Name: Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Keşfedin glikomik kılavuzluğunda glikoproteomik yöntemiyle tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini çıkarma tekniğini. Bu yöntem kanser glikobiyolojisi araştırmalarında derin ve doğru bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Kolorektal Kanser Dokularının Glikomikler Kılavuzluğunda Glikoproteomik Kullanılarak Profillenmesi

Protein glikozilasyonu, filogenetik yaşam ağacı 1,2,3 boyunca türler tarafından üretilen proteinlerin yaygın ve karmaşık bir ko- ve translasyon sonrası modifikasyon türüdür. Proteine bağlı glikanların, hücresel etkileşimlerin ve iletişim olaylarının aracılığı ve düzenlenmesi dahil olmak üzere insan sağlığı için önemli olan çok çeşitli biyolojik süreçleri etkilediği bilinmektedir 4,5. Anormal protein glikozilasyonunun malign transformasyonun, tümör ilerlemesinin ve yayılmasının bir nedeni olduğu düşünülmektedir 6,7,8. Bu, glikanları tümör mikroçevresindeki (TME) önemli tümörjenik süreçlerde ima eder ve glikan bazlı biyobelirteçlerin ve terapötik uygulamaların keşfi için önemli ve büyük ölçüde kullanılmayan bir potansiyel sunar. Bu nedenle glikobiyoloji, kanser araştırmalarında ve yaşam bilimlerinde giderek daha fazla ilgi görmektedir9.
Son on yılda glikoanalitik ve bilişimdeki önemli gelişmelerden güç alan 10,11,12,13,14,15,16,17, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) güdümlü glikomikler ve glikoproteomikler, karmaşık karışımlarından serbest bırakılan glikanların ve bozulmamış glikopeptitlerin sistem genelinde profillenmesi için güçlü araçlar olarak kurulmuştur. çeşitli kanser hastası örnekleri (örneğin, tümör dokuları, hücre popülasyonları, vücut sıvıları) gibi biyolojik numune kökenlerinden doğrudan ekstrakte edilen glikoproteinler3,13,18,19,20.
Glisimik, hücreler, dokular ve hatta tüm organizmalar tarafından dinamik olarak üretilen glikan repertuarının (glycome) yapısı ve miktarı hakkında bilgi sağlar. Öte yandan, glikoproteomik, protein taşıyıcıları ve bunların glikozilasyon bölge(ler)i, bölge doluluk oranları (makro-heterojenlik), bölgeye özgü glikan bileşimleri ve bunların bölge dağılım modeli (mikro-heterojenlik) hakkında sınırlı glikan yapısal bilgisi ile (genellikle glikan bileşimi ile sınırlıdır) nicel bilgi sağlar15,16,21. Bu nedenle, glikomikler ve glikoproteomikler, glikoproteom22'nin biyokimyasal ayrıntılarını araştırmak için tamamlayıcı yaklaşımlardır.
Glikomikler ve glikoproteomikler için sayısız metodolojik tasarım ve analitik strateji geliştirilmiş ve ilgilenilen glikoanalite (örneğin, N- / O- / C-bağlı, glikan / glikopeptid / glikoprotein, etiketli / etiketsiz), numunenin doğasına (örneğin, hücreler, dokular, vücut sıvıları), miktarına (nanogram / mikrogram / miligram protein seviyeleri) ve mevcut analitik cihaza bağlı olarak laboratuvarlar arasında uygulanmıştır23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Paralel kullanımlarının bilinen faydalarına rağmen, glikomikler ve glikoproteomikler yaygın olarak birlikte uygulanmaz, daha ziyade analitik uzmanlık ve özel enstrümantasyon için yüksek talepleri nedeniyle glikobiyolojik ve kanser araştırma çalışmalarında bağımsız yaklaşımlar olarak uygulanır.
Bu teknoloji boşluğunu kabul ederek, on yıldan fazla bir süre önce, karmaşık biyolojik örneklerden elde edilen glikomik ve glikoproteomik verileri entegre edebilen glikomik destekli glikoproteomik yöntemi tanıttık33. Kısacası, glikomik destekli (veya bu protokolde olduğu gibi glikomik kılavuzlu) glikoproteomik teknolojisi, N- ve/veya O-glikanları, yerleşik bir gözenekli grafitleştirilmiş karbon (PGC) LC-MS/MS yöntemi34,35 aracılığıyla profillendirir ve daha sonra glikan arama alanının sınırlarını tanımlayarak aynı numune(ler)den elde edilen bozulmamış N- ve/veya O-glikopeptid verilerinin analizi için kullanılır36. PGC-LC-MS/MS, yüksek hassasiyet ve yapısal çözünürlükle glisit hakkında kantitatif bilgi sağladığı, karmaşık karışımlar içinde bile glikanların topolojisi (monosakkarit dizisi ve dallanma modeli) ve glikosidik bağları hakkında bilgi verdiği için özellikle güçlü bir glikomik yöntemdir 35,37,38. Glikoproteomik iş akışı, peptit üretimi, isteğe bağlı peptit etiketleme, çoğullama ve ön fraksiyonlamanın yanı sıra, analitik tanımlaması için kademeli çarpışma enerjisi/daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (sceHCD, N-glikopeptidler için) ve elektron transferi/yüksek enerjili çarpışma ayrışması (EThcD, O-glikopeptidler için) dahil olmak üzere farklı parçalanma yöntemlerini ideal olarak kullanan ters fazlı LC-MS/MS analizinden önce zenginleştirmeyi içerir. N-glikoproteom analizi için, paralel de-N-glikoproteomikler, protein/peptit arama alanını tanımlayarak ve işgal edilen N-glikosilasyon bölgeleri ve bunların site doluluk oranları hakkında daha fazla ayrıntı sağlayarak bozulmamış N-glikopeptid veri analizine rehberlik edebilirken, modifiye edilmemiş peptitlerin paralel analizi, incelenen koşullar arasındaki herhangi bir protein seviyesi değişikliğini ortaya çıkarır.
