonra ikinci ve üçüncü çözücü olarak da kullanılabilir. Bu çözücü karışım izopropanol ile hazırlanır: heksan: bir 55:25:20 oranında H2O, kuvvetlice titreme, ve bir üst faz çıkarılır, hangi görünmesine izin verir. Kullanım için alt evre tutun. </li><li> Topak, çözünmeyen malzeme santrifüjleme ile sonikasyon izleyin. Süpernatantlar Sandalye. 4 saat boyunca, bir Speedvac içinde kurutun. Speedvac dışıysa ya da azot akışı döner buharlaştırıcı kullanılabilir. Buharlaşan organik çözücüler tutmak için iyi bir soğuk tuzak kullanın. Vakum pompası yağ olarak organik çözücü kirlenmesi vakum pompası verim düşer. </li><li> Yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) kullanılarak bir ön analiz gerçekleştirin. Glikolipitler ölçmek için,% 50 sülfürik asit çözeltisi (50 ml içinde 100 mg) ve bir standart Galaktoz (100 ml stok çözelti 40 mg) içinde bir% 0.2 Orcinol hazırlanır. Reaksiyon 30 ul hacim içinde standart bir eğri (g / L 0 ile 20 g / L) olarak kullanım için bir seri seyreltmeleri hazırlayın. Her bir seyreltme serisi numune metanol ve 20 ul ekle. , Metanol 200 ul her bir glikolipid örnek çözülür sonikasyon, glikolipid ve miktar ölçümü için 20 ul kullanır. Vidalı kapaklar (Sarstedt, 72.692.005) ile 1.5 ml Eppendorf tüpleri içinde, standart eğri için hizmet Galaktoz-H 2 metanol O-çözümleri bir dizi ile, her bir numune için en az% 50 sülfürik asit çözeltisi içinde% 0.2 Orcinol 0.4 mL . 100 ısıtma bloğu içinde 5 dakika için kaynatılır ° C. Sunrise Tecan Mikroplaka Okuyucu kullanarak 440 nm&#39;de renk reaksiyonu optik yoğunluğu okuyun. Kloroform-metanol 1:1 (v / v) ile muamele nötr yağlar için çözücü olarak H2O 60:35:8 (v / v / v) metanol: HPTLC gerçekleştirmek için, kloroform kullanır. Heksan: H2O 55:25:20 (v / v / v) olarak kullanımı izopropanolasit lipidler (gangliosides) için çözücü. İzole edilen nötr GSLs 200 ul çözücü kloroform içinde çözülmüştür: metanol 1:1 (v / v) ve Drummond Microcaps tarafından Merck silis jel ince tabaka kromatografisi plaka üzerine yüklendi. Plakalar çözücü kloroform çalıştırıldı: metanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) ve kurutulur. Glikosifingolipidler 300 Orcinol-sülfürik asit tarafından görüntülendi ° C. </li><li> DEAE A-25 Sephadex küçük bir sütun üzerinde anyon değişim kromatografisi ile nötr ile asitli lipidler dışarı asidik lipitler, fraksiyondan nötr yağlar ayırmak için, [DEAE Sephadex A25 reçine Sephadex A-25 reçine ıslatma yolu ile hazırlanabilir kloroform içinde toz: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) bir karışımı. Sephadex A25 reçine bırakılır olduğu tüm bu kadar süpernatant aspire. Reçine yıkama H2O 30:60:8 (v / v / v) metanol: kloroform taze ekleyin. Sephadex A25 reçine] gelen negatif yüklü artıkları çıkarmak için üç kez tekrarlayın. </li><li> Eritmek, Sonikasyon (en fazla 10 dakika), ve solüsyona kloroform içinde adım 2.1 &#39;den tekrar süspansiyon lipidler: Gerektiğinde H2O 30:60:8 (v / v / v) metanol. </li><li> Cam yünü ve 9 kullanarak küçük bir DEAE Sephadex A25 (Cl Formu) sütun hazırlayın &quot;Pasteur pipeti. Dikkatle böylece reçine tozu sütun geçmez cam yünü paketleyin. Etmek DEAE Sephadex A25 (Cl Formu) reçine ekle&quot; Sütun kuru izin olmadan Pasteur pipeti &quot;9&quot; boyun. Eğer akıtıcı herhangi bir reçine görmüyorum emin olun. Kloroform içinde çözülmüş numuneler: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) eritildi. Nötral lipid Kesir yoluyla akışıdır. </li><li> Metanol içinde sodyum asetat 8 ml ile asidik lipit fraksiyonu (reçine bağlı) Zehir. , Nötr ve asidik kesirleri hem kurulayın diyaliz bunları desalt, Speedvac onları kurutun ve HPTLC bunları analiz. </li></ol> Asidik fraksiyonu 3. Adım reaksiyon için, doğrudan diyaliz edilebilir gangliosides içerir.Nötr fraksiyonu bir asetilasyon reaksiyonla çıkarılması gerekir nötr Glikosifingolipidler, ama aynı zamanda fosfolipidler (fosfatidilkolin ve sphingomyelin), sadece içerir. Bizim tecrübelerimize göre, bir diyaliz kaset yöntemi, bir diyaliz tüp veya ters faz C18 kolon kromatografisi daha verimli ve kullanışlı. <ol start="9"><li> Bir sonraki adım bir asetilasyonu ve peracetylation reaksiyonu nötr Glikosifingolipidler fosfolipidleri çıkarılmasıdır. DEAE Sephadex 4 saat Speedvac A-25 geçişkenliğin fraksiyonu (soğutma) kurulayın. Örnekleri kuruduktan sonra, başka bir 4 saat Speedvac ve kuru içine geri koymak. Kalan suyun peracetylation reaksiyonu önlemek gibi, bu örnekler tamamen kuru olduğundan emin olun. </li><li> 1 ml piridin ile oda sıcaklığında veya 37 ° C&#39;da karanlık içinde asetik anhidrid ve 0,5 ml numune Peracetylate. Piridin ve asetik anhidrit Bu miktar kadar için uygun olanGlikosifingolipidler 200 ug. GSLs daha iyi bir çözünürlüğe sahiptirler olarak bu reaksiyon, 37 ° C&#39;de gerçekleştirilebilir. </li><li> Tam buharlaşma sağlamak için tolüen 3x (beraberce buharlaştırma) 1 ml &#39;de, 3 saat süre ile