Pseudomonas aeruginosa'da Motilite Fenotiplerini Gözlemlemek için Yüksek Verimli Yöntem

Araştırmalarımız, sistem biyolojisi ve genomik kullanarak bakterilerin nasıl çalıştığını ve enfeksiyona neden olduğunu anlamaya odaklanıyor. Enfeksiyon ortamını taklit eden bakteriyel fizyolojiyi etkileyen genleri belirlemeyi ve daha iyi antibiyotik ve alternatif tedaviler geliştirmek için yeni hedefler bulmayı hedeflemeyi hedefledik. Pseudomonas aeruginosa hareketliliğini etkileyen genetik faktörleri belirlemek için yüksek verimli bir protokol geliştirdik; böylece sürü ve seğirme davranışlarının genom çapında analizini mümkün kılıyoruz. Bu araştırma girişimi, biyofilm oluşumu, kolonizasyon ve konak savunmasından kaçınmaya katkıda bulunan moleküler mekanizmaları ortaya çıkardı.

Farklı testlere ve bakteri türlerine uyarlanabilir. Başlamak için, Pseudomonas aeruginosa transpozon mutant kütüphanesinin kaynak plakalarını alın ve onları yaklaşık bir saat boyunca oda sıcaklığında bir yüzeyde düz bırakarak soğumaya devam edin. İstenilen test için, sürü için M9 glukoz 0,5% agar plakaları ve seğirme için LB agar 1%agar plakaları seçin.

Replikatörü doğru koloni transferi için yapılandırmak için, replikatörü açın. Seçme ve çalıştırma modunda ise seç ve kayıtlı programları çalıştır. Kaynak plakaları seç bölümünde, plus plaka 384 agar seçin.

Sonra, hedef plaka seçme bölümünde plus plaka 384 agar seçin. Pad seçme bölümünde, kısa pin 384'ü seçin. Singer programlarında, çoğaltma programını seçin, sonra çoğaltma programı seçeneklerine gidin ve genel olarak geri dönüşüm ve hiçbirini seçin.

Bölüm kaynağında, offset seçin, ardından rastgele ve varsayılan yarıçapı seçin. Bölüm hedefinde sabitlemeyi seçin ve basıncı %2'ye ayarlayın. Diğer tüm ayarları varsayılan olarak bırakın. Sonra, kısa pinli RePads 384'ü uygun bölmeye yerleştirin.

Kaynak ve hedef plakalarını replikatörün belirlenmiş platformuna yerleştirin. 384 yoğunluk kaynak plakalarını ve boş hareketlilik plakalarını platforma yerleştirin. Transfer sürecini başlatmak için seçilen parametreleri kullanarak çalıştır tuşuna basın.

Mikrobiyal diziyle sabitleme robotu, 384 yoğunluk kaynak plakalarından hareketlilik plakalarına koloniler aktaracak. Sonrasında, aşılanmış hareketlilik plakalarını plastik poşetlere yerleştirin. Plakaları içeren poşetleri dikkatlice kuluçka makinesine yerleştirin, 18 saat boyunca 37 derece Celsius sıcaklığına ayarlanın.

Kuluçka döneminden sonra, herhangi bir yüksek kaliteli görüntüleme yazılımı kullanarak hareketlilik plakalarının yüksek çözünürlüklü görüntülerini yakalayın. Hareketlilik testi yapıldıktan ve hareketlilik plakalarının görüntülenmesinden sonra, makroyu ImageJ'de çalıştırın. Görüntüleri içeren klasörü açın, böylece analiz için toplu yükleyin.

Istendiğinde, plaka düz olana kadar önizleme seçeneğiyle açıyı değiştirerek plakanın dönüşünü ayarlayın. Memnun kaldığınızda tamam tuşuna tıklayın. Sonra, dikdörtgen aracı kolonilerin etrafında hareket ettirerek plakanın kolonileri içeren kısmını kırpın.

Hazır olunca, kırpmayı tamamlamak için OK'a tıklayın. Her koloninin etrafında ilgi duyulan bölgeyi (ROI) çizmek için kullanılan ızgarayı tanımlayın ve hareketlilik alanını ölçün. Uygun koloni yoğunluğunu seçin ve parametreleri gerektiği gibi ayarlayarak her dairenin bir koloninin etrafında konumlandırıldığından emin olun.

Hazır olduğunda tamam kutusunu etkinleştir ve tamam butonuna tıkla. Her koloninin hareketlilik alanı ölçülür ve verileri içeren bir CSV dosyası belirlenen klasörde kaydedilir. Hareketlilik testi için, M9, glikoz, kasamino asitler ve magnezyum sülfat içeren bir agar çözeltisi otoklav yapın.

Her Petri tabağına 25 mililitre soğutulmuş, karıştırılmış agar dök. Sonra, her plakayı 2,5 mikrolitre gece bakteri kültürü ile aşılayın ve 37 derece Celsius'ta 18 saat boyunca kapaklar yukarı bakacak şekilde kuluçka yapın; böylece hareketlilik fenotipleri gözlemlenin. LB çözeltisi %1 agar ile otoklavlandıktan sonra, soğutulmuş ve karıştırılmış LB 1%agar'dan 25 mililitre Petri plakalarına dökülür.

Seğirme plakalarının altına bakterileri aşılayın, bu tabak %1 agar içerir. Plakaları 37 derece Celsius'ta 48 saat boyunca kuluçkalayın, ardından oda sıcaklığında ek 48 saat kalın. İnkubasyondan sonra, agar dikkatlice plakalardan alın.

Petri kabını %1 kristal mor çözeltisiyle boyayarak seğirme bölgesini görselleştirin. Seğirme hareketliliği testi, T4P makine gen silinmelerine sahip Pseudomonas aeruginosa mutantlarının vahşi tipe kıyasla anlamlı derecede daha küçük hale bölgeleri sergilediğini ve bu da azalmış seğirme hareketliliğini gösterdiğini gösterdi. Sürü hareketliliği analizi, PA14 kütüphanesindeki silinme mutantlarının çıkıntısız halo bölgelerini önemli ölçüde azalttığını ve bu da kusurlu sürü yeteneğini doğruladığını ortaya koydu.

Bakteriyel hareketlilik çalışmaları genellikle verimlilikleriyle sınırlıdır. Yüksek verimli hareketlilik protokolümüz araştırmacıların bakteriyel hareketliliği kapsamlı şekilde incelemesine yardımcı olacak. Örneğin, genom çapında mutant koleksiyonu kullanılarak, hareketlilikle bağlantılı tüm genlerin tanımlanması ve bakterilerin enfeksiyonlara nasıl yol açtığı ortaya çıkarılabilir.

Bulgularımız, Pseudomonas aeruginosa'da hareketliliğin genetik kontrolü, biyofilm oluşumundaki rolü ve patogenez ile bağlantısı hakkında yeni sorular gündeme getiriyor. Ayrıca, çevresel koşulların hareketlilik davranışlarını nasıl şekillendirdiğini ve hareketlilik genlerini hedeflemenin yenilikçi antimikrobiyal tedavilere yol açıp açmayacağını araştırmaya yardımcı olurlar.