Name: Kanser Hücrelerinde Kodlamayan RNAlar Arasındaki Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedeflemek için Çift CRISPR-Girişim Stratejisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Keşfedin melanoma hücrelerinde çift CRISPRi sistemi ile kodlamayan RNA'ları hedefleme yöntemini. Bu yaklaşım, sentetik ölümcül etkileşimleri belirleyerek kanser tedavisinde yeni stratejiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Szcześniak, M. W., Wanowska, E., Mukherjee, N., Ohler, U., Makałowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+deeper+annotation+of+human+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Gene+Regul+Mech%22%5BJournal%5D)">Towards a deeper annotation of human lncRNAs.</a> Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 1863 (4), 194385(2020).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NONCODEV5%3A+a+comprehensive+annotation+database+for+long+non-coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs.</a> Nucl Acids Res. 46 (D1), D308-D314 (2018).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+lncRNAs+contributed+critically+to+human+evolution+by+distinctly+regulating+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human-specific lncRNAs contributed critically to human evolution by distinctly regulating gene expression.</a> eLife. 12, RP89001.2(2023).</li>
<li>Sarropoulos, I., Marin, R., Cardoso-Moreira, M., Kaessmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dynamics+of+lncRNAs+across+mammalian+organs+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental dynamics of lncRNAs across mammalian organs and species.</a> Nature. 571 (7766), 510-514 (2019).</li>
<li>Melé, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genomics.+The+human+transcriptome+across+tissues+and+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals.</a> Science. 348 (6235), 660-665 (2015).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Liu, S. J., Dang, H. X., Lim, D. A., Feng, F. Y., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs in cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 21 (7), 446-460 (2021).</li>
<li>Ahmad, M., Weiswald, L. B., Poulain, L., Denoyelle, C., Meryet-Figuiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+lncRNAs+in+cancer+cells+migration%2C+invasion+and+metastasis%3A+cytoskeleton+and+ECM+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of lncRNAs in cancer cells migration, invasion and metastasis: cytoskeleton and ECM crosstalk.</a> J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 173(2023).</li>
<li>Jain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncPRESS1+Is+a+p53-Regulated+LncRNA+that+Safeguards+Pluripotency+by+Disrupting+SIRT6-Mediated+De-acetylation+of+Histone+H3K56%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LncPRESS1 Is a p53-Regulated LncRNA that Safeguards Pluripotency by Disrupting SIRT6-Mediated De-acetylation of Histone H3K56.</a> Mol Cell. 64 (5), 967-981 (2016).</li>
<li>Bergmann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ESC+transcriptome+by+nuclear+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ESC transcriptome by nuclear long noncoding RNAs.</a> Genome Res. 25 (9), 1336-1346 (2015).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LincRNA-p21+suppresses+target+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LincRNA-p21 suppresses target mRNA translation.</a> Mol Cell. 47 (4), 648-655 (2012).</li>
<li>Huarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+lncRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging role of lncRNAs in cancer.</a> Nat Med. 21 (11), 1253-1261 (2015).</li>
<li>Badowski, C., He, B., Garmire, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-derived+lncRNAs+as+biomarkers+for+cancer+diagnosis%3A+the+Good%2C+the+Bad+and+the+Beauty%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blood-derived lncRNAs as biomarkers for cancer diagnosis: the Good, the Bad and the Beauty.</a> NPJ Precis Oncol. 6 (1), 40(2022).</li>
<li>Zong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+nuclear-retained+long+noncoding+RNAs+using+modified+DNA+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Knockdown of nuclear-retained long noncoding RNAs using modified DNA antisense oligonucleotides.</a> Meth Mol Biol. 1262, 321-331 (2015).</li>
<li>Gagnon, K. T., Li, L., Chu, Y., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+factors+are+present+and+active+in+human+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RNAi factors are present and active in human cell nuclei.</a> Cell Rep. 6 (1), 211-221 (2014).</li>
<li>Zeng, Y., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+human+cells+is+restricted+to+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm.</a> RNA. 8 (7), 855-860 (2002).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+noncoding+RNA+editing+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers.</a> RNA Biol. 15 (1), 35-43 (2018).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355 (6320), aah7111(2017).</li>
<li>Tsung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi+screen+of+long+non-coding+RNAs+identifies+LINC03045+regulating+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">CRISPRi screen of long non-coding RNAs identifies LINC03045 regulating glioblastoma invasion.</a> PLoS Genet. 20 (6), e1011314(2024).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+tool+for+the+job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the right tool for the job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Yeo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+CRISPR+repressor+for+targeted+mammalian+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation.</a> Nat Meth. 15 (8), 611-616 (2018).</li>
<li>Parrish, P. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+synthetic+lethal+and+tumor+suppressor+paralog+pairs+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Discovery of synthetic lethal and tumor suppressor paralog pairs in the human genome.</a> Cell Rep. 36 (9), 109597(2021).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthologous+CRISPR-Cas9+enzymes+for+combinatorial+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Orthologous CRISPR-Cas9 enzymes for combinatorial genetic screens.</a> Nat Biotechnol. 36 (2), 179-189 (2018).</li>