Speedvac ile peracetylated malzeme kurutun. Numuneleri kuruyana kadar hala Speedvac, tamamen kuru değilse. </li><li> Florisil boncuklar kullanılarak, cam yünü ile Pasteur pipeti bir Florisil (Sigma-Aldrich) sütun (30-60 mesh, 10 × 80 mm) hazırlayın. Florisil boncuklar tamamen bir 110 ° C fırın içinde inkübasyon yoluyla, kullanımdan önce kurutulmalıdır. Yukarı boyuna Pasteur pipet içine doldurun boncuklar, ve 1,2-dikloroetan-heksan 4:1 (v / v) içinde dengeye. </li></ol> Florisil sütundan Elüsyon çok hızlı. Çözücülerin hızlı kolon uçuculuk kurutma yol açabilir. Böylece bütün solvent karışımları da elüsyon sırasında kolon durdurmak mümkün değildir, çünkü kolon çalıştırmadan önce hazırlanmalıdır. <ol start="13"><li> Peracetyl Uygula1. 1,2-dikloroetan-heksan 4:1 (v / v) ml ve 1,2-dikloroetan, 10 mL, ardından aynı çözücü, 6 ml ile kolon yıkama içinde ated örnek. 1,2-dikloroetan, aseton 1:1 (v / v), 6 ml ile nötr peracetylated GSLs Zehir. Peracetylated fosfolipidler yok ederken peracetylated Glikosifingolipidler, Florisil kolon bağlamak için bu adım Glikosifingolipidler dan peracetylated fosfolipidler kaldırır. </li><li> 2 ml 0.5 M sodyum metoksit ile 2 saat ve deacetylate için Speedvac tarafından fraksiyonlar kuru [Sigma-Aldrich, 403067], oda sıcaklığında 3 saat boyunca 2 ml metanol içinde. </li><li> Metanolik asetik asit ve 3 ml diyaliz ile Speedvac, desalt ile [asetik asit / metanol 15/85 v / v], kuru [3 mL su içinde kurutulmuş ürün çözülür ve Slide-A-Lyzer içine enjekte ile karışım Nötrleştir Diyaliz Kaset, 24 saat boyunca suya karşı dialyze. En az iki kez su değiştirin]. Numuneler tamamen kuruyana kadar Speedvac tarafından diyalizlenmiş GSLs (su çözeltisi içinde) kurulayın. </li&gt; </ol> 3. Glikosifingolipidler 13 Kimyasal Modifikasyonu (Permethylation) <ol><li> Bir vidalı kapak ve Teflon astarlı bir cam tüp GSLs (1-20 mg) tanıtılması ve özel kurutma koşulları veya inert gaz atmosferinde kullanmadan dimetil sülfoksit (150 ul) ekleyin. </li><li> Bir tokmak ile kimyasal bir havan içinde öğütülerek sodyum hidroksit partikülleri elde edilen toz sodyum hidroksit (40-60 mg) hazırlayın. Bir çok kuru ortamda tozlar depolamak ve tozlar nefes önlemek için kimyasal kaputu taşlama yapmak için dikkatli olmak emin olun. </li><li> Sonraki bir spatula ile örnek çözeltiye sodyum hidroksit tozu ekleyin. 100 mikrolitre Halmilton şırınga ile iyodometan (80 ul) ekleyin [ya da kauçuk borudan yapılmış bir şırınga aracılığıyla bağlı pipet kalibre edilmiş bir 100 mikrolitre VWR kullanılabilmektedir] ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım çalkalanır. </li><li> Su (2 mi) ile metilasyon reaksiyonu dindir. Tarafından permethylated ürün 3 kez ÖzüDiklorometan ilave (2 ml) [glikolipitler alt faz, yani üst faz yeni bir cam tüpe transfer edilebilir, ve diklorometan ile tekrar ekstre edilir ve diklorometan fazı, içindedir]. </li><li> Kombine diklorometan [, su üst faz, daha sonra atılabilir] 2 ml su ile 3 kez özü yıkayın. En son yıkama aşamasından sonra, yeni bir tüp için örnekler aktarmak ve Speedvac kullanılarak kurutun. </li><li> Örnekler daha sonra, ESI-MS analizi için metanol 100 ila 200 ul içinde çözülebilir. </li></ol> 4. Permethylated Gycosphingolipids MALDI-TOF Analizi <ol><li> Bir MALDI TOF-TOF Kütle Spektrometresi (Biosystems 4700, Foster City, CA Uygulamalı) üzerine MALDI-TOF-MS ve MALDI-TOF/TOF-MS/MS deneyler yapın. 10 mg / ml dihidroksibenzoik asit (DHB) asetonitril ve su içinde% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA) ve% 50 hacim arasında en az% 50 hacim karıştırma ile matris hazırlayın. </li><li> DHB matris MALDI küçük kalkan üzerinde lekeli olabilirmetanol içinde çözülmüş örnek bir 1 ul (100 ng GSLs içeren) nokta, ardından t (1 ul) eklendi. Yavaşça uygulayın ve analizden önce kurumasını bekleyin. </li></ol> 5. Permethylated Glikosifingolipidler İyon Trap MS Analizi <ol><li> Bir nanoelectrospray kaynağı kullanarak doğrusal iyon tuzağı kütle spektrometre (ThermoScientific LTQ, San Jose, CA) kütle spektrometresi yürütmek, 230 0.30 dak / ul debi ° 30-50% çarpışma enerjisi ile pozitif iyon modunda C kapiler sıcaklığı. Öncül iyon bir minimal rezidüel bereket bırakmak çarpışma enerjileri ayarlayın. Sodyum adducts gibi tüm iyonlar algıla. </li><li> Glikan parça m / z 667 ve uç disakarit 1 üzerinden sodiated moleküler iyon MS 4 ürün iyon farklı şekilleri karşılaştırarak GB3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) ve iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standartlarının izobarik bir karışım içinde iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) tespit - ene iyon m / z 445 (yaniX → 667 → 445 → X permethylated GB3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) olanlar ile ESI-LIT-MS ile saf permethylated iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standartları MS 1) tespit moleküler iyon demektir. </li></ol>

