Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması

Bu prosedürün genel amacı, yüksekletimli bir biyoreporter taraması aracılığıyla, fırsatçı patojen Pseudomonas aeruginosa'da ikinci haberci cyclic-di-GMP'nin hücre içi seviyelerini modüle eden küçük molekülleri tanımlamaktır. Bu yöntem, cyclic-di-GMP modülasyonu yoluyla Pseudomonas aeruginosa biyoinformasyonuna ve diğer partiküllere müdahale eden küçük moleküllerin keşfedilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, oldukça sağlam ve çok yönlü olması sayesinde 48 saat içinde 3.500'den fazla bileşiğin taranmasına olanak tanımasıdır.

Bu tekniğin doğurguları, bakteriler üzerinde daha az ve seçici bir baskı uygularken, Pseudomonas aeruginosa'yı bağışıklık sistemine veya mevcut antibiyotiklere potansiyel olarak duyarlı hale getiren yeni terapilerin geliştirilmesine yönelik genişlemektedir. Beş mililitre lizojeni broth veya LB besiyerine, tek bir P. aeruginosa kolonisi inoküle ederek 37 °C'de, 200 rpm hızında çalkalamalı olarak inkübe edin. Ardından, gecelik kültürden iki mililitreyi, bir litrelik bir flask içindeki 200 mililitre taze LB besiyerine aktarın ve 37 °C'de, 200 rpm hızında çalkalamalı olarak inkübe edin.

Erlenmayerden 1 mililitre numune alıp bir spektrofotometre kullanarak inceleyerek, her 30 dakikada bir 600 nanometredeki optik yoğunluğu veya OD 600 değerini takip edin. OD 600 değeri 0,3 ile 0,5 arasına ulaştığında, kültürden 40 mililitreyi 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 8000 rpm'de santrifüjleyerek çöktürün.

Süpernatantı atın ve hücreleri 40 mililitre buz gibi soğuk steril 300 milimolar sakkaroz çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Hücreleri ikinci kez santrifüj ettikten sonra, 20 mililitre buz gibi soğuk steril 300 milimolar sakkaroz çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve 400 mikrolitre 300 milimolar sakkaroz çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca soğutun, ardından hücreler elektroporasyon için hazır hale gelecektir.

Ardından, buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir mikro-santrifüj tüpü içindeki 40 mikrolitre hazırlanmış P.Aeruginosa elektro-kompetan hücrelere, CdrA promotörünü kodlayan plazmidi yeşil floresan protein kodlayan gene ekleyen 0,2 mikrogram/mikrolitre konsantrasyonundaki çözeltiden bir mikrolitre ekleyin. Süspansiyonu karıştırın ve önceden soğutulmuş 2 milimetrelik elektrot aralıklı bir elektroporasyon küvetine aktarın. Küvetin dışındaki nemi kağıt havluyla temizleyin ve küveti elektroporatörün örnek haznesine yerleştirin.

Çözüme 2,5 kilovolt gerilim, 25 microfarad kapasitans ve 200 ohm dirençle şok uygulayın. Küveti çıkarın ve bir mililitre LB besiyeri ekleyin. Ardından, hücreleri steril bir 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 37 °C'de, 200 rpm hızında çalkalayarak iki saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, kültürden 10 µL, 50 µL ve 100 µL'lik alikotları Ampisilin takviyeli steril LB agar plaklarına yayın ve plakları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. GFP ekspresyonunu, plağı standart bir GFP kanalıyla floresan mikroskobunda inceleyerek doğrulayın. Tek bir koloni seçin ve beş mL LB içine inoküle edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, 0,5 mL gece boyu kültürü ile 0,5 mL %50 gliserolü 2 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpte karıştırın ve -80 °C'de saklayın.

Taramadan iki gün önce, -80 °C stoktan hazırlanan P.aeruginosa suşunu, steril bir ekim döngüsü kullanarak bakterileri plaka üzerine nazikçe yayarak bir LB agar plakasına ekin. Plakayı 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Taramadan önceki akşam, plakadan tek bir P.aeruginosa kolonisini bir tüp içindeki 10 mL LB besiyerine inoküle edin.

Ön kültürü, 37 °C'de 200 rpm sallama ile gece boyunca inkübe edin. Tarama gününde, gece boyu inkübe edilen ön kültürü önce taze LB besiyeri ile OD 600 değeri 1,0 olacak şekilde seyrelterek ve ardından %5 LB ile OD 600 değeri 0,4 olacak şekilde tekrar seyrelterek bir alt kültür hazırlayın. Kabın içine steril bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve kültürü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca manyetik karıştırıcıda minimum hızda karıştırın.

Bu işlem, bakterilerin 384 kuyucuklu plakalara dağıtılmadan önce besiyerine adapte olmalarını sağlar. Pozitif kontrolü hazırlamak için, hazırlanan alt kültüre 20 microliters Tobramycin Sulfate ekleyin ve nazikçe karıştırın. Pozitif kontrol kültüründen 40 microliters miktarını A23 ile P23 arasındaki kuyucuklara pipetleyin.