<li>Petroulia, S., et al. CRISPR-inhibition screen for lncRNAs linked to melanoma growth and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetroulia%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>New England Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NEBuilder+HiFi+DNA+Assembly+Reaction+%28E2621%29+v2%22">NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction (E2621) v2</a>. , (2020).</li>
<li>Cortés-Ríos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+bicinchoninic+acid+%28BCA%29+assay+follows+complex+kinetics+and+can+be+performed+at+short+incubation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times.</a> Anal Biochem. 608, 113904(2020).</li>
<li>Junior, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunior%2C+N+%22Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28SDS-PAGE%29+v1%22">Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) v1</a>. , (2019).</li>
<li>Chen, X., Liu, J., Janssen, J. M., Gonçalves, M. A. F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+structure+differentially+impacts+high-specificity+CRISPR-Cas9+Nuclease+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">The chromatin structure differentially impacts high-specificity CRISPR-Cas9 Nuclease strategies.</a> Mol Ther Nucl Acids. 8, 558-563 (2017).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).</li>
<li>Daer, R. M., Cutts, J. P., Brafman, D. A., Haynes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chromatin+dynamics+on+Cas9-Mediated+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Syn+Biol%22%5BJournal%5D)">The impact of chromatin dynamics on Cas9-Mediated genome editing in human cells.</a> ACS Syn Biol. 6 (3), 428-438 (2017).</li>
<li>Chavez, M., Rane, D. A., Chen, X., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+of+large+transgenes+via+the+knock-in+of+an+integrase-deficient+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus.</a> Nat Biomed Eng. 7 (5), 661-671 (2023).</li>
<li>Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+variegation+of+gammaretrovirus+and+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors.</a> Human Gene Ther. 16 (11), 1241-1246 (2005).</li>
<li>Shrestha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenetics+guided+identification+of+tissue-specific+genomic+safe+harbors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors.</a> Genome Biol. 23 (1), 199(2022).</li>
<li>Chu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfection+and+induction+of+apoptosis+in+melanoma+cells+by+branched+poly%28%CE%B2-amino+ester%29s+with+uniformly+distributed+branching+units%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfection and induction of apoptosis in melanoma cells by branched poly(β-amino ester)s with uniformly distributed branching units.</a> J Control Release. 367, 197-208 (2024).</li>
<li>Han, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+is+a+highly+effective+gene+transfer+techfnique+for+human+melanoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Nucleofection is a highly effective gene transfer techfnique for human melanoma cell lines.</a> Exp Dermatol. 17 (5), 405-411 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra Santrifüj Filtre, 100 kDa MWCO</td><td>Millipore UFC910024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. aureus) (6H4) fare monoklonal antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>48989</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3) monoklonal antikor</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH fare monoklonal antikoru&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare IgG (tüm molekül)&ndash; Tavşan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9044</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP Görüntüleme Sisteminde</td> üretilen peroksidaz antikoru&nbsp;<td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S hidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Canlılık Testi</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Berraklık Batı ECL Substratı, 500 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör Modeli CB 170</td><td>Bağlayıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmB1) kısıtlama enzimi</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 mL Serolojik Pipet</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25 mL Serolojik Pipet</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Serolojik Pipet</td><td>Corning</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır</td><td>Serumu Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM), yüksek glikoz, piruvat</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>İnsan melanom hücre hattı 501-mel</td>, <td>Aifantis Lab (New York Üniversitesi) tarafından nazikçe sağlandı</td><td>. RRID: CVCL_4633</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon -P PVDF Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293T HEK hücre hattı</td><td>Takara Bio</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Hücre sistemi&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Montaj Reaksiyonu&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız süt tozu&nbsp;</td><td>Biomol</td><td>54650</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Numune Tamponu (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Tek Atış Stbl Kimyasal Olarak Yetkin E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tüpleri 0.5 ml (Düz Kapak)</td><td>VWR International</td><td>732-3207</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Corning</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF Tampon ile Yüksek Kaliteli PCR Master Karışımı</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531L</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polibrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin, dallı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin dihidroklorür</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-108071A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti ve nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal Mikrosantrifüj Tüpü 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür, 5 M Aqua Solüsyonu, RNaz İçermeyen</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60434.AE</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtresi PES 33mm 0.2 & mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>TC Çanak 100, Standart</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td></td></tr><tr><td>TC Plaka 6 Kuyu, Standart, F</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,20,005</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