<ol><li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P. Chapter 10 Glycosphingolipids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchnaar%2C+RL+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).</li>
<li>Bendelac, A. Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBendelac%2C+A+%22Fundamental+Immunology%22">Fundamental Immunology</a>. Paul, W. E. , 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).</li>
<li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li>
<li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+function+of+iGb3%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protein+Pept.+Sci%22%5BJournal%5D)">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li>
<li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li>
<li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mapping+of+glycomes%3A+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li>
<li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li>
<li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li>
<li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li>
<li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+permethylation+of+glycolipid%2C+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205(1964).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209(1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li>
<li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li>
<li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213(2003).</li>
<li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Chapter 47 Structural Analysis of Glycans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).</li>
<li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li>
<li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib%3A+an+MSn+spectral+library%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li>
</ol>

DZ Biotex, Houston, Teksas, ve yayınlanan bu makalede açıklanan teknolojileri ile ilgili patent, ya da uygulama dahil bir mucit için danışmanlık yapmaktadır.

Glycome, genom ve proteom benzerlik içindeki bir terim, bir organizmanın tüm sakarit yapılarını ifade eder. Tam glikozilasyon manifoldu fonksiyonlarını kavramak hem işlevsel hem de yapısal glycomics çalışmaları da dahil olmak üzere entegre bir yaklaşım gerektirir. Hem glukanıdır biyosentezi, glukanıdır yapıların oluşabilecek karmaşıklığı ve çeşitliliği, moleküler düzeyde modülasyonlu glukanıdır ligand-reseptör etkileşimlerinde aglikon yapısının sık tutulum, ve düşük bolluk ligandların fonksiyonel önemi olmayan şablon odaklı doğa tarafından karmaşıktır. Bu, genel olarak kütle spektrometrisi (MS), özellikle düşük bolluk ligandlar tanımlanması ve karakterize edilmesi için yapısal glycomics çalışmalar için vazgeçilmez bir yöntem olduğu genel olarak kabul edilmektedir. Moleküler türler olarak glukanlardır veya glycoconjugates gözlemlemek için genellikle elektrosprey iyonizasyon (ESI) adlı yüksek verimli, düşük enerji iyonizasyon yöntemi kullanın. Daha det içinglukanıdır yapısının karakterizasyonu ailed, bireysel moleküler türler seçmek ve küçük parçalar halinde glukanlardır kırmak için esastır. Bu, normal olarak atıl gaz molekülleri ile çarpışma sayesinde glukanlardır aktive içerir çarpışma ile endüklenen ayrışma ile yapılır. Daha fazla enerji ile bağ kırılmasının indükler, ve sonuçta elde edilen parça, sistematik analiz glikan moleküler yapısı hakkında bilgi sağlar. Genellikle, &quot;imza&quot; parçaları özellikle glukanıdır yapısal özellikler için tanısal olduğu oluşturulabilir. Birlikte moleküler kütle ile, aşağıdaki yapı parçaları yeni olup, özellikle de bazen glukanlardır tanımlamak için yeterli olabilir, ancak son olarak çok daha fazla bilgi tam olarak karakterize etmek için gerekli olmuştur. Bu yöntemler, şeker bileşim analizi, bağlantı analizi için kısmen metillenmiş alditol asetat arasında gaz kromatografi analizi kütle spektrometrisi, ve spesifik glycosidase sindirim 17 içerir. 18-19 gösterildiği gibi, etkili bir şekilde (IT-MS), bir iyon tuzak kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir düşük enerji parçalanma, birden fazla yuvarlak, çok glikan kütle spektral analizi ile bilgi verimi artırır . Parçalanma (diğer MS araçları ile yapılabilir edilemeyen) dört ya da beş tur ile, bu aynı olan bileşenleri karışımı içinde bir arada mevcut olsa bile, farklı bir şeker bağlar düzenlenmiş aynı şeker bileşenleri içeren izomerik glukanlardır ayırt etmek mümkündür molekül kütlesi (İzobarları). Bu analiz için, glukanlardır permethylation kullanılarak metil grupları ile tüm serbest hidroksil gruplarının yerine, türevlendirilmiş edildi. Glukanlardır yapısal atama permethylation olmadan mümkün olsa da, permethylation duyarlılık 17 artar. Levery ve Zhou, izomerik stru tespiti de dahil olmak üzere BT-MS yöntemi potansiyel tüm avantajlarını, birleştirdikBirden çok izobarik karışımları 7-9 şeklinde mevcut Glikosifingolipidler son derece hassas kimlik ve miktarının belirlenmesi için MS 4 ve 5 MS spektrumları olarak gözlenebilir imza teşhis iyonları kullanılarak ctures. Teoride, biz kimyasal sentez edilebilir standart glikolipidlerin durumu bekleyen, mevcut her glikolipid yapısını tespit