Kanser Hücrelerinde Kodlamayan RNA'lar Arasındaki Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedeflemek için Çift CRISPR-Girişim Stratejisi

Amacımız, kanserde kodlamayan RNA'lara odaklanarak kritik ağ merkezlerini sistematik olarak tanımlamak ve terapötik olarak hedeflemektir. Yaklaşımımızın mevcut deneysel zorluğu, paralel olarak çok sayıda gen üretmek ve taramak için gereken kombinatoryal kapasitede yatmaktadır. Direnci ve terapötik kaçışı atlatmak için yeni kombinatoryal kodlamayan RNA hedeflerini veya ilaçlanabilir yapıları tanımlamanın yolunu açmayı amaçlıyoruz.

Gelecekte, bu kavram kanıtı aracını, hem in vitro hem de in vivo olarak potansiyel olarak RNA bağlayıcı proteinlerle kombinasyon halinde büyük ölçekli kombinatoryal kütüphane tarama çabalarına dönüştüreceğiz. Başlamak için, bir hemositometrede Tripan mavisi boya kullanarak Lenti-X 293T HEK hücrelerini sayın. 10 santimetre plaka başına 6 Lenti-X 293T HEK hücresinin gücüne 4 kez 10 kez plaka yapın ve ertesi gün yaklaşık% 80 birleşme elde etmek için inkübe edin.

Bu adımdan itibaren 2. sınıf bir laboratuvarda çalışın. 500 mikrolitre uygun bir transfeksiyon ortamını transfer vektörü, zarf plazmidi ve pPAX2 vektörü ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Ayrı bir tüpte, 500 mikrolitre indirgenmiş serum ortamını mililitre konsantrasyonda 1 miligram konsantrasyonda 36 mikrolitre PEI reaktifi ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İki karışımı birleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Şimdi dikkatlice, damla damlasına, karışımı altı mililitre içeren hücre ortamına ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. 12 ila 15 saat sonra, ortamı serolojik bir pipet kullanarak otoklavlanabilir bir atık şişesine atın. Serolojik pipetler ve pipet uçları da dahil olmak üzere sarf malzemelerini otoklav atığına atmadan önce dezenfektan solüsyonla durulayın.

Yeni bir pipet kullanarak transfekte edilmiş hücrelere beş mililitre taze DMEM ekleyin. Lentivirüsleri hasat etmek için, süpernatanı serolojik bir pipet kullanarak, transfeksiyondan 48 saat sonra 50 mililitrelik kanonik bir tüpe aktarın. Daha sonra hücrelere 5 mililitre taze ortam ekleyin ve 24 saat daha inkübe edin.

Tüpü buzdolabında saklayın. İnkübasyondan sonra, lentivirüslerin toplanmasını tekrarlayın ve daha önce toplanan örnekle bir araya getirin. Üçüncü hasattan sonra, filtrasyon ve santrifüjlemeye kadar üç hasadın tümünün süpernatantlarını dört santigrat derecede birleştirin.

Kombine süpernatanı, Risk Grubu 2 organizmaları için onaylanmış aerosol geçirmez kaplarda ve rotorlarda 500G ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı 0.2 mikrometre steril hücre kültürü sınıfı şırınga filtrelerinden süzün. Filtrelenmiş süpernatanı, yaklaşık 500 mikrolitreye kadar 100 kilodalton moleküler ağırlık kesimine sahip bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak 1000G ve dört santigrat derecede konsantre edin. 50 ila 100 mikrolitrelik virüs alikotlarını daha fazla kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Plaka 501-mel hücreleri, transdüksiyondan bir gün önce 2 mililitrelik bir nihai kültür hacmi ile oyuk başına 10 ila 5 hücrenin gücünde 2 kez altı oyuklu bir plakada bulun. Kültür ortamını, mililitre nihai konsantrasyonda 6 mikrogram polibren ile desteklenmiş 2 mililitre önceden ısıtılmış DMEM ile değiştirin. Bu adımdan itibaren 2. sınıf bir laboratuvarda çalışın.

50 mikrolitre hazırlanmış SPD ve SAD lentivirüslerini aynı anda hücrelere damla damla ekleyin. Plakayı hafifçe çalkalayın ve% 5 karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Transdüksiyondan 16 saat sonra, ortamı serolojik bir pipet kullanarak otoklavlanabilir bir şişeye atın.

Mililitre Blasticidin başına 10 mikrogram ve mililitre puromisin başına 2 mikrogram içeren 2 mililitre taze ortam ekleyin. İki gün sonra orta değiştirme adımını tekrarlayın ve transdüksiyondan yedi gün sonra transdüksiyon hücreleri S1 koşulları altında ele alın. 100 mikrolitre önceden ısıtılmış DMEM ile 96 oyuklu bir plakada transdüksiyondan yedi gün sonra stabil transfekte edilmiş SadCas9 KRAB ve Sp-dCas9-KRAB içeren 5 hücrenin gücüne 0.1 kez 10 tohum.

Transdüksiyon gününde, ortamı mililitre başına 6 mikrogramda polibren ile desteklenmiş 100 mikrolitre önceden ısıtılmış DMEM ile değiştirin. Hücrelere uygun hacimde lentivirüs ekleyin ve plakayı inkübe edin. 16 saat sonra, ortamı Zeoin, Blasticidin ve puromisin içeren taze ortamla değiştirin.

Üreticinin talimatlarına göre bir hücre canlılığı testi kullanarak transdüksiyondan beş gün sonra lüminesans tespiti gerçekleştirin. Batı kan analizi, dönüştürücü 501-mel hücrelerinde SpdCas9 ve SadCas9 füzyon proteinlerinin başarılı ekspresyonunu doğruladı. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu analizi, spesifik kılavuz RNA'lar kullanılarak bireysel uzun kodlamayan RNA'lar RP11 ve XLOC'un etkili bir şekilde yıkıldığını gösterdi, ancak yalnızca XLOC-sa ve RP11-sp çifti her iki hedefi de aynı anda başarılı bir şekilde bastırdı.

XLOC-sa ve RP11-sp GRNA çifti kullanılarak RP11 ve XLOC'un ikili baskısı, 501-mel hücre canlılığını kontrole kıyasla %59'a önemli ölçüde azalttı.