kanser hücrelerinde kodlamayan rna'lar arasındaki sentetik Ölümcül etkileşimleri hedeflemek için Çift crispr-girişim stratejisi

Dual CRISPR-Interference Strategy for Targeting Synthetic Lethal Interactions Between Non-Coding RNAs in Cancer Cells

SadCas9-KRAB-MeCP2 ve SpdCas9-KRAB-MeCP2'nin ekspresyon kasetleri, eşit miktarda lentivirüs ile transdüksiyon kullanılarak aynı anda 501-mel hücrelerine entegre edildi. Bu CRISPRi protokolü, dCas9-KRAB-MeCP2 varyantlarının ekspresyonuna dayandığından, Western blot analizi, protein seviyesindeki varlıklarını doğrulamak için idealdir. Pozitif transfekte edilmiş hücrelerin zenginleştirilmesini takiben, dCas9-KRAB-MeCP2 ortologlarının varlığını doğrulamak için Western blot analizi için örnekler toplandı. Başarılı transdüksiyondan sonra, SpdCas9-KRAB-MeCP2 füzyon proteinine (202 kDa) ve SadCas9-KRAB-MeCP2 füzyon proteinine (170 kDa) karşılık gelen tek bir bant beklenir ve Şekil 2A'da gösterildiği gibi, ilgili Cas9 ortologlarına özgü antikorlar kullanılarak doğrulanmıştır. Bununla birlikte, Western blot mümkün değilse, mRNA seviyesinde füzyon proteinlerini doğrulamak için qPCR kullanılabilir.
Fonksiyonel baskılayıcıları stabil bir şekilde eksprese eden 501-mel hücreleri oluşturulduktan sonra, bir çift gRNA vektörü kullanılarak ikinci lentiviral transdüksiyon gerçekleştirildi. RP11 ve XLOC'un daha önce kısa süreli metastatik melanom kültürlerinde yukarı regüle olduğu gösterilmişti ve bireysel CRISPRi hedeflemesi, proliferasyon ve hücre sağkalımı üzerindeki etkilerini gösterdi28. Bu nedenle, bu lncRNA çiftini, modifiye edilmiş hücrelerde kümülatif, kolayca gözlemlenebilir bir büyüme fenotipi öngörerek, kavram kanıtı sentetik öldürücü kodlamayan bir RNA kombinasyonu olarak değerlendirme için seçtik.
Canlılık deneyleri kullanarak kanser hücrelerinde ikili CRISPRi'nin etkilerini araştırmak için, hedeflenen her iki lncRNA'nın da etkili bir şekilde baskılanması gerekir. qPCR, transkript seviyelerini ölçerek bu baskıyı doğrulamak için en uygun yöntemdir. Geliştirilen ikili CRISPRi protokolünün işlevselliğini, RNA seviyelerini belirleyerek ve potansiyel olarak ölümcül RP11 ve XLOC çiftini hedeflerken hücre canlılığını inceleyerek değerlendirdik. Bu nedenle, hedef RNA seviyelerini düşürmek için RP11 ve XLOC'u hedefleyen farklı gRNA'lar tanıtıldı. RNA'nın baskılanması, SadCas9-KRAB-MeCP2 veya SpdCas9-KRAB-MeCP2 için hedefe özgü gRNA'lar kullanılarak araştırıldı, Rosa26'yı hedefleyen bir kontrol gRNA'sı ile birlikte ayrı ayrı ve kombinasyon halinde test edildi (bkz. Şekil 2B). XLOC veya RP11'i hedefleyen gRNA'lar ayrı ayrı kendi hedeflerini etkili bir şekilde bastırsa da, hem XLOC hem de RP11'in aynı anda yıkılması yalnızca XLOC-sa/RP11-sp çifti ile sağlandı.
Seçilen XLOC-sa/RP11-sp gRNA çifti ile 501-mel hücre hattında hem XLOC hem de RP11 RNA seviyeleri başarılı bir şekilde azaltıldığından, bir ikili lncRNA baskılama canlılık testi gerçekleştirildi (bkz. Şekil 2C<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig02large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%201.tif" target="_blank"></a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%202.tif" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%203_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%204_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%205_GAPDH_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%206_GAPDH_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%201_dual-grna-zeo-gfp.fasta" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%202_dSpCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%203_dSaCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank"></a>