etmek mümkün olabilir. Bu analizin kritik adımlar biyolojik örneklerden GSLs iyileşme oranı vardır. GSL Tipik olarak 80 ug örneğin RBL olarak 100 milyon tümör hücrelerinden elde edilebilir. Iyon tuzağı Massenspektrometer parçalanma çok sayıda mermi için yeterli molekül iyonları üretmek için, tümör GSLs en az 10 mikrogram gereklidir. Saflaştırma sırasında GSLs Düşük verim daha da parçalanma tabi olamazdı iyonlar, düşük bolluk yol açacaktır. Analiz başarı elde edilmiştir GSLs miktarına bağlıdır. Tipik olarak, son konspermethylated GSLs ve entration bir nano-elektrosprey kaynak üzerinde analiz edilmeden önce, metanol içinde çözülmüş 1 mg / ml, ulaşması gerekir. Ayrıntılı bir MS n analizi için sınır MS 1 profilindeki spesifik iyon bolluğu bağlıdır. Tipik bir e 7 iyon bolluğu tam bir MS 5 analizi için gereklidir. Saflaştırma sırasında GSLs ve düşük verim başına asetillenmiş GSLs, Florisil reçine kromatografi kolonuna bağlı yıkanmış, ve daha sonra akıtılan olmalıdır peracetylation aşaması esnasında GSLs kaybı (fosfolipid kaldırılır) neden olabilir. Silis jel ile per-asetillenmiş GSLs bir bağlayıcı sağlamak için, numune içinden akan sonra sütun kromatografi ile iki kere yeniden olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>1,2 Diklor&amp;#8211;etan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34872</td><td>Karsinojenik</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>VMR</td><td>JT9524-0</td><td></td></tr><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Fluka</td><td>45830</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fischer</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fischer</td><td>C606-1</td><td>Karsinojenik</td></tr><tr><td>DEAE Sephadex A25 (Cl Formu)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>AB 17&amp;#8212;170-01</td><td>100 gram</td></tr><tr><td>Dekan (susuz):</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457116</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Dikloroasetik asit</td><td>Sigma</td><td>D54702</td><td>Karsinojenik</td></tr><tr><td>Diyaliz kaseti</td><td>Fischer(Pierce)</td><td>66110</td><td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>20684</td><td></td></tr><tr><td>Etil asetat</td><td>Fischer</td><td>UN1173</td><td></td></tr><tr><td>Florisil</td><td>Fluka</td><td>46384</td><td>Kromatografi kolonunu doldurmak için</td></tr><tr><td>Hekzanlar</td><td>EMD</td><td>HX0290-6</td><td></td></tr><tr><td>İyodometan</td><td>Riedel de Haen, Almanya</td><td>03810</td><td>Gümüş folyo ile stabilize edilmiş, Karsinojenik</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR/EMD</td><td>MXO475-1</td><td></td></tr><tr><td>Nötral glikosfingolipid Qualmix</td><td>Matreya</td><td>1505</td><td></td></tr><tr><td>Monosiyalgangliosid karışımı</td><td>Matreya</td><td>1508</td><td></td></tr><tr><td>Disiyalgangliosid karışımı</td><td>Matreya</td><td>1509</td><td></td></tr><tr><td>Laktosil seramid ve siyalosil türevleri</td><td>Matreya</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Gangliotetraozil seramid ve siyalosil türevleri</td><td>Matreya</td><td>1511</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Piridin:</td><td>Sigma</td><td>270407</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit:</td><td>BDH</td><td>0292</td><td>500 gram</td></tr><tr><td>Sodyum metoksit</td><td>Sigma</td><td>404367</td><td>Metanol içinde 0.5 M çözelti</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>J.T. Baker</td><td>9351-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Fiberglas (cam yünü)</td><td>Corning Incorporated</td><td>3950</td><td>Pyrex 9989 cam</td></tr><tr><td>12x75 mm cam tüpler</td><td>Fischer</td><td>14-962-10B</td><td></td></tr><tr><td>Kalibre edilmiş pipetler (100 mikrolitre)</td><td>VMR</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>16x100 mm tek kullanımlık borosilikat tüpler x1,000</td><td>Fischer</td><td>14-961-29</td><td>Vidalı kapaklı</td></tr><tr><td>Cam tüpler için kapaklar</td><td>Kimble</td><td>40566C</td><td>boyut/13-415</td></tr><tr><td>Merck TLC plakaları</td><td>Sigma</td><td>Z 29, 301-6</td><td></td></tr><tr><td>TLC için cam tank</td><td>Sigma</td><td>Z 12,619-5</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond scientific company</td><td>1-000-0100</td><td>10 &amp;mu;l, TLC numunelerini yüklemek için</td></tr><tr><td>Sunrise Mikroplaka Absorbans Okuyucu</td><td>Tecan</td><td>A-5082</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Kromatografi Kağıdı</td><td>Fischer</td><td>05-716-3E</td><td>18 cm x 34 cm TLC Tankı için</td></tr><tr><td>Orcinol ferrik klorür sprey reaktifi</td><td>Sigma</td><td>O7875</td><td>TLC plakalarında glikosfingolipidleri tespit etmek için</td></tr><tr><td>Prevel Sprey Ünitesi</td><td>Sigma</td><td>Z 36,555-6</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Fischer</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Savant</td><td>AS160</td><td>Organik çözücüler için kimyasal tuzağı ile</td></tr><tr><td>MALDI TOF-TOF Kütle spektrometresi</td><td>Applied Biosystems</td><td>Proteomics 4700</td><td></td></tr><tr><td>İyon Tuzağı Kütle spektrometresi</td><td>Thermo</td><td>LTQ</td><td></td></tr></tbody></table>

