Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Tomurcuklanan maya Croce Visi, yaşlanma biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yazıda, maya ana hücrelerinin replikatif ömrünü ölçmek için genel bir protokol sunuyoruz. Merhaba, ben Washington Üniversitesi Biyokimya Bölümü'nde Brian Kennedy'nin laboratuvarından Kristen Steffen.

Bugün size maya ana hücrelerinin replikatif ömrünü ölçmek için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, maya hücrelerinin ömrünü etkileyen genleri incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Replikatif ömür deneyi ve ömür boyu analizi için maya hücrelerinin hazırlanması için, bunu yapmak için katı YEPD plakalarının hazırlanması gerekir. Bu YEPD agar plakalarını hazırlamak için uygun steril teknik kullanın. Kullanım ömrü deneyinde analiz edilecek her dört ila beş suş için en az iki plaka hazırlayın.

Bu plakalar, kullanım ömrü deneyinden en az iki gün önce hazırlanmalı ve yaşam süresi testine başlamadan önce kurumaya bırakılmalıdır. Deney, plakaların dökülmesinden sonraki dört ila beş gün içinde gerçekleşmeyecekse, kurumayı önlemek için para film veya plastiğe sarılmalı ve soğutmalı bir inkübatöre yerleştirilmelidir. Maya suşlarını donmuş stoklardan çıkarın ve tek koloniler için çizgi çizin.

YEPD agar plakalarına. Plakayı eşit büyüklükte pasta şeklinde takozlara bölerek aynı YEPD plakası üzerinde altı adede kadar suş kolayca çizilebilir. Hücreleri iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri tek bir koloniden taze bir YEPD plakasına yamalayın. Bu sırada, replikatif ömür deneyinin kör olarak yapıldığından emin olmak için analiz edilecek suşlar kaplanmalıdır. Disektörlerin bireysel suşların kimliğini bilmediği yerlerde. Zincir.

Daha sonra, yamalı kaplanmış hücreleri ertesi akşama kadar 30 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri çıkarın ve kaplanmış her suştan hücreleri taze YEPD plakalarına hafifçe yamalayın. Bunlar, replikatif kullanım ömrü için kullanılan deney plakaları olarak hizmet edecektir.

Analiz hücreleri, YEPD plakasının sol tarafındaki dikey bir çizgi boyunca yamalanmalıdır. Tek bir taze YEPD plakasına çok fazla hücre aktarmayın. Bu, gece boyunca inkübasyon sırasında hücrelerin kalın büyümesine neden olacağından ve replikatif ömürlerini etkileyeceğinden, plaka başına yaklaşık üç ila beş yama en uygunudur.

Her yamadan 20 hücre üzerinde replikatif ömür analizi yapılacağını varsayarsak, Şimdi ömür deneyi tamamen kuruldu ve tek yapmaları gereken gece boyunca tezgah üstünde kuluçkaya yatırmak. Ve sonra yarın mikro diseksiyona başlayabiliriz: Maya hücrelerini plakaya yerleştirmek ve bakire yavru hücreler elde etmek için. Replikatif kullanım ömrü analizi için.

Maya için uygun bir mikro diseksiyon aparatı ile donatılmış bir mikroskop kullanın. İlk yama suşundan yaklaşık 50 hücreyi, yamalı hücrelerin distalindeki plaka üzerindeki bir konuma aktarın. Mikroskop aşamanız derecelendirilmişse, bu derecelendirmeler, sonraki yinelemeler sırasında hücrelerin bulunmasının kolay olmasını sağlamak için kullanılabilir.

Bazen hücreler iğneye sıkışabilir, bu da yanlış zamanda çıkarlarsa sorun olabilir. İğnenin temiz olduğundan ve hücre içermediğinden emin olmak için, agar yüzeyine tekrar tekrar dokundurun. Daha sonra iğneyi agar yüzeyinden geçirerek agarda bir delik oluşturun.