Bu makale, glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntem için ayrıntılı ve takip etmesi kolay bir adım adım protokol sağlar (iş akışına genel bakış için Şekil 1'e bakın). Protokol, numune hazırlama adımlarının ve LC-MS/MS tabanlı glikomikler ve glikoproteomik deneylerin deneysel ayrıntılarını sağlar ve yöntemin kolorektal kanser (CRC) hastalarından rezeke edilen tümörlerin formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku kesitlerine uygulanmasını gösteren temsili sonuçlar sunarak, dünyanın dört bir yanındaki kanser biyobankalarında arşivlenen değerli bir numune türünde TME'nin glikobiyolojisi hakkında bilgi sahibi olmalarını sağlar. Glikomik ve glikoproteomik verilerin analizi ve entegrasyonu da kısaca tartışılmaktadır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg"> 
Şekil 1: Glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemine genel bakış. Genel bakış, glikomik (solda) ve glikoproteomik (sağda) iş akışlarındaki ayrıntılı deneysel adımları, elde edilen bilgilere genel bir bakış (kalın) ve iki yaklaşımın gelişmiş veri analizi ve yorumlama yoluyla nasıl entegre edildiğini gösterir. Ekle: (i) glisikmik ve (ii-iii) glikoproteomik iş akışları için kullanılan ev yapımı SPE mikro kolonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td><güçlü > Kimyasallar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Amonyum asetat & nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat, saflık ve ge; %99.0</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>Susuz asetonitril (ACN), LC-MS sınıfı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Sığır fetuin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Formik asit, LC-MS sınıfı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>İyodoasetamid (IAA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>Peptit-N-glikosidaz F (PNGase F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/&mu; L) Escherichia coli'de rekombinant olarak eksprese edilir&nbsp;</td></tr><tr><td>Polivinilpirolidon 40 (PVP)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>484016</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Sıralama dereceli domuz tripsin ve nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>Sodyum borhidrür (NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Trietilamonyum bikarbonat (TEAB), LC-MS sınıfı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit (TFA), LC-MS sınıfı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td><güçlü>Araçlar/Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 diskler</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>C8 diskler</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>Düz tabanlı polipropilen 96 oyuklu plaka&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3364</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ poliviniliden diflorür (PVDF) membran</td><td>Millipore IPVH20200</td><td></td><td>Gözenek boyutu: 0.45 &mu; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj adaptörleri&nbsp;</td><td>Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td><td>MiniSpin Sütun Bileziği, Microspin Sütunları</td></tr><tr><td>Oligo R3 reçine</td><td>Thermo</td><td>1133903</td><td>ile birlikte gelir Parçacık boyutu 30 & mu; m</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tüpleri 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tüpleri 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli kilitli tüpler 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli kilitli tüpler 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>Eppendorf</td><td>5382000066</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Tek delikli zımba</td><td>Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac yoğunlaştırıcı</td><td>Martin Christ</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Alternatifler mevcuttur</td></tr><tr><td>Supelclean ENVI-Carb SPE reçine</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>Parçacık boyutu 120-400 ağ. Reçine kartuşlardan manuel