Negatif kontrolü hazırlamak için, hazırlanmış alt kültüre 30 µL Dimetilsülfoksit ekleyin ve nazikçe karıştırın. Negatif kontrol kültüründen 40 µL'yi A24 ile P24 arasındaki kuyucuklara pipetleyin. Küçük moleküllerle nemlendirilmiş plakaların her biri için, gecelik kültürlerin seyreltilmiş formundan 40 µL hacminde örneği A1 ile P22 arasındaki kuyucuklara inoküle edin.

Plakaları hava geçirgen bir kapakla kapatın ve 37 °C'de altı saat boyunca inkübe edin. Kondansasyonu önlemek için spektrofotometrik ölçümden yaklaşık 30 dakika önce plak okuyucuyu 37 °C'ye kadar ön ısıtın. Okuma işleminden önce hava geçirgen kapak mühürünü plakadan nazikçe çıkarın.

Ardından, kuyuk başına 10 flaş ayarı ve 0,2 saniyelik bir yerleşme süresi ile 600 nanometre dalga boyunda optik yoğunluğu ölçün. Floresans ölçümünden önce, negatif kontrol kuyuğu A24'e dayanarak otomatik kazanç ve odak ayarı yapın ve kazanç hedef değerini %75 olarak belirleyin. Pencerenin sağ tarafında odak ayarını ve kanal A'yı seçin. GFP raporerinden gelen floresansı, 485 nanometre maksimum uyarım ve 520 nanometre maksimum emisyon değerlerinde, kuyuk başına 10 flaş ayarı ve 0,2 saniyelik bir yerleşme süresi ile ölçün.

İncelenen tüm plakalardan verileri toplayın. Veri okumaları, plaka okuyucu kontrol yazılımı tarafından varsayılan olarak otomatik olarak kaydedilir. Verileri analiz etmek için, istatistiksel analiz paketini açmak üzere kontrol yazılımı içindeki Mars simgesine tıklayarak okumaları görüntüleyin.

Analiz için verilere erişmek amacıyla ilgili plaka numarasına çift tıklayarak verileri geri çağırın. Sağlam bir Z prime analizi kullanarak assay'in tekdüzeliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirin. Ardından, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere, büyüme inhibisyon yüzdesini hesaplayın ve hücre içi c-di-GMP seviyesinin inhibisyon yüzdesini değerlendirin.

Bu şekil, yüksek kapasiteli taramadan elde edilen OD 600 ve GFP için temsilci ham verileri tanımlamaktadır. Kuyucuk değerlerine, düşükten yükseğe değerleri belirten sıcakta soğuk renklere doğru bir renk gradyanlı ısı haritası uygulanmıştır. Üretilen veriler yüzde inhibisyon açısından analiz edilmiş olup, burada hem OD 600 hem de GFP okumaları için sunulmuştur.

Büyümeyi ve hücre içi c-di-GMP seviyelerini potansiyel olarak inhibe eden küçük moleküller yeşil, büyümeyi ve hücre içi c-di-GMP seviyelerini potansiyel olarak artıran küçük moleküller ise kırmızı renkte olacaktır. Test edilen her bir küçük molekülden elde edilen inhibisyon yüzdesini karşılaştırmak için dağılım grafikleri kullanılmıştır. Her bir küçük molekül küçük bir nokta ile temsil edilmekte olup, OD 600 ve GFP okumalarının her biri için inhibisyon yüzdesi dağılımı gösterilmektedir.

Hit belirleme için artı veya eksi %50 kesme değeri seçilir. Potansiyel hitler kırmızıyla vurgulanmıştır. İlgi çeken her bileşik üzerinde doz-yanıt deneyleri gerçekleştirilir.

Burada, tanımlanmış iki bileşik, 2 mM maksimum konsantrasyon ve iki katlı dilüsyon serisi içeren 10 noktalı bir doz-yanıt testi ile analiz edilmektedir. Verilere dört parametreli lojistik fonksiyon uygulanması sonucunda, her bir bileşik için yarı maksimum inhibitör konsantrasyon değerleri 158 µM ve 193 µM olarak saptanmıştır. Bu teknikten yeterinceye gelindiğinde, 48 saat içerisinde 3.500'den fazla bileşik taranabilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, Pseudomonas aeruginosa'da siklik-di-GMP sinyalizasyonunu engelleyen bileşiklerin nasıl sağlam bir şekilde taranacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, tarama işlemi birkaç gün sürdüğünde tarama koşullarının karşılaştırılabilir tutulmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir. Tek noktalı bir taramanın ardından, aynı protokolü kullanarak bir doz-yanıt taraması yapmak, elde edilen sonuçların doğrulanmasını sağlayabilir.

Bu teknik, araştırmacıların Pseudomonas aeruginosa biyofilm oluşumu ve antibiyotik direnciyle etkileşime giren potansiyel küçük molekülleri belirlemelerinin önünü açmaktadır. Önemli bir nokta olarak, bu teknik ilgi duyulan herhangi bir bakteri için kullanılacak şekilde uyarlanabilir ve bakteriyel canlılık üzerindeki etki gibi diğer çıktıları veya girdileri incelemek üzere modifiye edilebilir. Son olarak, Pseudomonas aeruginosa ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu prosedür uygulanırken, kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemler her zaman alınmalıdır.