Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması Pseudomonas aeruginosa

Bu prosedürün genel amacı, fırsatçı patojen Pseudomonas aeruginosa'daki ikinci haberci siklik-di-GMP'nin hücre içi seviyelerini modüle eden küçük molekülleri yüksek verimli bir biyo-muhabir ekranı vasıtasıyla tanımlamaktır. Bu yöntem, döngüsel-di-GMP modülasyonu yoluyla Pseudomonas aeruginosa biyobilgisi ve diğer parçacıklarla etkileşime giren küçük moleküllerin ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok sağlam ve çok yönlü olması ve 48 saat içinde 3.500'den fazla bileşiğin taranmasına izin vermesidir.

Bu tekniğin etkileri, bakteriler üzerinde daha az, seçici bir baskı uygularken Pseudomonas aeruginosa'ya, bağışıklık sistemine veya mevcut antibiyotiklere potansiyel olarak duyarlı hale gelen yeni tedavilerin geliştirilmesine kadar uzanır. Tek bir P.aeruginosa kolonisi, yedi santigrat derece ile, 200 rpm'de çalkalanarak beş milileter lizojeni suyu veya LB ortamı innoküle edin. Daha sonra, gece boyunca süren kültürün iki mililitresini bir litrelik şişede 200 mililitre taze LB ortamına aktarın ve 200 rpm'de çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin.

Şişeden 1 mililitrelik bir numune alarak ve bir spektrofotometre kullanarak inceleyerek her 30 dakikada bir 600 nanometre veya OD 600'de optik yoğunluğu izleyin. OD 600 0,3 ile 0,5 arasına ulaştığında, kültürün 40 mililitresini 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 8000 rpm'de santrifüjleyerek hücreleri peletleyin.

Süpernatanı atın ve hücreleri 40 mililitre buz gibi steril 300 milimolar sükroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri ikinci kez santrifüjledikten sonra, 20 mililitre buz gibi steril 300 milimolar sükroz çözeltisinde yeniden süspanse edin Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve 300 milimolar sükroz çözeltisinin 400 mikrolitresinde yeniden süspanse edin. Hücreleri 30 dakika buz üzerinde soğutun, ardından elektroporasyona hazır hale gelirler.

Daha sonra, yeşil floresan proteini kodlayan gene CdrA promotörünü kodlayan mikrolitre başına 0.2 mikrogramlık bir plazmid çözeltisinin bir mikrolitresini, 1.5 mililitrelik bir mikro-santrifüj tüpünde hazırlanan P.Aeruginosa elektro-yetkin hücrelerin 40 mikrolitresine ekleyin. Süspansiyonu karıştırın ve önceden soğutulmuş 2 milimetre elektrot boşluklu elektroporasyon küvetine aktarın. Küvetin dışındaki nemi kağıt mendil ile alın ve küveti elektroporatörün numune odasına yerleştirin.

Çözeltiyi 2.5 kilovoltluk bir voltaj, 25 mikrofarad kapasitantları ve 200 ohm'luk bir dirençle vurun. Küveti çıkarın ve bir mililitre LB ortamı ekleyin. Daha sonra, hücreleri steril 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 200 rpm'de çalkalayarak 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, kültürün 10 mikrolitre, 50 mikrolitre ve 100 mikrolitre alikotunu Ampisilin ile sağlanan steril LB agar plakalarına yayın ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Plakayı standart bir GFP kanalına sahip bir floresan mikroskobu altında inceleyerek GFP ifadesini onaylayın. Tek bir koloni seçin ve beş mililitre LB ile aşılayın. Gece boyunca inkübasyondan sonra, gece boyunca 0.5 mililitre kültürü 0.5 mililitre% 50 gliserol ile 2 mililitrelik vidalı bir tüpte karıştırın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Ekrandan iki gün önce, hazırlanan P.aeruginosa suşunu eksi 80 santigrat derece stoktan bir LB agar plakasına yerleştirin ve bakterileri steril bir aşılama döngüsü kullanarak plakanın üzerine nazikçe yayın. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Taramadan önceki akşam, plakadan tek bir P.aeruginosa kolonisini bir tüpte 10 mililitre LB ortamına aşılayın.

Ön kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede 200 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. Ekranın yapıldığı gün, gece boyunca ön kültürden bir alt kültür hazırlayın, önce taze LB ortamı ile 1.0'lık bir OD 600'e seyrelterek ve daha sonra% 5 LB ile 04'lük bir OD 600'e seyrelterek. Kabın içine steril bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve kültürü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca manyetik bir karıştırıcı üzerinde minimum hızda karıştırın.

Bu, bakterilerin 384 oyuklu plakalara dağıtılmadan önce ortama alışmalarını sağlar. Pozitif kontrolü hazırlamak için, hazırlanan alt kültürün 10 mililitresine 20 mikrolitre Tobramisin Sülfat ekleyin ve hafifçe karıştırın. Pozitif kontrol kültürünün 40 mikrolitresini A23 ila P23 kuyularına pipetleyin.