olarak çıkarılabilir ve MilliQ su Şırıngasında %50 (h/h) metanol içinde uzun süreli saklanabilir</td></tr><tr><td>Şırınga 5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z116866</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü inkübatör</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>Ultrasonik banyo</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>Alternatifler mevcut</td></tr><tr><td>ZIC-HILIC reçine</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>Parçacık/gözenek boyutu, 5 &mu; m/200 &aring;. Reçine, LC kolonundan manuel olarak ekstrakte edilebilir ve MilliQ suyunda %50 (h/h) metanol içinde uzun süreli olarak saklanabilir</td></tr><tr><td>ZipTip C18 katı faz ekstraksiyonu (SPE) mikro kolonları&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>Alternatif olarak, ev yapımı C18-SPE mikro kolonları ticari ürünün yerini alabilir</td></tr><tr><td><güçlü>LC-MS/MS Analizi< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity Kılcal HPLC sistemi&nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td>Alternatifleri mevcuttur</td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 AQ reçinesi ile önceden paketlenmiş Analitik LC kolonu</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Almanya</td><td>r13.aq.s2570</td><td>Parçacık/gözenek boyutu: 3 &mu; m/120 &Aring;, uzunluk/iç çap: 25 cm/75 &mu;m. Ticari C18 nano-LC kolonlar da mevcuttur/&nbsp;</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC Sistemi&nbsp;</td><td>Termo</td><td></td><td>Alternatifler mevcuttur</td></tr>: <tr><td>HyperCarb, KAPPA, PGC, kılcal LC kolonu&nbsp;</td><td>Termo Üretimi Durdurulan</td><td></td><td>Parçacık/gözenek boyutu, 3 &mu; m/250 &aring;; sütun uzunluğu, 30 mm; iç çap, 0.180 mm. Benzer kalitede veriler üreten HyperCarb PGC-LC kolonlarının daha büyük geometrileri ticari olarak temin edilebilir (örneğin, Thermo # 35003-031030). Merck'ten parçacık/gözenek boyutuna sahip SupelTMCarb LC kolonu, 2,7 & m/200 ve farklı kolon uzunlukları ve iç çapları da mevcuttur (örneğin, Merck #59994-U).&nbsp;</td></tr><tr><td>LCMS dereceli asetonitril</td><td>LiChrosolv</td><td>100029</td><td>Mevcut alternatifler</td></tr><tr><td>Doğrusal tuzak dört kutuplu (LTQ) Velos Pro iyon tuzağı kütle spektrometresi (glikomik)&nbsp;</td><td>Termo</td><td></td><td>Alternatifler mevcuttur</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Kütle Spektrometresi (glikoproteomik)</td><td>Thermo</td><td></td><td>ETD'li veya ETD'siz diğer yüksek çözünürlüklü MS sistemleri (yalnızca O-glikoproteomik için gereklidir) de mevcuttur (örneğin, Q-Exactive HF-X Hibrit Dört Kutuplu-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker veya diğer satıcılardan benzer yüksek performanslı kütle spektrometreleri)</td></tr><tr><td>Total Recovery Clear Glass vidalı şişeler 0,9 mL</td><td>Termo</td><td>THC11093563</td><td>Alternatifler mevcuttur</td></tr><tr><td>Toplam Geri Kazanım Şeffaf Cam vidalı şişeler eşleşen kapaklar</td><td>Termo</td><td>THC09150869</td><td>Alternatifler mevcuttur</td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 AQ reçinesi ile şirket içinde paketlenmiş tuzak LC kolu&nbsp;</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Almanya</td><td>r15.aq.s0202</td><td>Parçacık/gözenek boyutu: 5 &mu; m/120 &Aring;, uzunluk/iç çap: 2 cm/100 &mu;m. Ticari C18 tuzak LC sütunları da mevcuttur.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v2.6.46 veya üstü</td><td>Çoğu MS satıcısından LC-MS/MS ham verilerini kabul eden ticari glikopeptid ve PTM arama motoru</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v3.9-7 veya üstü</td><td>Glikopeptid adaylarının manuel olarak incelenmesi ve glikan MS/MS spektrumlarının otomatik açıklaması için ticari yazılım</td></tr><tr><td>GlycoMod</td><td>Expasy</td><td></td><td>Açık erişim yazılımı, glisikik verilerin açıklanmasına yardımcı olur (https://web.expasy.org/glycomod/)</td></tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>Açık erişim yazılımı, glisikik verilerin açıklanmasına ve glikan karikatürlerinin çizilmesine yardımcı olur</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>Açık erişimli yazılım, ham spektral verilerden glikan öncü iyonlarının m/z değerini çıkarır</td></tr><tr><td>Ufuk Çizgisi</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2 veya üstü</td><td>Glikanların nispi kantitasyonu için açık erişimli yazılım</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2 veya üstü</td><td>Ham LC-MS/MS verilerine göz atmak için</td></tr></tbody></table>

glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Evre II'de KRK'den muzdarip bir hastadan alınan bir FFPE doku slaytına uygulanan glikomik kılavuzluğunda glikoproteomik yöntemin temsili sonuçları bu bölümde verilmektedir.
Protokol için yeterli protein başlangıç materyali elde etmek için, yayınlanmış bir protokolü takiben aynı FFPE doku bloğundan iki slayttan (z yığınları) protein ekstraktları birleştirildi ve glikoproteomik deneyin duyarlılığını artırmak için bir TMT etiketleme yaklaşımı uygulandı (aşağıdaki isteğe bağlı adımlara bakın)<sup ...

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

Bu nedenle, doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve bağışıklık ile ilgili bozukluklarda kompleks karbonhidratlar veya glikanlar üzerinde çalışıyoruz ve şu anda sepsis ve kansere odaklanıyoruz. Çalışmamız, insan glikoproteininin ayrıntılı karakterizasyonu için glikomik ve glikoproteomik yöntemler dahil olmak üzere analitik yöntemler ve sistem glikobiyolojisini içerir. Glikoproteomik, son on yılda muazzam ilerlemeler yaşadı ve ilerleme artık mevcut yüksek kaliteli kütle spektrometresi verilerinin eksikliği ile sınırlı değil.Aksine, zorluk, spektral verilerden biyolojik bilgiyi yorumlamak ve üretmektir. Glikomik güdümlü glikoproteomik yöntemi, gliko bilim adamlarının glikoproteom ve insan sağlığı indeksleri ile sert engeller hakkında derin ve doğru bilgiler elde etmelerini sağlar, Glycoproteomics, glikoproteom hakkında bölgeye özgü içgörüler üretme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir. Ancak glikopeptid oranları yüksek kalır.Bu tekrarlanabilirlik sorunlarının üstesinden gelmek için, glisikik glikoproteomik yöntemimiz, aynı numunenin glikomik araştırması yoluyla glikan arama alanındaki kısıtlamaları tanımlayarak hassas glikoproteom profili oluşturmayı mümkün kılar. Sonuç olarak, daha hızlı ve daha doğru glikopeptit aramaları sağlar. Glikomik güdümlü glikoproteomik yöntemimiz, çeşitli farklı insan örneklerinden glikoproteom indekslerinin heterojenliğinin ve dinamiklerinin kapsamlı bir haritalanmasına olanak tanır.Bu nedenle bu yöntem, hastalığın ilerlemesini daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir ve ayrıca çok çeşitli insan hastalıklarına karşı terapötik hedefler için yeni tanısal biyobelirteçler bulmamıza yardımcı olabilir. Glikomik güdümlü glikoproteomik yöntem, insan glikoproteomunun karmaşıklığını deşifre etmemize olanak tanır ve bu da glikan yapılarının protein fonksiyonunu, hücre iletişimini veya bağışıklık tepkilerini nasıl etkilediği gibi yeni biyolojik soruları açar. Ayrıca, bazı hastalıklarda glikozilasyon modelinin nasıl ve neden değiştiğine dair soruları da gündeme getiriyor.Ve bu içgörüler, karmaşık hastalıklarda keşiflere ve yeni tanı belirteçlerine ve kişiselleştirilmiş tedavilere yol açabilir. İlgilenilen proteini bir PVDF membranı üzerinde hareketsiz hale getirmek için, tek delikli bir delik delme kullanarak, tespit edilecek numune sayısına göre zarı kesin. Eksize