glycosphingolipid antijenler kütle spektrometrik analizi

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glikosifingolipidler (GSL) &#39;ın böyle bir embriyonik gelişim, sinyal iletimi ve immün reseptör tanıma 1-2 gibi önemli biyolojik süreçler için yapısal bilgiler ayı biomacromolecules, en glycoconjugate sınıfına aittir. Bu kompleks izomerler şeklinde şeker parçalan, ve yağ asil zincir uzunluğu, doymamışlık ve hidroksilasyon ile varyasyonları dahil olmak üzere, lipid parçalarını içerir. Karbonhidrat ve seramid bölümleri Hem biyolojik önemi temeli olabilir. Örneğin, üç-hexosylceramides globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) ve aynı moleküler kitleleri, ancak 3-4 tamamen farklı biyolojik işlevleri için sorumlu karbonhidrat kısmın, belirgin şeker bağların sahip isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) da içermektedir. Başka bir örnek olarak, gösterilmiştir ki alfa-galactosylceramide, invari için güçlü bir agonist ligandının seramid kısmının modifikasyonukarınca NKT hücreleri, kanser ve oto-immün hastalıklar 5 hayvan modellerinde değişiklikler, sitokin salgılama profilleri ile işlev. Bağışıklık organlarda izomerleri ve hücrelerin yapısal bir analizini yapmakta zorluk çok biyolojik fonksiyonları 6 belirlemek için bir bariyer görevi görür. Burada, 7-9 bağışıklık hücreleri içinde glycosphingolipid profillerin, nispeten basit, hızlı ve hassas analiz için bir yöntem, bir biçim ortaya görüntülenmiştir. Bu yöntem, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon kullanan sonraki analizi ile Glikosifingolipidler 10-15 çıkarılması ve kimyasal modifikasyonu (permethylation, Şekil 5A aşağıya bakınız, heksoz bölgesinin tüm OH gruplarının permethylation sonra reaksiyon MeO ile değiştirildi), zamana dayalı -uçuş kütle spektrometresi (MALDI-TOF/MS) ve iyon tuzağı kütle spektrometresi. Bu yöntem, bir tam bir analiz için 50 milyon bağışıklık hücrelerini gerektirir. Deneyler bir hafta içinde tamamlanabilir. Çeşitli Glikosifingolipidler nispi bolluk sentetik standartlar ile karşılaştırma ile tarif edilebilir. Toplam iGb3/Gb3 karışım 2 fmol 9 mevcut olduğunda, bu yöntem, GB 3 izomerler arasında% 1 iGb3 ölçmek için bir hassasiyete sahiptir. Iyon tuzak kütle spektrometrisi izomerleri analiz etmek için de kullanılabilir. Örneğin, aynı numune içinde globotriaosylceramide ve isoglobtriaosylceramide varlığını incelemek için, bir yapısal iki (Şekil 5 aşağıya bakınız) arasında ayrım glycosphingolipid moleküllerin parçalanma kullanılabilir. Ayrıca, şeker parçalan kimyasal modifikasyonu (a permethylation reaksiyon ile) daha yüksek duyarlılık ve spesifite için iyonizasyon ve parçalanma verimi artırır ve siyalik asit kalıntılarının kararlılık artar. Glikosifingolipidler çıkarma ve kimyasal modifikasyonu, klasik bir edilebilir başlık kimyasal olarak yapılabilir, ve kütle spektrometrisi çekirdek ile gerçekleştirilebiliriyon tuzağı MS enstrümanları ile tesisleri.

Sıçan lösemi hücre çizgisi RBL (NKT hücreleri için glycosphingolipid antijen sunan bir antijen sağlayan hücre türü) Glikosifingolipidler bir MALDI MS analizi, bir örneği Şekil 3&#39;te gösterilmektedir. Iyonları belirli glycosphingolipid yapılar (Şekil 3A) atanabilir. NB-DGJ 16, glycosphingolipid sentezi, her Glikosifingolipidler önemli bir azalma (Şekil 3B) gözlendi inhibe eden bir ilaç ile tedavi edilen hücreler RBL. Yapısal izomerler ayırt edilemez. Applied Biosystems 4700 MS / MS kapasitesi sınırlı yapısal bilgisi elde edilmesine izin vererek MS 2 fragmanları MS1 iyonları parçalanma izin verir. Ancak, MS2 analizi sıklıkla oligosakkarit izomerleri ayırt etmek yeterli değildir. Glikosifingolipidler İyon tutarak MS analizleri bu tür iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) ve GB 3 (Galα olarak izomer çalışma etkinleştirirŞekil 3A tespit trihexosylceramide iyonlar halinde bulunabilirler 4Galβ4Glcβ1Cer). Farklılıkları (Şekil 4A ve 4B) bulundu kadar böyle izomerleri algılamak için, standart iGb3 ve GB3, parçalanma çok sayıda mermi ile analiz edilmiştir. Burada sunulan örnekte (Şekil 5C) iGb3 ve GB3 standart iGb3 ve GB3 karşılaştırarak tarafından ayrımcılık olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Şekil 1. Glycosphingolipid ekstraksiyon prosedürü Akış şeması ve Glikosifingolipidler (permethylation) kimyasal modifikasyonu. Glikosifingolipidler organik çözücüler hücreler elde edildi. Olmayan Glikosifingolipidler kaldırmak için, lipidler peracetylated ve deasetillenmiş olabilir. İkincisi, Glikosifingolipidler kimyasal bir permethylation reaksiyon tarafından modifiye edildi, hangi MS detectio duyarlılık ve özgüllüğünü arttırırn. Son olarak, glycosphingolipid profiller MALDI-TOF kütle spektrometrisi, iyon tuzak kütle spektrometresi kullanılarak belirlenmiştir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Şekil 2. Orcinol sülfürik asit metodu ile Glycosphingolipid miktar tayini:% 50 sülfürik asit çözeltisi ve glikoz bir standart eğri olarak Orcinol olarak% 0.2 ile Glikosifingolipidler belirlenmesi. <img alt="Şekil 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Şekil 3,. Sıçan lösemi hücrelerinin Glycosphingolipidomics C. Örnek MALDI kütle spektrumu;. Her biri belirli bir iyon glycosphingolipid yapısını temsil eder, yapısal izomerler olarak ayırt edilemez B. NB-DGJ, glycosphingolipid sentez, s inhibe eden bir ilaç.ignificantly RBL hücrelerinde üretilen tüm Glikosifingolipidler azaltır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Şekil 4. Glikosifingolipidler izomerlerinin Tandem Kütle Spektrometresi. Permethylated GSLs Gb 3 Cer ve IGB 3 Cer pozitif mod iyon tuzağı kütle spektrometresi A. Karakteristik ayrışma yolları. Gb 3 ve IGB 3 açıkça onların parçalanması desenleri ile ayrılır. Bağlantı farklılıklar izobarik m / z 445 öncüleri ile tutarlı MS 4 ürün iyonları yansıtılır. B. IGB3 arası Örnek sonuçlar iGb3/Gb3 izomerden oluşan bir karışım olarak ölçülebilir. Yıldız yalnızca iGb3 için tanısal iyonlar göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">buraya tıklayın için</a>büyük bir rakam görmek. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Şekil 5,. İyon kapanı MS Glikosifingolipidler izomerlerinin analiz sağlar. A. Standart iGb3 ve iyon tuzağı LTQ kütle spektrometresi parçalanma 4 tur sonra parçalanma profili GB3 farklılık göstermektedir. IGb3 veya GB3. C. türetilen iyonların B. Karakteristik MS 4. profili Trihexosyleramides iyon tuzağı MS yöntemiyle (Dapeng Zhou tarafından Şekil) tarafından tespit edilebilir iGb3 ve GB3 izomerleri karışımları vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Bağışıklık, organlar ve hücreler içinde glycosphingolipid antijenlerin ekspresyonu profili içgörü kazanmak için bir spesifik ve duyarlı bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, kimyasal olarak sentezlenmiş bir standartlarına göre yapısal analizi için glycosphingolipid moleküllerinin adım adım parçalanma sağlayan iyon tuzak kütle spektrometri avantajına sahiptir.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Glikosfingolipidler (GSL'ler), önemli biyolojik süreçler için yapısal bilgiler taşıyan glikokonjugat biyomakromolekül sınıfına aittir...