Negatif kontrolü hazırlamak için, hazırlanan alt kültürün 10 mililitresine 30 mikrolitre Dimetil Sülfoksit ekleyin ve hafifçe karıştırın. Negatif kontrol kültürünün 40 mikrolitresini A24 ila P24 kuyularına pipetleyin. Küçük moleküllerle nemlendirilmiş plakaların her biri için, seyreltilmiş gece kültürlerinin 40 mikrolitrelik bir hacmini A1 ila P22 kuyularına aşılayın.

Plakaları hava geçirgen bir örtü ile kapatın, kapatın ve 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin. Spektrofotometrik ölçümden yaklaşık 30 dakika önce, yoğuşmayı önlemek için plaka okuyucuyu 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Okumadan önce hava geçirgen kapak contasını plakadan yavaşça çıkarın.

Ardından, oyuk başına 10 flaş ayarı ve 0,2 saniyelik bir yerleşme süresi ile 600 nanometre dalga boyunda optik yoğunluğu ölçün. Floresan ölçümünden önce, negatif kontrol kuyusu A24'e göre otomatik bir kazanç ve odak ayarı yapın ve kazanç hedef değerini %75 olarak ayarlayın Pencerenin sağındaki odak ayarını ve kanal A'yı seçin. GFP raportöründen gelen floresansı, kuyu başına 10 flaş ayarı ve 0,2 saniyelik bir çökelme süresi ile maksimum 485 nanometre uyarma ve maksimum 520 nanometre emisyonda ölçün.

İncelenen tüm plakalardan veri toplayın. Veri okumaları, plaka okuyucu kontrol yazılımı tarafından varsayılan olarak otomatik olarak kaydedilir. Verileri analiz etmek için, istatistiksel analiz paketini açmak için kontrol yazılımı içindeki Mars simgesine tıklayarak okumaları görüntüleyin.

Analiz için verilere erişmek için ilgilenilen plaka numarasına çift tıklayarak verileri alın. Sağlam bir Z prime analizi kullanarak testin tekdüzeliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirin. Ardından, büyümenin yüzde inhibisyonunu hesaplayın ve metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hücre içi c-di-GMP seviyesinin inhibisyon yüzdesini değerlendirin.

Bu şekil, yüksek verimli ekrandan OD 600 ve GFP için temsili ham verileri açıklar. Kuyu değerlerine, düşükten yükseğe değerleri gösteren sıcaktan soğuğa renklere sahip bir renk gradyanı ısı haritası uygulanmıştır. Oluşturulan veriler yüzde inhibisyon için analiz edilir ve burada hem OD 600 hem de GFP okumaları için temsil edilir.

Büyümeyi ve hücre içi c-di-GMP'yi potansiyel olarak inhibe eden küçük moleküller yeşil olma eğilimindeyken, büyümeyi ve hücre içi c-di-GMP seviyelerini potansiyel olarak destekleyen küçük moleküller kırmızı olma eğiliminde olacaktır. Saçılma grafikleri, test edilen her küçük molekülden elde edilen inhibisyon yüzdesini karşılaştırmak için kullanılır. Her küçük molekül küçük bir nokta ile temsil edilir ve OD 600 ve GFP okumalarının her biri için yüzde inhibisyon dağılımı gösterilir.

İsabet tanımlaması için artı veya eksi %50 kesme seçilir. Potansiyel isabetler kırmızı renkle vurgulanır. Her ilginç bileşik üzerinde doz-yanıt testleri yapılır.

Burada, tanımlanmış iki bileşik, iki milimolar üst konsantrasyon ve iki katlı bir seyreltme serisi ile 10 noktalı bir doz-yanıt testinde test edilir. Verilere dört parametreli bir lojistik fonksiyon uydurulduğunda, 158 mikromolar ve 193 mikromolar her bileşik için yarı maksimal inhibitör konsantrasyon değerleri elde edildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 48 saat içinde 3.500'den fazla bileşiği taramak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, döngüsel-di-GMP sinyallemesine müdahale eden bileşikler için Pseudomonas aeruginosa'yı nasıl sağlam bir şekilde tarayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, birkaç gün boyunca tarama yaparken tarama koşullarını karşılaştırılabilir tutmayı unutmamak önemlidir. Tek noktalı bir ekranın ardından, aynı protokolü kullanarak bir dirsk yanıt ekranı çalıştırmak isabetleri doğrulayabilir.

Bu teknik, araştırmacıların Pseudomonas aeruginosa ile ilgili bilgi ve antibiyotik direncine müdahale eden potansiyel küçük molekülleri tanımlamalarının yolunu açıyor. Daha da önemlisi, bu teknik, ilgilenilen herhangi bir bakteri için kullanılmak üzere uyarlanabilir ve bakteri canlılığı üzerindeki etki gibi diğer çıktıları veya girdileri incelemek için değiştirilebilir. Son olarak, Pseudomonas aeruginosa ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Ve bu işlem yapılırken kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.