Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Tomurcuklanan maya Croce Visi, yaşlanma biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu makalede, maya ana hücrelerinin replikatif ömrünü ölçmek için genel bir protokol sunuyoruz. Merhaba, ben Washington Üniversitesi Biyokimya Bölümü'ndeki Brian Kennedy laboratuvarından Kristen Steffen.

Bugün size maya ana hücrelerinin replikatif yaşam süresini ölçme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, maya hücrelerinin yaşam süresini etkileyen genleri incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse hadi başlayalım.

Replikatif yaşam süresi deneyi ve yaşam süresi analizi için maya hücrelerinin hazırlanması amacıyla, katı YEPD plakalarının hazırlanması gerekmektedir. Bu YEPD agar plakalarını hazırlamak için uygun steril teknikleri kullanın. Yaşam süresi deneyinde analiz edilecek her dört ila beş suş için en az iki plaka hazırlayın.

Bu plakalar, yaşam süresi deneyinden en az iki gün önce hazırlanmalı ve yaşam süresi analizi başlamadan önce kurumaya bırakılmalıdır. Deney, plakaların dökülmesinden sonraki dört ila beş gün içinde gerçekleştirilmeyecekse, kurumasını önlemek için plakalar parafilm veya plastik ile sarılıp soğutmalı bir inkübatöre yerleştirilmelidir. Maya suşları dondurulmuş stoklardan çıkarılmalı ve tekil koloniler elde etmek için ekilmelidir.

YEPD agar plaklarının üzerine. Plak aynı büyüklükteki pasta dilimi şeklinde bölmelere ayrılarak, aynı YEPD plağına altı suşa kadar kolayca ekim yapılabilir. Hücreleri 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sonrası hücreleri inkübatörden çıkarın ve tek bir kolonideki hücreleri taze bir YEPD plakasına ekleyin. Bu aşamada, replikatif yaşam süresi deneyinin körleme yöntemle gerçekleştirilmesini sağlamak için analiz edilecek suşlar kaplanmalıdır. Böylece disektörler, münferit suşların kimliklerini bilmezler.

Ardından, yamalanmış kaplı hücreleri ertesi akşama kadar 30 °C'de inkübe edin. Hücreleri çıkarın ve her bir kaplı suştan taze YEPD plaklarına hafifçe yamalayın. Bunlar, replikatif yaşam süresi için kullanılan deneysel plaklar olarak hizmet edecektir.

Analiz hücreleri, YEPD plağının sol tarafında dikey bir hat boyunca ekilmelidir. Tek bir taze YEPD plağına çok fazla hücre aktarmayın. Bu durum, gece boyu süren inkübasyon sırasında hücrelerin aşırı yoğun büyümesine neden olarak replikatif yaşam sürelerini etkileyeceğinden, plak başına yaklaşık üç ila beş ekim alanı optimaldir.

Her yamadan 20 hücre üzerinde replikatif yaşam süresi analizi yapılacağı varsayılarak, yaşam süresi deneyi şu an tamamen kurulmuştur ve yapılması gereken tek şey örnekleri tezgah üzerinde gece boyunca inkübe etmektir. Ardından, maya hücrelerini plaka üzerine yerleştirmek ve replikatif yaşam süresi analizi için bakire kız hücreler elde etmek amacıyla yarın mikro diseksiyona başlayabiliriz.

Maya için uygun bir mikro diseksiyon cihazı ile donatılmış bir mikroskop kullanın. İlk yama suşundan yaklaşık 50 hücreyi, plaka üzerinde yamalı hücrelerin uzağındaki bir konuma aktarın. Mikroskop tablası dereceli ise, sonraki tekrarlar sırasında hücrelerin kolayca bulunmasını sağlamak için bu dereceler kullanılabilir.

Hücreler bazen iğneye takılabilir ve bu hücrelerin yanlış zamanda çıkması sorun teşkil edebilir. İğnenin temiz olduğundan ve hücrelerden arındırıldığından emin olmak için iğneyi tekrar tekrar agar yüzeyine değdirin. Ardından, iğneyi agar yüzeyine bastırarak agar içerisinde bir delik oluşturun.