Bu prosedürün genel amacı, bağışıklık organlarında ve hücrelerinde gliko parmak lipid antijenlerinin ekspresyon profiline dair bilgi edinmek için spesifik ve hassas bir yöntem oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle hücrelerden gliko parmak lipidlerinin ekstrakte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise nötral gliko parmak lipidlerinin asidik gliko parmak lipidlerinden ayrıştırılmasıdır.Fosfolipidler nötr lipidlerden uzaklaştırıldıktan sonra, ekstrakte edilen glikolipidler, heksozların tüm hidroksil gruplarının metoksi gruplarıyla değiştirildiği bir permilmetilasyon reaksiyonu kullanılarak kimyasal olarak modifiye edilir. Nihayetinde, ekstrakte edilen glikolipidler; matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu, uçuş süresi kütle spektrometrisi (kısaca MALDI-TOF MS) ve iyon tuzağı kütle spektrometrisi kullanılarak analiz edilir. Bu tekniğin analitik HPLC ve antikor boyama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kütle spektrometrisinin daha hassas olması ve molekül kütlelerini doğru şekilde ölçmesidir.Bu yöntem, glikolipit antijenlerinin düşük bolluğunun ölçülmesi gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Birçok glikolipit antijeninin GD two ve global H gibi kanser biyobelirteçleri olarak eksprese edilmesi nedeniyle, bu tekniğin etkileri kanser tedavisine veya tanısına kadar uzanmaktadır. Profesör DA pen Zoe'nin laboratuvarından bir lisans öğrencisi olarak prosedürü uygulamalı olarak göstereceğim.Dr. David Hawk, bu prosedüre başlamadan önce kütle spektrometresi cihazları üzerinde işlemler gerçekleştirecektir. Hemositometre ile hücreleri sayarak sıçan bazofil lösemi hücrelerini hazırlayın. Trypan blue boyamasından sonra, hücre canlılığı %95'ten yüksek olmalıdır. Hücrelere önce bir bir hacim oranında kloroform metanolün altı mililitresini ekleyerek lipidleri ekstre edin.Karışık polariteli çözücü ile bir ila iki saat boyunca kapsamlı sonikasyon uygulayın. Final ekstraksiyonu olarak, yazılı prosedürde açıklandığı şekilde hazırlanan 55 ila 25 ila 20 hacim oranındaki izopropanol heksan su ile bu işlemi iki kez tekrarlayın. Altı mililitre kloroform ve metanol ekleyip önceden sonikasyon yapın.Çözünmeyen materyali çöktürmek için sonikasyon işlemini 4,000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjle takip edin. Speed vac cihazında dört saat boyunca kurutmadan önce Senna'yı çekin. Nötral lipidleri asidik lipidlerden ayırmak için küçük bir DEAE-Sephadex A-20 kolonunda anyon değişim kromatografisi kullanın.Bu videoya eşlik eden yazılı prosedürde açıklandığı şekilde DEAE SEDEX A 25 hazırlandıktan sonra, cam duvar ve dokuz inçlik bir pasta pipeti kullanarak kolonu hazırlayın. Reçine tozunun kolondan geçmemesi için cam duvarı dikkatlice paketleyin. Kolonun kurumasına izin vermeden, DEAE sedex A 25 reçinesini dokuz inçlik past air pipetinin boyun kısmına ekleyin.Tüpte reçine kalmadığından emin olun. Lipidleri 30:60:8 hacimsel oranında kloroform, metanol ve suda çözüp sonikasyonla yeniden süspande edin ve çözünmüş örnekleri kolona uygulayın. Nötr lipidler kolon boyunca akıp giderken, yüklü lipidler kolonda kalacaktır; asidik lipid fraksiyonunu 8 mL metanol içinde sodyum asetat ile elüe edin.Burada, sodyum asetat ile işlendikten sonra kurutulmuş negatif yüklü fraksiyon gösterilmektedir. Diyaliz sonrası, slayt Eliza diyaliz kaseti kullanarak diyaliz yoluyla fraksiyonlardaki tuzları giderin. Lipidlerin yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi veya H-P-T-L-C kullanılarak yapılacak ön analizinden önce fraksiyonları speed vac ile kurutun. H-P-T-L-C gerçekleştirmek için, izole edilen nötr glikosphingolipidleri veya gsl'leri 200 µL hacimsel olarak bir bir oranındaki kloroform metanol çözücüsünde çözün.Örneği silika jel ince tabaka kromatografi plakasına yükleyin. Plakayı kuruttuktan sonra, 60'a 35'e 8 hacimsel oranında kloroform, metanol ve su karışımı ile yürütün. Glikofinger lipidlerini, asidik lipidler veya gangliozitler için 300 °C'de arsenik sülfürik asit ile görüntüleyin.Çözücü olarak 55:25:20 hacim oranında izopropanol, heksan ve su karışımı kullanın ve H-P-T-L-C işlemini aynı şekilde gerçekleştirin. Bu aşamada, nötral fraksiyon sadece nötral glikofinger lipidlerini değil, aynı zamanda asetilasyon ve para asetilasyon reaksiyonu ile uzaklaştırılması gereken fosfolipidleri de içerir. Öncelikle, DEAE sedex A 25 geçiş fraksiyonunu soğutmalı speed VAC cihazında dört saat boyunca kurutun.Numuneler kuruduktan sonra, onları tekrar speed vac cihazına yerleştirin ve dört saat daha kurutun. Herhangi bir su kalıntısı para asetilasyon reaksiyonunu engelleyeceğinden, bu numunelerin tamamen kuru olduğundan emin olun. 200 µg'ye kadar glikofosfolipidlerin para asetilasyon reaksiyonu için numunelere 1 mL PERINE ve 0,5 mL asetik anhidrit ekleyip, karanlıkta 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.GSL'lerin daha iyi olduğu bir sıcaklıkta, tamamen buharlaşmayı sağlamak için bir mililitre toluen ekleyin ve ayrıştırılmış materyali speed vac ile üç saat boyunca kurutun. Örnekler hala tamamen kurumamışsa, kuruyana kadar speed VAC uygulayın; burada kurutulmuş parasetik örnek gösterilmektedir. Bu sırada, önce floris seal boncuklarını 110 degrees Celsius'lik bir fırında inkübe ederek tamamen kurutup bir Floris seal kolonu hazırlayın.Ardından, boncukları pasta pipetinin boyun kısmına kadar doldurarak ve 1:2 dikloroetan:hekzan hacimsel oranında dengeleyerek cam yünü