Kanser Hücrelerinde Kodlamayan RNA'lar Arasındaki Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedeflemek için Çift CRISPR-Girişim Stratejisi

Long non-coding RNAs (lncRNAs) represent a vast and functionally diverse class of RNA molecules, with over 100,000 predicted in the human genome. Although ...

dual-crispr-interference-strategy-for-targeting-synthetic-lethal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

CRISPR/Cas9, genlerin ve genetik elementlerin bozulmasını sağlayan sağlam bir sistemdir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanarak memeli hücre hatlarında genomik delesyonların verimli bir şekilde oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Önceden monte edilmiş Cas9/guide RNA ribonükleoprotein komplekslerinin doğrudan teslimi hematopoetik hücrelerde genom düzenleme için hızlı ve etkili bir araçtır. Burada, bir RUNX1 intronic susturucu silmek ve OCI-AML3 lökemik hücrelerde transkripsiyonel yanıtları incelemek için bu yaklaşımı kullanır.

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

Model organizmalarda büyük genetik ekranlar negatif genetik etkileşimlerin tanımlanmasına yol açmıştır. Burada, kanserde sentetik ölümcül etkileşimleri hedefleyen ilaç kombinasyonlarını tanımlamak için model organizmalardaki genetik ekranlardan elde edilen verileri kullanarak bir veri entegrasyonu iş akışını açıklıyoruz.

Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedefleyen İlaç Kombinasyonlarını Tanımlamak için Veri Entegrasyonu İş Akışı

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

CRISPR gibi teknolojilerin önündeki önemli bir engel, hayati genleri bozabilecek hedef dışı olaylardır. 'Dizileme ile Bölünme Etkilerinin İn Vitro Raporlaması için Döngüselleştirme' (CIRCLE-seq), istenmeyen bölünme bölgelerini belirlemek için tasarlanmış bir tekniktir. Bu yöntem, CRISPR-Cas9'un genom çapındaki aktivitesini yüksek hassasiyetle ve önyargısız olarak haritalandırır.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Genom çapında bir CRISPR / Cas9 tarama yönteminin uygulanması yoluyla dirençli ve hassas radyasyon genlerini seçmek için titiz ve yapılandırılmış bir yaklaşım verilmiştir. Bu protokol aynı zamanda klinik olarak uygulanan kimyasal ilaçlara direnç mekanizmalarını araştıran diğer araştırma çabaları için çok yönlü bir çerçeve olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

Radyosensitif ve radyodirençli genleri ortaya çıkarmak için genom çapında CRISPR ekranı

Keşfedin melanoma hücrelerinde çift CRISPRi sistemi ile kodlamayan RNA'ları hedefleme yöntemini. Bu yaklaşım, sentetik ölümcül etkileşimleri belirleyerek kanser tedavisinde yeni stratejiler sunar.

Kanser Hücrelerinde Kodlamayan RNA'lar Arasındaki Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedeflemek için Çift CRISPR-Girişim Stratejisi

Daha fazla video keşfet