CRISPR Tabanlı Mekik Klonlama: Yüksek Verimli Bir Klonlama Yöntemi

Yüksek verimli bir klonlama yöntemi olan CRISPRshuttle için protokolümüzü açıklıyoruz. Bu, DNA fragmanlarının PCR amplifikasyonuna gerek kalmadan hedef DNA fragmanlarının vektörler arasında transferini içerir. Ağ geçidi infüzyonu ve tek vektör klonlama PCR amplifikasyonu gibi mevcut teknikler. Bu yaklaşım, birincil tasarım ve sekresyon doğrulaması dahil olmak üzere parçaya özgü prosedürleri gerektirir. Bu etiketler emek yoğun ve zaman alıcıdır. CRISPR mekiği, hedef DNA parçalarını vektörler arasında sıralı test tüpü reaksiyonlarına aktarırken PCR'yi ortadan kaldırır. Bu yöntem, parçaya özel işleme ihtiyacını ortadan kaldırır ve böylece numune yapımını hızlandırır.

[Anlatıcı] Başlamak için, ekranda gösterilen reaktifleri birleştirerek belirli sayıda sindirim reaksiyonu için bir ana karışım hazırlayın. Uygun şekilde etiketlenmiş 0,2 mililitrelik tüpleri buz üzerinde bir alüminyum soğutma bloğuna yerleştirin. Uygun miktarlarda CAS9, sgRNA, 10, CAS9 tamponu ve DEPC arıtılmış suyu karıştırarak ana karışımı N sayıda reaksiyon için hazırlayın. Ana karışımı iyice karıştırın ve döndürün. Her bir reaksiyon tüpüne ana karışımın 3.75 mikrolitresini ayırın. İyice karıştırılmış her tüpe 0.75 mikrolitre 0.03 mikromolar PLX 304 ORF plazmidi ekleyin ve tüpleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. 0.14 mikrolitre 3.36 mikromolar doğrusallaştırılmış pBIDC-UASC-pLXvect ve 1.8 mikrolitre Gibson montaj ana karışımını birleştirerek bir ana karışım hazırlayın. Ana karışımı iyice karıştırın ve döndürün. Şimdi her tüpe 1.94 mikrolitre ana karışım ekleyin. Her tüpe 1.66 mikrolitre CAS9 bölünmüş plazmit ekleyin. İyice karıştırın ve 50 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Bakteri yetkin hücreleri buz üzerinde çözün. Çözülmüş hücrelerin 10 mikrolitresini önceden soğutulmuş her 1.5 mililitrelik tüpe ayırın. 10 mikrolitre yetkin hücreyi bir mikrolitre Gibson montaj ürünü ile yavaşça karıştırın. Tüpleri 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Tüpleri bir dakika boyunca 42 santigrat derecede ısıtın ve ardından iki dakika buz üzerinde soğutun. Her tüpe 100 mikrolitre önceden ısıtılmış SOC ortamı ekleyin ve 250 santigrat derecede bir saat boyunca 37 RPM'de çalkalayın. Son olarak, hücreleri mililitre başına 15 mikrogram kloramfenikol içeren LB agar plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu şekil, CRISPRshuttle sistemi kullanılarak üretilen UAS-cDNA/ORF plazmitlerinin kısıtlama analizinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Bu analizde, PVU2 ile 15 UAS-cDNA/ORF yapısının kısıtlama sindirimi, tüm numunelerin yaklaşık 1072 baz çifti ve 1.820 baz çiftinde beklenen fragman modellerini sergilediğini ortaya çıkardı.