Bu delik, diseksiyonun ve dotter hücre çıkarımının sonraki tekrarları sırasında plak üzerinde yönünüzü belirlemenize yardımcı olacak bir işaretçi görevi görecektir. Deliğin içine maya hücrelerinin kaçmamasına dikkat edin, aksi takdirde bu hücreler büyüyerek deliğin hemen üzerinde bir koloni oluşturacaktır. Tekil maya hücrelerini, her hücre konumu arasında bir ila üç iğne çapı olacak şekilde, dikey olarak hizalanmış 20 eşit aralıklı konuma yerleştirin.

Her birkaç hücre için, hatta aynı konumda tek bir hücre yerine yan yana iki hücre yerleştirin. Bu, bakire kız hücre seçimi sırasında yedeklilik sağlar. Aktarılan hücrelerden biri hattaki 10. ve 11. konumlar arasında bölünmezse, agarda yedi ila sekiz delikten oluşan yatay bir seri oluşturun.

Bu, sonraki diseksiyonlar ve yavru hücre çıkarmaları sırasında plaka üzerindeki konumunuzu belirlemek için bir işaret görevi görecektir. Yine, deliklere maya hücresi kaçmamasına dikkat edin, aksi takdirde hücreler büyüyüp koloni oluşturacaktır. Bu prosedürü plaka üzerindeki her yama için tekrarlayarak, hücreleri aynı eksen boyunca dikey olarak dizmeye devam edin.

AER'de delik açarken, ilk yama için bir delik ve ikincisi için iki delik olacak şekilde, açılan delik sayısının yama numarasına karşılık gelmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Hücreler her yama için dizildikten sonra, plakayı parafilmlendirin ve yaklaşık iki saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Unutmayın, bu noktadan itibaren, diseksiyon işlemi uygulananlar hariç tüm plakalar parafilmli olmalıdır.

Kurumayı önlemek için, bu prosedürü her plaka için tekrarlayın. Deneyde, yaşam süresi analizi için her hücrenin bakire bir yavru hücre olarak başladığından emin olmak önemlidir.

Bunu yapmak için öncelikle plakaları inkübatörden çıkarın ve dizi hücrelerinin çoğunun hücre bölünmesi geçirdiğini doğrulayın. Burada gördüklerimiz, daha önce hizalanmış hücrelerdir ve inkübatörde iki saat geçirdikten sonra bölünmeye başladıklarını görebilirsiniz. Artık gövdesine bağlı olan daha büyük ana hücreye ve bakire kız hücreye sahibiz; bu bakire kız hücre, yaşam süresini başlatmak için kullanılacak olan hücredir.

Hücre bölünmelerinin tamamlanması için ek süreye ihtiyaç duyulursa, plakayı inkübatöre geri yerleştirin. İlk dizi hücresinden başlayarak, iğneyi yapışık hücrelerin üzerine nazikçe yerleştirerek iğne yardımıyla yavru hücreleri ana hücreden ayırın.

İğne hücrelerin üzerinde dinlenirken, mikroskop tabanının yanına hafifçe vurmak bazen faydalı olabilir. Ardından, ayrılan yavru hücreyi, ana hücrenin ve varsa diğer yavru hücrelerin yerini alacak şekilde hücrelerin dikey hattına yerleştirin ve onları geçici olarak yana kaydırın. Bu adımları dizideki her bir hücre için tekrarlayın.

Eğer bir hücre bölünmezse, test hücresinin yanındaki yedek hücrelerden birinden bir yavru hücre alın. İşlem bittiğinde, yaşam süresi plağında dikey olarak hizalanmış her yama için 20 yavru hücreniz olmalıdır. Tüm ana hücreleri ve fazla yavru hücreleri bir araya toplayın ve onları yamaların yakınındaki "mezarlığa" (graveyard) adı verilen bölgeye geri aktarın.