edilen membranları metanol ile ıslatın, ardından bunları düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.Membranlar kurumaya yakın olduğunda, nokta başına 2,5 mikrolitre protein örneği uygulayın. Membranları 20 ila 25 santigrat derecede en az üç saat veya tercihen gece boyunca havayla kurutun ve kontaminasyonu önlemeye özen gösterin. Benekli zarları içeren her oyuğa metanol içinde 100 mikrolitre% 1 PDP-40 ekleyin.Plakayı PDP-40 solüsyonunda 20 ila 25 santigrat derecede çalkalayın. Beş dakika sonra PDP-40 çözeltisini atın. Daha sonra, tıkalı protein lekelerini içeren her bir kuyuyu 100 mikrolitre ultra saf suyla yıkayın ve plakayı beş dakika çalkalayın.Her kuyucuğa 15 mikrolitre PNGase F çözeltisi ekleyin. Dehidrasyonu önlemek için, çevredeki boş kuyulara su ekleyin. Plakayı şeffaf bir filmle dikkatlice kapatın ve 37 santigrat derecede en az sekiz saat inkübe edin.İnkübasyondan sonra, kuyucukların kenarlarındaki buharlaşmış damlacıkların dibinde toplanmasına yardımcı olmak için plakayı beş dakika boyunca sonikleştirin. Serbest bırakılan N-glikan örneklerini ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Her numuneyi 20 mikrolitre ultra saf su ile iki kez iyice yıkayın, kalan tüm numuneleri aspire edin ve yeni tüplere birleştirin.Daha sonra, 10 mikrolitre 100 milimolar amonyum asetat pH 5 ekleyin ve numuneleri 20 ila 25 santigrat derecede bir saat inkübe edin. N-glikan örneklerini bir vakum yoğunlaştırıcı sisteminde kurutun. Ev yapımı gözenekli grafit karbon veya PGC-C18 katı faz ekstraksiyonu veya SPE mikro sütunları hazırlamak için, C18 disklerini 10 mikrolitrelik pipet uçlarına takıp aktarmak için bir şırınga kullanın.%50 metanol içinde süspanse edilmiş 10 mikrolitrelik PGC reçine bulamacını C18 SPE mikro kolonlarına pipetleyin. Mikro kolonları mikro santrifüj adaptörleri ile 2 mililitrelik tüplere yerleştirin. Yaklaşık 0,5 santimetre kolon yüksekliğine sahip PGC-C18 SPE mikro kolonları oluşturmak için tüpleri döndürün.Daha sonra, asetonitril içinde 50 mikrolitre %0.1 trifloroasetik asit veya TFA'yı mikro sütunlara ekleyin ve mobil fazların mikro sütunlardan geçmesini kolaylaştırmak için 2000 G'de 60 saniye santrifüjleyin. Benzer şekilde, mikro kolonları %0,1 sulu TFA kullanarak üç kez yıkayın ve şartlandırın. N-glikan numunelerini 40 mikrolitreye kadar yükleme hacimlerinde her bir mikro sütuna uygulayın.Her baskıdan sonra mikro sütunu döndürün ve tüm numune yüklenene kadar tekrarlayın. Her mikro sütunu 20 mikrolitre ultra saf suyla yıkayın. Mikro sütunları yeni 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın.N-glikanları elüte etmek için, her bir mikro sütuna %50 asetonitril içinde 40 mikrolitre %0.1 TFA ekleyin. Tüpleri döndürün ve her dönüşten elde edilen elüatı birleştirin. Tuzdan arındırılmış N-glikanları bir vakum yoğunlaştırıcı sisteminde kurutun.Uygun yazılımı kullanarak oluşturulan LC-MS/MS ham verilerine göz atın. Dar LC tepe genişliğini, N-glikan izomerlerinin etkili bir şekilde