Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır

Bu nedenle, doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve bağışıklık ile ilgili bozukluklarda kompleks karbonhidratlar veya glikanlar üzerinde çalışıyoruz ve şu anda sepsis ve kansere odaklanıyoruz. Çalışmamız, insan glikoproteininin ayrıntılı karakterizasyonu için glikomik ve glikoproteomik yöntemler dahil olmak üzere analitik yöntemler ve sistem glikobiyolojisini içerir. Glikoproteomik, son on yılda muazzam ilerlemeler yaşadı ve ilerleme artık mevcut yüksek kaliteli kütle spektrometresi verilerinin eksikliği ile sınırlı değil.

Aksine, zorluk, spektral verilerden biyolojik bilgiyi yorumlamak ve üretmektir. Glikomik güdümlü glikoproteomik yöntemi, gliko bilim adamlarının glikoproteom ve insan sağlığı indeksleri ile sert engeller hakkında derin ve doğru bilgiler elde etmelerini sağlar, Glycoproteomics, glikoproteom hakkında bölgeye özgü içgörüler üretme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir. Ancak glikopeptid oranları yüksek kalır.

Bu tekrarlanabilirlik sorunlarının üstesinden gelmek için, glisikik glikoproteomik yöntemimiz, aynı numunenin glikomik araştırması yoluyla glikan arama alanındaki kısıtlamaları tanımlayarak hassas glikoproteom profili oluşturmayı mümkün kılar. Sonuç olarak, daha hızlı ve daha doğru glikopeptit aramaları sağlar. Glikomik güdümlü glikoproteomik yöntemimiz, çeşitli farklı insan örneklerinden glikoproteom indekslerinin heterojenliğinin ve dinamiklerinin kapsamlı bir haritalanmasına olanak tanır.

Bu nedenle bu yöntem, hastalığın ilerlemesini daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir ve ayrıca çok çeşitli insan hastalıklarına karşı terapötik hedefler için yeni tanısal biyobelirteçler bulmamıza yardımcı olabilir. Glikomik güdümlü glikoproteomik yöntem, insan glikoproteomunun karmaşıklığını deşifre etmemize olanak tanır ve bu da glikan yapılarının protein fonksiyonunu, hücre iletişimini veya bağışıklık tepkilerini nasıl etkilediği gibi yeni biyolojik soruları açar. Ayrıca, bazı hastalıklarda glikozilasyon modelinin nasıl ve neden değiştiğine dair soruları da gündeme getiriyor.

Ve bu içgörüler, karmaşık hastalıklarda keşiflere ve yeni tanı belirteçlerine ve kişiselleştirilmiş tedavilere yol açabilir. İlgilenilen proteini bir PVDF membranı üzerinde hareketsiz hale getirmek için, tek delikli bir delik delme kullanarak, tespit edilecek numune sayısına göre zarı kesin. Eksize edilen membranları metanol ile ıslatın, ardından bunları düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.

Membranlar kurumaya yakın olduğunda, nokta başına 2,5 mikrolitre protein örneği uygulayın. Membranları 20 ila 25 santigrat derecede en az üç saat veya tercihen gece boyunca havayla kurutun ve kontaminasyonu önlemeye özen gösterin. Benekli zarları içeren her oyuğa metanol içinde 100 mikrolitre% 1 PDP-40 ekleyin.

Plakayı PDP-40 solüsyonunda 20 ila 25 santigrat derecede çalkalayın. Beş dakika sonra PDP-40 çözeltisini atın. Daha sonra, tıkalı protein lekelerini içeren her bir kuyuyu 100 mikrolitre ultra saf suyla yıkayın ve plakayı beş dakika çalkalayın.

Her kuyucuğa 15 mikrolitre PNGase F çözeltisi ekleyin. Dehidrasyonu önlemek için, çevredeki boş kuyulara su ekleyin. Plakayı şeffaf bir filmle dikkatlice kapatın ve 37 santigrat derecede en az sekiz saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, kuyucukların kenarlarındaki buharlaşmış damlacıkların dibinde toplanmasına yardımcı olmak için plakayı beş dakika boyunca sonikleştirin. Serbest bırakılan N-glikan örneklerini ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Her numuneyi 20 mikrolitre ultra saf su ile iki kez iyice yıkayın, kalan tüm numuneleri aspire edin ve yeni tüplere birleştirin.

Daha sonra, 10 mikrolitre 100 milimolar amonyum asetat pH 5 ekleyin ve numuneleri 20 ila 25 santigrat derecede bir saat inkübe edin. N-glikan örneklerini bir vakum yoğunlaştırıcı sisteminde kurutun. Ev yapımı gözenekli grafit karbon veya PGC-C18 katı faz ekstraksiyonu veya SPE mikro sütunları hazırlamak için, C18 disklerini 10 mikrolitrelik pipet uçlarına takıp aktarmak için bir şırınga kullanın.

%50 metanol içinde süspanse edilmiş 10 mikrolitrelik PGC reçine bulamacını C18 SPE mikro kolonlarına pipetleyin. Mikro kolonları mikro santrifüj adaptörleri ile 2 mililitrelik tüplere yerleştirin. Yaklaşık 0,5 santimetre kolon yüksekliğine sahip PGC-C18 SPE mikro kolonları oluşturmak için tüpleri döndürün.