ile pasta pipetinde kolonu hazırlayın. Hücre kolonundan elüsyon çok hızlı gerçekleşir. Solventlerin yüksek uçuculuğu kolonun kurumasına neden olabilir. Bu nedenle, kolon çalıştırılmadan önce tüm solvent karışımları hazırlanmalıdır.Elüsyon sırasında kolonu durdurmak mümkün olmadığından, yüzde numuneyi bir mililitre miktarında, dört bir hacim oranındaki 1,2-dikloroetan-hekzan karışımına uygulayın. Kolonu altı mililitre aynı çözücü ile yıkayın ve ardından 10 mililitre 1,2-dikloroetan ile elüye edin.Nötr peraset GSL, bir iki diklorin asetonun bir bir hacimsel oranındaki altı mililitresi ile karıştırılır. Bu adım, peraset glikosfingolipidler florol kolona bağlanırken peraset fosfolipidlerin bağlanmaması nedeniyle peraset fosfolipidleri glikosfingolipidlerden uzaklaştırır. Fraksiyonlar speed vac ile iki saat boyunca kurutulduktan sonra, oda sıcaklığında üç saat boyunca iki mililitre 0,5 molar sodyum metoksit ve iki mililitre metanol ile desasetile edilir.İnkübasyonun ardından karışımı üç mililitre metanol ve asetik asit ile nötralize edin ve speedvac ile kurutun; kurutulmuş ürünleri üç mililitre su içerisinde çözerek bir slide Eliza diyaliz kasetine enjekte edin ve ardından suyu en az iki kez değiştirerek 24 saat boyunca suya karşı diyaliz yapın. Permetilasyon için diyalize edilmiş GSL'yi örnekler tamamen kuruyana kadar speedvac ile kurutun. İlk olarak, herhangi bir özel kurutma koşulu veya inert gaz atmosferi kullanmadan, kimyasal çeker ocak içerisinde GSL'yi vidalı kapaklı ve Teflon astarlı bir cam tüpe 150 µL dimetil sülfoksit ile birlikte aktarın. Sodyum hidroksit partiküllerini bir havan ve havan eli yardımıyla ezerek toz sodyum hidroksit hazırlayın. Ardından, sodyum hidroksit tozunu bir spatula ile örnek çözeltisine ekleyin.Ardından, 100 µL'lik bir Hamilton şırıngası ile 80 µL IO metan ekleyin. Metilasyon reaksiyonu iki mL su ile söndürüldükten sonra, karışımı oda sıcaklığında bir saat boyunca çalkalayın; iki mL diklormetan ekleyerek perm-metillenmiş ürünleri ekstrakte edin. Glikolipidler, alt faz olan diklormetan fazında bulunur, bu nedenle üst faz yeni bir cam tüpe aktarılabilir.Permetillenmiş ürünler, toplam üç ekstraksiyon olacak şekilde diklorometan ile tekrar ekstrakte edilebilir. Birleştirilen diklorometan ekstraktlarını, her yıkama sonrası üstteki sulu fazı dökerek iki mililitre su ile üç kez yıkayın; son yıkamanın ardından örnekleri yeni bir tüpe aktarın ve kurutun. Speedvac kullanılarak örnekler, yazılı prosedürde açıklanan şekilde gerçekleştirilen kütle spektrometrisi analizi için 100 ila 200 µL metanol içinde çözülebilir. Örnekler, Texas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi proteomik tesisine gönderilmiş ve hem MALDI to MS MS kütle spektrometresi hem de bir iyon tuzağı LTQ kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir.Burada, gliko parmak lipid antijenlerini NKT hücrelerine sunan bir antijen sunan hücre tipi olan sıçan lösemi hücre hattı RBL'den alınan gliko parmak lipidlerinin MALDI MS analizine bir örnek gösterilmiştir. İyonlar, gliko parmak lipid sentezini inhibe eden ilaçla tedavi edilen RBL hücrelerindeki spesifik gliko parmak lipid yapılarına atanabilir. Tüm gliko parmak lipidlerinde belirgin bir azalma gözlemlenmiştir.Yapısal izomerler birbirinden ayırt edilemez. Uygulanan biosystems 4, 700 cihazının msms kapasitesi, MS bir iyonlarının MS iki fragmanlarına parçalanmasına olanak tanıyarak sınırlı düzeyde yapısal bilgi üretilmesini sağlar. Ancak, MS iki analizi oligosakkarit izomerlerini ayırt etmek için sıklıkla yetersiz kalırken, gliko parmak lipidlerin iyon tuzağı MS analizi, bu tür izomerlerin saptanması için oligosakkarit izomerlerinin incelenmesine imkan tanır.Standart IGB three ve GB three, bu karakteristikte gösterildiği üzere farklar bulunana kadar birden fazla fragmantasyon döngüsüyle analiz edildi. IGB three ve GB three farklı oranlarda karıştırıldığında, IGB three veya GB three'ten türetilen iyonların MS four profili ortaya çıkar; her bir izomerden türetilen karakteristik iyonların iyon bolluğuna dayanarak bir standart eğri oluşturulabilir. Burada sunulan örnekte, standartlarla karşılaştırma yapılarak IGB three ve GB three ayırt edilebilmiştir.Bu spektrum, 1 3 2 5'in MS dört analizini temsil etmektedir; moleküler demir GB üç'ün IMR'lerini temsil eder ve IGB üç için karakteristik iyonlar ile GB üç için karakteristik iyonlar bulunmuştur, bu da iki izomerin bir karışımının mevcut olduğunu göstermektedir. IGB üç'ün GB üç'e oranı, bir standart eğri ile karşılaştırılarak hesaplanmıştır. Bu prosedür uygulanırken, glikolipidlerin pro metilasyonu öncesinde kromatografi sırasında glikolipidlerin tamamen geri kazanılması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Saflaştırma sırasında en az 80 µg glikolipid geri kazanıldığından emin olun. Bu videoyu izledikten sonra, yarı nicel bir kütle spektrometrisi yöntemiyle glikolipidlerin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olacaksınız. Glikolipid ekstraksiyonu, nötral ve asidik fraksiyonlara ayırma, perm metilasyon reaksiyonu ile modifikasyon ve modifiye edilmiş glikolipidlerin kütle spektrometrisi tesisine gönderilmesi gibi temel adımlarda uzmanlaşacaksınız.1,2-dikloroetan, kloroform, kloroasetik asit ve iyodometan ile çalışmanın son derece tehlikeli ve kanserojen olabileceğini unutmayın; bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi önlemler alınmalıdır. Kurallara uyun ve keşfinizin tadını çıkarın.