ayrılmasını, yüksek MS doğruluğunu, çözünürlüğü ve sinyal-gürültü oranını ve yüksek CID MS/MS parçalanma verimliliğini değerlendirerek yüksek veri kalitesini onaylayın. Monoizotopik öncü kütleye, CID MS/MS parçalanma modellerine ve nispi ve mutlak PGC-LC tutma sürelerine dayalı olarak numunedeki N-glikanları manuel olarak tanımlayın.Bağıl N-glikan kantitasyonu için, tanımlanan tüm N-glikan izomerleri için monoizotopik öncü kütle / yük oranını içeren bir geçiş listesi oluşturun. Tüm N-glikan öncü iyonlarının ekstrakte edilen iyon kromatogramlarından eğri değerlerinin altındaki alanı belirleyin. ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonlarını hazırlamak için bir şırınga kullanarak C8 disklerini 10 mikrolitrelik pipet uçlarına takın ve aktarın.Metanol içinde süspanse edilmiş bir ZIC-HILIC reçine bulamacını C8-SPE mikro kolonlarına boşaltın. Mikro kolonları, mikro santrifüj adaptörleri ile 2 mililitrelik tüplere yerleştirin ve kolonların merkezde asılı olduğundan emin olun. Yaklaşık bir santimetre yüksekliğe sahip C8-SPE HPLC mikro sütunları oluşturmak için döndürün.Mikro kolonlara 50 mikrolitre metanol ekleyin ve 2000 G'de 60 saniye santrifüjleyin, böylece mobil fazların kolondan geçmesine izin verin. Benzer şekilde, mikro sütunları her biri 50 mikrolitre ultra saf su ve ardından %80 asetonitril içinde 50 mikrolitre %1 TFA ile üç kez yıkayın. %80 asetonitril içinde 50 mikrolitre %1 TFA'da N-glikopeptid zenginleştirmesi için belirlenmiş kurutulmuş peptit karışımlarını yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın.ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonlarını, mikro santrifüj adaptörleri ile yeni 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin. Yeniden süspanse edilmiş peptit karışımlarını her bir mikro kolona uygulayın ve 60 saniye boyunca 2000 G'de döndürün. Fraksiyonlardan geçen akışı toplayın ve her fraksiyonu aynı ZIC-HILIC-C8-SPE mikro sütununa yeniden uygulayın.Daha sonra N-glikopeptiti 50 mikrolitre 25 milimolar amonyum bikarbonat ve 50 mikrolitre% 50 asetonitril ilavesiyle elüte edin. Mikro sütunları yeni 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı mikro santrifüj tüplerine aktarın. Tutulan N-glikopeptidi sırayla elüte etmek için, mikro sütunlara 50 mikrolitre% 0.1 sulu TFA ekleyin ve 60 saniye boyunca 2000 G'de santrifüjleyin.Daha sonra N-glikopeptidi, 50 mikrolitre% 0.1 sulu TFA, ardından 50 mikrolitre 25 milimolar amonyum bikarbonat ve 50 mikrolitre% 50 asetonitril ilavesiyle elüte edin. Zenginleştirilmiş N-glikopeptidleri ve modifiye edilmemiş peptit akışını bir vakum yoğunlaştırıcı sistemde fraksiyonlardan toplayın, birleştirin ve kurutun. N-glikomik verilerin analizi, kolorektal kanser dokularında %70 kompleks/hibrit glikan, %20 oligomannoz ve %10 paucimannose içeren 76 N-glikan izomeri tanımladı.Tüm N-glikan yapıları, ekstrakte edilen iyon kromatogramlarından elde edilen eğri değerleri altındaki alan kullanılarak nicelleştirilen spektral kanıtlarla doğrulandı.