Bu delik, sonraki diseksiyon ve nokta hücresi çıkarma yinelemeleri sırasında sizi plaka üzerinde yönlendirmek için bir işaretleyici görevi görecektir. Maya hücrelerini deliğe sokmamaya dikkat edin, aksi takdirde büyürler ve deliğin hemen üzerinde bir koloni oluştururlar. Tek tek maya hücrelerini, her hücre konumu arasında bir ila üç iğne çapı olacak şekilde 20 eşit aralıklı konuma dikey olarak hizalayın.

Her birkaç hücre için, satırda bir yerine aynı konumda iki hücreyi yan yana yerleştirin. Bu, bakire yavru hücre seçimi sırasında yedekliliğe izin verir. Aktarılan hücrelerden biri hattaki 10. ve 11. pozisyonlar arasında bölünemezse, agarda yedi ila sekiz delikten oluşan yatay bir dizi oluşturun.

Bu, sonraki diseksiyonlar ve yavru hücre çıkarmaları sırasında sizi plaka üzerinde yönlendirmek için bir işaretleyici görevi görecektir. Yine, maya hücrelerini deliklere sokmamaya dikkat edin, aksi takdirde büyürler ve bir koloni oluştururlar. Plakadaki her yama için bu prosedürü tekrarlayın ve hücreleri aynı eksen boyunca dikey olarak dizmeye devam edin.

AER'de delik oluştururken, oluşturulan delik sayısının yama numarasına karşılık geldiğini hatırlamak önemlidir, böylece ilk yama için bir delik ve ikincisi için iki delik vardır. Hücreler her yama için dizildikten sonra, plakayı paraform haline getirin ve yaklaşık iki saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Unutmayın, bu noktadan sonra, diseksiyon dışında tüm plakalar para-filme alınmalıdır.

Kurumayı önlemek için, her plaka için bu işlemi tekrarlayın. Deneyde. Yaşam süresi analizi için, her hücrenin bakire bir yavru hücre olarak başladığından emin olmak önemlidir.

Bunu yapmak için önce plakaları inkübatörden çıkarın ve dizi hücrelerinin çoğunun bir hücre bölünmesi geçirdiğini doğrulayın. Burada daha önce hizalanmış hücreler var ve gördüğünüz gibi kuvözde iki saat kaldıktan sonra bölünmeye başlamışlar. Ve şimdi bir ana hücremiz var, daha büyük olanı vücuduna bağlı, bakire kız hücresi ve bu bakire yavru hücre, yaşam süresini başlatmak için kullanılacak bir hücre.

Hücre bölünmelerinin tamamlanmasına izin vermek için ek zamana ihtiyaç duyulursa, plakayı inkübatöre geri koyun. İlk dizi hücresinden başlayarak. İğneyi bağlı hücrelerin üzerine nazikçe yerleştirerek yavru hücreleri ana hücreden ayırmak için iğneyi kullanın.

İğne hücrelerin üzerinde dururken mikroskop tabanının yan tarafına hafifçe vurmak bazen yardımcı olabilir. Daha sonra, ayrılmış yavru hücreyi, ana hücreyi ve ek yavru hücreleri değiştirerek ve geçici olarak bir kenara çekerek dikey hücre sırasına yerleştirin. Dizi hücrelerinin her biri için bu adımları yineleyin.

Bir hücre bölünemezse, test hücresinin yanında bulunan gereksiz hücrelerden birinden bir yavru hücre alın. Bitirdiğinizde, kullanım ömrü plakası üzerinde dikey olarak hizalanmış her yama için 20 yavru hücreniz olmalıdır. Tüm ana hücreleri ve fazladan yavru hücreleri bir yığın halinde toplayın ve bunları mezarlık adı verilen yamaların yakınındaki bir alana geri aktarın.

Mikro kolonilerin oluşumunu ve yerel besin maddelerinin tükenmesini önlemek için istenmeyen hücreleri yaşam süresi analizinden geçen hücrelerden uzak tutmak önemlidir. Hücreler ayrıldıktan sonra, plakayı ayırın ve yaklaşık iki saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Deneydeki her plaka için bu adımları tekrarlayın.

