Name: CRISPR Tabanlı Mekik Klonlama: Yüksek Verimli Bir Klonlama Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Öğrenin, CRISPR tabanlı mekik klonlama yöntemiyle PCR amplifikasyonu olmadan DNA fragmentlerini vektörler arasında yüksek verimli aktarma. Bu yenilikçi teknik genetik mühendisliği çalışmalarında zaman ve kaynak tasarrufu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar Tozu</td><td>Kimya tabanı</td><td>KBS-001H Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sangon Belediyesi</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Dijital Jel Görüntü Analiz Sistemi</td><td>Tanon</td><td>Tanon-2500B</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sangon Belediyesi</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Omega</td><td>D2500-02 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plazmid DNA Mini Kiti I</td><td>Omega</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF Serisi</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Montaj Ana Karışımı</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Hızlı Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti</td><td>NEB</td><td>E2050 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Düzeneği Ana Karışımı</td><td>NEB</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>PCR Termal Döngüleyici</td><td>Uzun Gen</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>Platin SuperFi II DNA Polimeraz</td><td>Termo Bilimsel</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli 2x Ana Karışım</td><td>NEB</td><td>M0494 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>GenScript</td><td>Z03386 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama İnkübatörü</td><td>Zhichu Hakkında</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Şimadzu</td><td>BioSpec-nano</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>Promega</td><td>M1801 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 Kimyasal Olarak Yetkin Hücre</td><td>TransGen</td><td>CD101-02 (İngilizce)</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Oksoid</td><td>LP0042 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Oksoid</td><td>LP0021 Serisi</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr tabanlı mekik klonlama: yüksek verimli bir klonlama yöntemi

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

Drosophila7'de<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68503/68503fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68503/68503fig01large.jpg" target="_blank"></a><p class="jove_content biglegend" fo:keep-toge...

CRISPR Tabanlı Mekik Klonlama: Yüksek Verimli Bir Klonlama Yöntemi

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

Yüksek verimli bir klonlama yöntemi olan CRISPRshuttle için protokolümüzü açıklıyoruz. Bu, DNA fragmanlarının PCR amplifikasyonuna gerek kalmadan hedef DNA fragmanlarının vektörler arasında transferini içerir. Ağ geçidi infüzyonu ve tek vektör klonlama PCR amplifikasyonu gibi mevcut teknikler. Bu yaklaşım, birincil tasarım ve sekresyon doğrulaması dahil olmak üzere parçaya özgü prosedürleri gerektirir. Bu etiketler emek yoğun ve zaman alıcıdır. CRISPR mekiği, hedef DNA parçalarını vektörler arasında sıralı test tüpü reaksiyonlarına aktarırken PCR'yi ortadan kaldırır. Bu yöntem, parçaya özel işleme ihtiyacını ortadan kaldırır ve böylece numune yapımını hızlandırır.[Anlatıcı] Başlamak için, ekranda gösterilen reaktifleri birleştirerek belirli sayıda sindirim reaksiyonu için bir ana karışım hazırlayın. Uygun şekilde etiketlenmiş 0,2 mililitrelik tüpleri buz üzerinde bir alüminyum soğutma bloğuna yerleştirin. Uygun miktarlarda CAS9, sgRNA, 10, CAS9 tamponu ve DEPC arıtılmış suyu karıştırarak ana karışımı N sayıda reaksiyon için hazırlayın. Ana karışımı iyice karıştırın ve döndürün. Her bir reaksiyon tüpüne ana karışımın 3.75 mikrolitresini ayırın. İyice karıştırılmış her tüpe 0.75 mikrolitre 0.03 mikromolar PLX 304 ORF plazmidi ekleyin ve tüpleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. 0.14 mikrolitre 3.36 mikromolar doğrusallaştırılmış pBIDC-UASC-pLXvect ve 1.8 mikrolitre Gibson montaj ana karışımını birleştirerek bir ana karışım hazırlayın. Ana karışımı iyice karıştırın ve döndürün. Şimdi her tüpe 1.94 mikrolitre ana karışım ekleyin. Her tüpe 1.66 mikrolitre CAS9 bölünmüş plazmit ekleyin. İyice karıştırın ve 50 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Bakteri yetkin hücreleri buz üzerinde çözün. Çözülmüş hücrelerin 10 mikrolitresini önceden soğutulmuş her 1.5 mililitrelik tüpe ayırın. 10 mikrolitre yetkin hücreyi bir mikrolitre Gibson montaj ürünü ile yavaşça karıştırın. Tüpleri 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Tüpleri bir dakika boyunca 42 santigrat derecede ısıtın ve ardından iki dakika buz üzerinde soğutun. Her tüpe 100 mikrolitre önceden ısıtılmış SOC ortamı ekleyin ve 250 santigrat derecede bir saat boyunca 37 RPM'de çalkalayın. Son olarak, hücreleri mililitre başına 15 mikrogram kloramfenikol içeren LB agar plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu şekil, CRISPRshuttle sistemi kullanılarak üretilen UAS-cDNA/ORF plazmitlerinin kısıtlama analizinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Bu analizde, PVU2 ile 15 UAS-cDNA/ORF yapısının kısıtlama sindirimi, tüm numunelerin yaklaşık 1072 baz çifti ve 1.820 baz çiftinde beklenen fragman modellerini sergilediğini ortaya çıkardı.