Daha sonra, asetonitril içinde 50 mikrolitre %0.1 trifloroasetik asit veya TFA'yı mikro sütunlara ekleyin ve mobil fazların mikro sütunlardan geçmesini kolaylaştırmak için 2000 G'de 60 saniye santrifüjleyin. Benzer şekilde, mikro kolonları %0,1 sulu TFA kullanarak üç kez yıkayın ve şartlandırın. N-glikan numunelerini 40 mikrolitreye kadar yükleme hacimlerinde her bir mikro sütuna uygulayın.

Her baskıdan sonra mikro sütunu döndürün ve tüm numune yüklenene kadar tekrarlayın. Her mikro sütunu 20 mikrolitre ultra saf suyla yıkayın. Mikro sütunları yeni 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın.

N-glikanları elüte etmek için, her bir mikro sütuna %50 asetonitril içinde 40 mikrolitre %0.1 TFA ekleyin. Tüpleri döndürün ve her dönüşten elde edilen elüatı birleştirin. Tuzdan arındırılmış N-glikanları bir vakum yoğunlaştırıcı sisteminde kurutun.

Uygun yazılımı kullanarak oluşturulan LC-MS/MS ham verilerine göz atın. Dar LC tepe genişliğini, N-glikan izomerlerinin etkili bir şekilde ayrılmasını, yüksek MS doğruluğunu, çözünürlüğü ve sinyal-gürültü oranını ve yüksek CID MS/MS parçalanma verimliliğini değerlendirerek yüksek veri kalitesini onaylayın. Monoizotopik öncü kütleye, CID MS/MS parçalanma modellerine ve nispi ve mutlak PGC-LC tutma sürelerine dayalı olarak numunedeki N-glikanları manuel olarak tanımlayın.

Bağıl N-glikan kantitasyonu için, tanımlanan tüm N-glikan izomerleri için monoizotopik öncü kütle / yük oranını içeren bir geçiş listesi oluşturun. Tüm N-glikan öncü iyonlarının ekstrakte edilen iyon kromatogramlarından eğri değerlerinin altındaki alanı belirleyin. ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonlarını hazırlamak için bir şırınga kullanarak C8 disklerini 10 mikrolitrelik pipet uçlarına takın ve aktarın.

Metanol içinde süspanse edilmiş bir ZIC-HILIC reçine bulamacını C8-SPE mikro kolonlarına boşaltın. Mikro kolonları, mikro santrifüj adaptörleri ile 2 mililitrelik tüplere yerleştirin ve kolonların merkezde asılı olduğundan emin olun. Yaklaşık bir santimetre yüksekliğe sahip C8-SPE HPLC mikro sütunları oluşturmak için döndürün.

Mikro kolonlara 50 mikrolitre metanol ekleyin ve 2000 G'de 60 saniye santrifüjleyin, böylece mobil fazların kolondan geçmesine izin verin. Benzer şekilde, mikro sütunları her biri 50 mikrolitre ultra saf su ve ardından %80 asetonitril içinde 50 mikrolitre %1 TFA ile üç kez yıkayın. %80 asetonitril içinde 50 mikrolitre %1 TFA'da N-glikopeptid zenginleştirmesi için belirlenmiş kurutulmuş peptit karışımlarını yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın.

ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonlarını, mikro santrifüj adaptörleri ile yeni 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin. Yeniden süspanse edilmiş peptit karışımlarını her bir mikro kolona uygulayın ve 60 saniye boyunca 2000 G'de döndürün. Fraksiyonlardan geçen akışı toplayın ve her fraksiyonu aynı ZIC-HILIC-C8-SPE mikro sütununa yeniden uygulayın.

Daha sonra N-glikopeptiti 50 mikrolitre 25 milimolar amonyum bikarbonat ve 50 mikrolitre% 50 asetonitril ilavesiyle elüte edin. Mikro sütunları yeni 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı mikro santrifüj tüplerine aktarın. Tutulan N-glikopeptidi sırayla elüte etmek için, mikro sütunlara 50 mikrolitre% 0.1 sulu TFA ekleyin ve 60 saniye boyunca 2000 G'de santrifüjleyin.

Daha sonra N-glikopeptidi, 50 mikrolitre% 0.1 sulu TFA, ardından 50 mikrolitre 25 milimolar amonyum bikarbonat ve 50 mikrolitre% 50 asetonitril ilavesiyle elüte edin. Zenginleştirilmiş N-glikopeptidleri ve modifiye edilmemiş peptit akışını bir vakum yoğunlaştırıcı sistemde fraksiyonlardan toplayın, birleştirin ve kurutun. N-glikomik verilerin analizi, kolorektal kanser dokularında %70 kompleks/hibrit glikan, %20 oligomannoz ve %10 paucimannose içeren 76 N-glikan izomeri tanımladı.

Tüm N-glikan yapıları, ekstrakte edilen iyon kromatogramlarından elde edilen eğri değerleri altındaki alan kullanılarak nicelleştirilen spektral kanıtlarla doğrulandı.