glycomics-guided-glycoproteomics-facilitates-comprehensive-profiling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Kanser hücresi proteomlarının derinlemesine analizleri, yeni ilaç hedeflerinin ve tanısal biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Sıvı ve katı tümörlerden türetilen kanser hücresi alt popülasyonlarındaki (fosfo-) proteomların kantitatif analizi için deneysel bir iş akışı açıklıyoruz. Bu, hücresel zenginleştirme stratejilerinin kantitatif Super-SILAC tabanlı kütle spektrometresi ile birleştirilmesiyle elde edilir.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

Bu makale, GC-MS tarafından tespit edilmek üzere glikanların bileşen bağlarına özgü monosakkaritlere kimyasal olarak parçalanması yoluyla fraksiyonlanmamış biyoakışkanlardaki glikanların havuzlanmış bileşim profilini analiz etmek için tasarlanmış yeni bir aşağıdan yukarıya glikomik tekniğinin geliştirilmiş bir biçimini sunmaktadır. Potansiyel uygulamalar arasında kanser ve diğer glikan-afektif bozuklukların erken tespiti yer alır.

Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

Bu kağıt, ECM protein bileşiminin (1) analizi, glikozilasyon yerleri (2) tespit edilmesi ve glıkan formlarının (3) yapısal karakterizasyon için sağlar, MS analizi için kardiyovasküler doku örnekleri hazırlamak için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji, diğer dokularda ECM'nin çalışma, minör modifikasyonlarla, uygulanabilir.

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Bu protokol, insan protein glislerinin çevrimiçi kaynaklarla nasıl keşfedileceğini, karşılaştırılacağını ve yorumlanacağını göstermektedir.

Glikan Aracılı Protein Etkileşimlerinin İncelenmesi için Biyoinformatik Kaynakları

Bu protokol, formalin sabit parafine gömülü doku kesitlerinde protein görüntüleme kütle sitometrisi ile multipleks mRNA tespiti için bir metodolojiyi detaylandırır.

Çift modaliteli Moleküler Kartografi: Multipleks mRNA Tespitinin Protein Görüntüleme Kütle Sitometrisi ile Entegre Edilmesi

Bu protokol, tümör anjiyogenezinin nicel proteomik analizi için lazer-yakama mikrodiseksiyonu kullanarak glioma örneklerinden yeterli yüksek kaliteli neovasküler doku hazırlamış, geleneksel olarak anjiyojenik faktörlere odaklanan çalışmaların sınırlamalarını aşmış ve glioma anjiyogenezinin geniş ölçekli proteomik profilini sağlamıştır.

İnsan Glioma Dokularından Neovasküler Dokuların Tümör Anjiyogenezinin Nicel Proteomik Analizi İçin Hazırlanması

Keşfedin glikomik kılavuzluğunda glikoproteomik yöntemiyle tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini çıkarma tekniğini. Bu yöntem kanser glikobiyolojisi araştırmalarında derin ve doğru bilgiler sağlar.

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır

Daha fazla video keşfet