crispr-based-shuttle-cloning-a-high-throughput-cloning-method

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Gen hedefleme metodolojileri, nakavt, knock-in ve etiketli alellere sahip transgenik fareler oluşturmak için kullanılabilir.  Burada, E. coli'de, özel gen hedefleme vektörlerini hızlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek 'alt klonlama artı ekleme' olarak adlandırdığımız gelişmiş bir yeniden birleştirme yöntemini açıklıyoruz.

Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Bu protokol, CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanarak çoklu gen nakavtları yaratmada özel olarak kullanılan bir kılavuz RNA konformemer vektörüne birden fazla tekli kılavuz RNA'yı klonlamak için gereken aşamaları açıklar. Bağırsak organoitlerinde çift nakavt üretimi bu yöntemin olası bir uygulaması olarak gösterilmiştir.

Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü

Burada, bir basit, verimli ve sgRNA klonlama düşük maliyetli yöntemi anlattı.

CRISPR Kılavuzu RNA memeli sistemler için klonlama

Bu el yazması için basit ve ivedi soruşturma akut miyeloid lösemi (AML) hücre çoğalması içinde birden çok aday genlerin rolünün bir kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemi açıklar paralel. Bu teknik ölçeklenebilir ve de diğer kanser hücre hatlarında uygulanabilir.

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Bu protokol, akustik damlacık fırlatma teknolojisini kullanarak 384-Well plakasında memelinin hücrelerinin yüksek verim Plasmid transfeksiyonunu açıklar. Zaman alıcı, hataya eğilimli DNA dağıtımı ve çoğullama, aynı zamanda transfeksiyon reaktif dispenpleme, yazılım odaklı ve bir nanodispenser cihaz tarafından gerçekleştirilir. Hücreler daha sonra bu önceden doldurulmuş kuyuların içinde tohumlandı.

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

CRISPR-Cas sistemleri ve anti-CRISPR proteinleri, Saccharomyces cerevisiae'deki Boole kapılarının şemasına entegre edildi. Yeni küçük mantık devreleri iyi performans gösterdi ve hem dCas9 / dCas12a tabanlı transkripsiyon faktörlerinin hem de anti-CRISPR proteinlerinin özelliklerinin anlaşılmasını derinleştirdi.

CRISPR-Cas Sistemlerine ve Anti-CRISPR Proteinlerine Dayalı Gen Dijital Devreleri

Halka açık cDNA/ORF kaynaklarını kullanarak Drosophila'daki UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli inşası için bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass) için bir protokol sunuyoruz. CRISPRmass, çeşitli plazmit kütüphanelerini düzenlemek için uygulanabilir.

UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli yapısı için CRISPR tabanlı modüler montaj

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Öğrenin, CRISPR tabanlı mekik klonlama yöntemiyle PCR amplifikasyonu olmadan DNA fragmentlerini vektörler arasında yüksek verimli aktarma. Bu yenilikçi teknik genetik mühendisliği çalışmalarında zaman ve kaynak tasarrufu sağlar.

CRISPR Tabanlı Mekik Klonlama: Yüksek Verimli Bir Klonlama Yöntemi

Daha fazla video keşfet