Tek tek hücrelerin çoğaltma kapasitesini ölçmek için yaşam süresi veri sayfaları hazırlamanız gerekir. Bir yaşam süresi veri sayfası, her satırın tek bir ana hücreye karşılık geldiği ve her sütunun bir yaş noktasına karşılık geldiği basit bir ızgara olabilir. Her veri sayfasını analiz edilecek suş sayısına göre etiketlediğinizden emin olun.

Başlamak için, önce plakaları inkübatörden çıkarın ve dizi hücrelerinin çoğunun en az bir hücre bölünmesi geçirdiğini doğrulayın. Hücre bölünmesinin tamamlanmasına izin vermek için ek zamana ihtiyaç duyulursa, plakayı inkübatöre geri koyun. İlk plakadaki ilk dizi hücresiyle başlayın ve meydana gelen hücre bölünmelerinin sayısını belirlemek için anne ve kızı, hücreyi veya hücreleri görsel olarak gözlemleyin.

Bir annenin karakteristik hücre düzenlemelerine dayanarak kaç tane yavru hücre ürettiğini belirlemek genellikle kolaydır. Bu, kaç hücre ürettiğini görmek gerçekten çok basit çünkü orada iki tane var ve aynı büyüklükte ve ikisi de anneden daha küçük. Ana hücre tarafından üretilen yavru hücrelerin sayısını, yaşam süresi puan sayfasındaki uygun kutuya kaydedin.

Daha sonra, iğneyi bağlı hücrelerin üzerine nazikçe yerleştirerek ve iğne hücrelerin üzerinde dururken mikroskop tabanının yan tarafına vurarak, daha önce tarif edildiği gibi yavru hücreleri ana hücreden ayırmak için iğneyi kullanın. Ana hücreyi dikey çizgideki konumunda tutun ve yavru hücreyi veya hücreleri geçici olarak kenara çekin. Dizi hücrelerinin her biri için bu adımları yineleyin.

Son olarak, atılan tüm yavru hücreleri toplayın ve onları orijinal yamaların yakınında bulunan mezarlığa taşıyın. Plakayı filme alın ve iki ila üç saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Yavru hücrelerin atılmasını ve inkübasyonu tekrarlayın.

Deneydeki her plaka için adım atın. Tüm ana hücreler bölünmeyi durdurana kadar tüm bu prosedürü tekrarlayın. Ana hücreler yaşlandıkça, hücre döngüsü ilerlemesinin yavaşladığını ve daha sonra plakanın yaş noktaları arasında daha uzun süre inkübe edilmesinin arzu edileceğini, plakaların gece boyunca dört santigrat dereceye yerleştirilebileceğini unutmayın.

Replikatif bir yaşam süresi deneyi tarafından üretilen ham veriler, her bir ana hücre tarafından her yaş noktasında üretilen yavru hücrelere karşılık gelen sayıların bir listesidir. Burada görüldüğü gibi. Puan tablosunun her satırını toplayarak, her bir ana hücre için replikatif ömür elde edilir.

Aynı deney grubundaki diğer hücrelerden gelen veriler, bir hayatta kalma eğrisi oluşturmak ve istatistiksel hesaplamalar yapmak için bir araya getirilebilir. Eğri, Gomperts Mac kinetiği ile kabaca tutarlı olmalı, düşük erken mortalite ile sigmoidal bir şekil göstermeli, ardından sağkalımda nispeten hızlı bir düşüş ve daha sonraki yaşlarda eğrinin düzleşmesi izlemelidir. Size az önce bir maya replikatif ömür deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, hücrelerin soğukta olmadıklarında bölünmeye devam edeceklerini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, plakaları gece boyunca dört dereceye koymayı unutmayın, böylece sabahları sayılamayacak kadar çok yavru hücreniz olmaz. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.