Kitosan Nanopartiküllerin İntraosseöz Enjeksiyonu Kullanılarak Gelişmiş Gen İletimi ve Ekspresyonu Kapsüllenmiş Adenin Baz Düzenleyici Plazmitler

Burada, ABE kaplı kitosanı kemik içi enjeksiyon ile doğrudan kemik iliğine ileten bir gen tedavisi yaklaşımı sunuyoruz.

Adenin bazlı Editör Kitosan'ı kemik içi enjeksiyon yoluyla doğrudan kemik iliğine ileten bir gen terapisi yöntemi öneriyoruz. Eksojen plazmitlerin deney hayvanlarına transfeksiyon etkinliği nispeten düşüktür ve uzun süreli gen ekspresyonu için plazmitlerin eklenmesi bağışıklık sisteminden etkilenebilir. Adenin bazlı editör plazmitlerini kapsüllemek için to kitosan kullanıyoruz ve kompleksi intraosseöz enjeksiyon yoluyla doğrudan farelerin kemik iliğine ilettik, bu da onu anormal osteoklast fonksiyonunun neden olduğu hastalıklar için uygun hale getirdi.

Protokolümüz yüksek transfeksiyon verimliliği, küçük biyolojik hasar ve yüksek gen ekspresyon verimliliği sunar. Yeni stratejimiz yalnızca anormal osteoklast fonksiyonunun neden olduğu hastalıklar için uygun olmakla kalmıyor, aynı zamanda gen terapisi alanını ilerletmek için de önemli bir potansiyele sahip. Başlamak için ötenazi yapılmış bir fareyi çalışma masasına yerleştirin.

Cerrahi makas ve cımbız kullanarak kaval kemiğini çıkarın ve çevredeki tüm kas dokusunu soyun. Temizlenmiş kaval kemiğini PBS'ye batırın ve sadece kemik kalana kadar yıkayın. Bir şırıngaya bir mililitre PBS çekin ve kemik iliği hücrelerini tibianın bir ucundan kemik tamamen beyaza dönene kadar yıkayın.

Ardından, hücre süspansiyonunu bir tüpte toplayın. Beş dakika boyunca dört santigrat derecede 800 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı pipetledikten sonra, pelete 500 mikrolitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin.

Bir dakika sonra, lizizi sonlandırmak için bir mililitre ayırma tamponu ekleyin. Süspansiyonu beş dakika boyunca dört santigrat derecede 800 G'de tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve elde edilen hücre peletini daha sonra kullanmak üzere buzun üzerine koyun.

Kitosan transfeksiyonu için dört miligram kitosanı 20 mililitre asetik asit çözeltisi içinde çözün. 10 molar sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 5,5'e ayarlayın. Daha sonra 500 mikrolitre kitosan çözeltisini ayrı mikro santrifüj tüplerine dağıtın.

Şimdi ayrı tüplere iki, üç, dört ve beş mikrogram ABE plazmiti ekleyin. Plazmitleri 500 mikrolitre 30 milimolar sodyum sülfat içinde çözün. Daha sonra 500 mikrolitre plazmit çözeltisini 500 mikrolitre kitosan çözeltisi ile ilgili tüplerde karıştırın.

Tüpleri 50 ila 55 santigrat derecede bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Her tüpü 15 ila 30 saniye vorteksleyin ve 30 dakika boyunca rahatsız edilmeden bekletin. Karakterizasyon için dinamik ışık saçılımını kullanarak kitosanın çapını ve zeta potansiyelini analiz edin.

Kitosan konsantrasyonunu çift damıtılmış suda mililitrede 0,1 miligramda tutun. Daha sonra, mililitre kitosan numunesi başına 0,1 miligramı bir silikon çip üzerine dökün. Yeniden süspanse edilmiş numunelerin 20 mikrolitresini 200 gözenekli ızgaraya ekleyin ve inkübe edin.

Kemik iliği hücresi süspansiyonunu 800 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından 500 mikrolitre kırmızı kan hücresi lizatı ekleyin. Bir dakika sonra, reaksiyonu durdurmak için bir mililitre ayırma tamponu ekleyin.

Ardından hücre sayacı ile hücre sayısını sayın. Ardından, 1 milyon hücreyi yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tekrar santrifüjledikten sonra, süpernatanı pipetleyin ve hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Yeniden süspanse edilmiş hücreleri bir akış sitometri tüpüne aktarın ve akış sitometrisi kullanarak transfeksiyon verimliliğini ölçün. Kemik iliği boşluğu enjeksiyonu için, anestezi uygulanmış fareyi ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda sabitleyin. Ön uzvu yerine sabitlemek için yapışkan bant kullanın.

Arka tibiayı alkollü bir bez kullanarak dezenfekte edin. Daha sonra plazmit çözeltisini 26 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Hava kabarcıklarını çıkarın ve şırıngayı enjeksiyona hazır tutun.

Ardından, farenin kaval kemiğine parmaklarınızla dokunun ve sabitleyin. Enjeksiyon iğnesini diz ekleminin yakınındaki tibial platodan tibial şafta girecek şekilde konumlandırın. Şimdi iğneyi kaval kemiğine paralel döndürün, kemik iliği boşluğuna yerleştirin ve üç saniye boyunca yavaşça enjekte edin.

Enjeksiyondan sonra iğneyi üç saniye boyunca yavaşça geri çekin. Herhangi bir kanamayı durdurmak için delinme bölgesini alkollü bir bezle hemen dezenfekte edin. İyileşmesini kolaylaştırmak için fareyi 37 santigrat derecede sıcak bir ortama yerleştirin.

ABE ve GRNA plazmitleri ile oluşturulan nanopartiküller, tek tip bir küresel morfolojiye ve ortalama 202.9 nanometre boyutunda dar bir boyut dağılımına sahipti. 2,77 milivoltluk bir zeta potansiyeli ve 0,22'lik bir poli dağılım indeksi. Kitosan gömülü ABE plazmidi, kemik iliği hücrelerinde floresan sinyalini önemli ölçüde arttırdı ve kontrol grubuna kıyasla daha yüksek transfeksiyon verimliliği gösterdi.

Akış sitometrisi, kitosan kodlu ABE plazmidinin kemik iliği hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliği sağladığını doğruladı. Dört mikrogramlık bir dozda gözlemlenen %51.2'lik pik verimlilik ile üç mikrogram, %47.2'lik yüksek verimlilik dengesi sağlarken, kemik iliği hücresi genomik DNA'sının Sanger dizilimi ve PCR'si, hedef bölge A1'de %14.27 verimlilikle ve A2 bölgesinde %10.69 verimlilikle in vivo gen düzenlemesini ortaya çıkardı.