mass-spectrometric-analysis-of-glycosphingolipid-antigens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

SDS-PAGE ile takip glikoproteinler şekerler kaldırmak için belirli glycosidases kullanarak protein örnekleri üzerinde glukanıdır değişiklikler tespit etmek için değerli bir yöntemdir ve ilk Glikobiyoloji çalışmaları için iyi bir seçimdir. Deglycosylation aşağıdaki değişiklikler, jel hareketlilik vardiya olarak veya glukanıdır duyarlı reaktifler boyama ile tespit edilebilir.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

O-bağlı glikanların çeşitliliğini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, permetilasyon ve hızlı bir faz bölme yöntemi ile birlikte jel içi indirgeyici β-eliminasyon için yeni bir prosedür, SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinlerden doğrudan salınan O-bağlı glikanların analizine uygulanır ve kütle spektrometresi ile müteakip glikomik analize uygundur.

Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Bu makale, GC-MS tarafından tespit edilmek üzere glikanların bileşen bağlarına özgü monosakkaritlere kimyasal olarak parçalanması yoluyla fraksiyonlanmamış biyoakışkanlardaki glikanların havuzlanmış bileşim profilini analiz etmek için tasarlanmış yeni bir aşağıdan yukarıya glikomik tekniğinin geliştirilmiş bir biçimini sunmaktadır. Potansiyel uygulamalar arasında kanser ve diğer glikan-afektif bozuklukların erken tespiti yer alır.

Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

Bu kağıt, ECM protein bileşiminin (1) analizi, glikozilasyon yerleri (2) tespit edilmesi ve glıkan formlarının (3) yapısal karakterizasyon için sağlar, MS analizi için kardiyovasküler doku örnekleri hazırlamak için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji, diğer dokularda ECM'nin çalışma, minör modifikasyonlarla, uygulanabilir.

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Bu protokol, kanserlerin glikobiyolojisini daha iyi anlamak için gerekli olan karmaşık tümör mikro ortamlarındaki heterojen glikoproteom hakkında kapsamlı bilgiler sunan entegre bir omik teknolojisi olan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini detaylandırır.

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Burada, müsinlerden O-glikanların salınması ve ardından MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak tuzdan arındırma, permetilasyon ve analiz için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi Kullanılarak Permetillenmiş Müsin O-glikanlarının Profillenmesi

Mikroglial hücrelerden saflaştırılmış mitokondrinin hazırlanması, N-glikan salınımı için mitokondriyal proteinlerin izolasyonu ve yüksek çözünürlüklü doğru kütle analizörü kütle spektrometresine bağlı kızılötesi matris destekli lazer desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu kullanılarak hücre altı, mitokondriyal glikanların hızlı tespiti için bir protokol geliştirilmiştir.

Glikan Analizi için Microglia'dan Mitokondriyal Hazırlık

Bu protokol, kütle spektrometrisi görüntüleme kullanılarak hem glikojen hem de N-bağlantılı glikanların titiz ve tekrarlanabilir ölçümünü mümkün kılan temel adımları detaylandırır.

Glycome'in Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Mekânsal Moleküler Görüntülemesi

Öğrenin, glikosfingolipid antijenlerinin kütle spektrometrisi ile hassas analiz yöntemini. Rat bazofil lösemi hücrelerinden ekstraksiyon, iyon tuzağı MS ve MALDI-TOF MS teknikleriyle immünolojik araştırmalar için uygulanır.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Daha fazla video keşfet