Mikro kolonilerin oluşmasını ve lokal besinlerin tükenmesini önlemek için, istenmeyen hücreleri yaşam süresi analizi yapılan hücrelerden uzak tutmak önemlidir. Hücreler ayrıldıktan sonra, plakayı çıkarın ve yaklaşık iki saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Bu adımları deneydeki her bir plaka için tekrarlayın.

Bireysel hücrelerin replikasyon kapasitesini ölçmek için yaşam süresi veri sayfaları hazırlamanız gerekecektir. Yaşam süresi veri sayfası, her satırın tek bir ana hücreye ve her sütunun bir yaş noktasına karşılık geldiği basit bir tablo olabilir. Her bir veri sayfasını, analiz edilecek suş sayısına göre etiketlediğinizden emin olun.

Başlamak için, önce plakaları inkübatörden çıkarın ve dizi hücrelerinin çoğunun en az bir hücre bölünmesi geçirdiğini doğrulayın. Hücre bölünmesinin tamamlanması için ek süreye ihtiyaç duyulursa, plağı inkübatöre geri yerleştirin. İlk plaktaki ilk dizi hücresinden başlayarak, meydana gelen hücre bölünmelerinin sayısını belirlemek için ana ve yavru hücreyi veya hücreleri görsel olarak gözlemleyin.

Hücre düzenlemelerinin karakteristik modellerine dayanarak, bir ana hücrenin kaç tane yavru hücre ürettiğini belirlemek genellikle kolaydır. Burada kaç hücre üretildiğini görmek gerçekten basittir çünkü orada iki hücre bulunmaktadır, bunlar aynı boyuttadır ve her ikisi de ana hücreden daha küçüktür. Ana hücre tarafından üretilen yavru hücre sayısını, yaşam süresi skor çizelgesindeki uygun kutucuğa kaydedin.

Ardından, iğneyi yapışık hücrelerin üzerine nazikçe yerleştirip iğne hücrelerin üzerindeyken mikroskop tabanının yanına hafifçe vurarak, daha önce açıklandığı şekilde yavru hücreleri ana hücreden ayırmak için iğneyi kullanın. Ana hücreyi dikey hattaki konumunda tutun ve yavru hücreyi veya hücreleri geçici olarak kenara kaydırın. Bu adımları dizideki hücrelerin her biri için tekrarlayın.

Son olarak, tüm elenen yavru hücreleri toplayın ve orijinal yamaların yanındaki mezarlığa taşıyın. Plakayı parafilmi ile kapatın ve 30 °C'de iki ila üç saat inkübe edin. Yavru hücrelerin elenmesi ve inkübasyon işlemini tekrarlayın.

Deneydeki her bir plaka için izlenecek adım. Bu prosedürün tamamını, tüm ana hücreler bölünmeyi bırakana kadar tekrarlayın. Ana hücreler yaşlandıkça hücre döngüsü ilerlemesinin yavaşladığını ve bu nedenle yaş noktaları arasında plakaların daha uzun süre inkübe edilmesinin uygun olacağını unutmayın; sonrasında plakalar gece boyunca dört derece Celsius'ta saklanabilir.

Bir replikatif yaşam süresi deneyinde elde edilen ham veriler, her bir ana hücrenin her bir yaş noktasında ürettiği yavru hücrelere karşılık gelen bir sayılar listesidir. Burada görüldüğü gibi, skor çizelgesinin her bir satırı toplanarak her bir ana hücre için replikatif yaşam süresi elde edilir.

Aynı deney grubundaki diğer hücrelerden elde edilen veriler, bir sağkalım eğrisi oluşturmak ve istatistiksel hesaplamalar yapmak için birleştirilebilir. Eğri, düşük erken ölüm oranını takip eden, ardından sağkalımda nispeten hızlı bir düşüş ve ileri yaşlarda eğrinin düzleşmesini gösteren sigmoidal bir şekille Gompertz Mac am kinetiğiyle kabaca uyumlu olmalıdır. Size maya replikatif ömür deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, hücrelerin soğuk ortamda olmadıkları her an bölünmeye devam edeceklerini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, sabah saymanız gereken çok fazla yavru hücre ile karşılaşmamak için plakaları gece boyunca 4 °C'de beklettiğinizden emin olun. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.