Name: Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Öğrenin, maya ana hücrelerinin replikatif ömrünü ölçmek için kullanılan güvenilir protokolü. Bu yöntem, Saccharomyces cerevisiae kullanarak yaşlanma mekanizmalarını ve genetik faktörleri incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, MK ve BKK Ellison Tıp Vakfı için bir hibe ile desteklenmiştir. MK Yaşlanma Ellison Tıp Vakfı Yeni Scholar. Biz çekimler sırasında yardım almak için Soumya&#39;den Kotireddy teşekkür etmek istiyorum.

Bölüm 1: replikatif ömrü analizi için suşları ve plakalar hazırlayın Bu bölümde, replikatif ömrü deneyi ve ömrü analiz için maya hücreleri hazırlanmasında kullanılmak üzere sağlam YEPD tabak hazırlanması açıklamaktadır. <ol><li> Uygun steril tekniği kullanarak, kültür maya hücreleri ve replikatif ömrü analizi için kullanılacaktır YEPD agar plakları (% 1 maya özü,% 2 bacto-pepton,% 2 agar,% 2 glukoz) hazırlar. Ömrü deneyi analiz edilmesi için her 4-5 suşları için en az 2 tabak hazırlamak gerekir. Plakalar ömrü deneyden önce en az 2 gün önce hazırlanan ve ömrünü tahlil başlamadan önce kurumasına izin olmalıdır. Deney plakaları dökme 4-5 gün içinde yapılması durumunda, soğutmalı inkübatör yerleştirilir ve parafilm sarılmış veya kuruma önlemek için plastik olmalıdır. </li><li> YEPD agar plakları üzerine tek koloniler için dondurulmuş hisse senetleri ve çizgi maya suşları çıkarın. 6 suşları kolayca eşit büyüklükteki pasta şeklinde takozlar plaka bölümleme aynı YEPD plaka çizgili olabilir. </li><li> Hücreler, 2 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Inkübatör ve tek bir koloni yama hücreleri hücreleri, taze bir YEPD tabağa çıkarın. Iki farklı koloniler İki yamalar her bir suş için oluşturulan olmalıdır. Bu zamanda, analiz edilecek suşların dissectors bireysel suşlarının kimliğini bilmiyorum replikatif ömrü deney, &quot;kör&quot; yapılır sağlamak için kodlanmış olmalıdır. </li><li> Aşağıdaki akşama kadar 30 yamalı, kodlu hücreleri ° C inkübe edin. </li><li> Replikatif ömrü analizi için kullanılan deneysel bir tabak olarak hizmet verecek taze YEPD plakaları her kodlu gerginlik hücreleri ve hafifçe yama hücreleri çıkarın. Hücreler YEPD plaka (Şekil 1) sol tarafta dikey bir çizgi boyunca yamalı olmalıdır. Plaka başına yaklaşık 3-5 yamalar her yama 20 hücre replikatif ömrü analizi varsayarak, en uygunudur. Bu hücrelerin sonraki replikatif ömrü sınırlayabilir gecelik inkübasyon sırasında kalın büyümeye neden olarak, taze YEPD plaka hücrelerin çok sayıda transfer etmek için (ne de arzu edilir) gerekli değildir. </li><li> Geceleme tezgah üstüne taze yamalı plakaları inkübe edin. </li></ol> Bölüm 2: replikatif ömrü analizi için pozisyon hücreleri. Bu bölümde, maya hücreleri ve plaka nasıl replikatif ömrü analizi için bakire kızı hücreleri elde etmek için nasıl konumlandırmak için açıklar. Bu noktadan itibaren, tüm plakaları kuruma önlemek için diseksiyonu uygulanan durumlar dışında, parafilmed olmalıdır. <ol><li> Maya uygun bir mikrodiseksiyon cihazları ile donatılmış bir mikroskop kullanarak ilk yamalı gerginlik yaklaşık 50 hücreleri, yamalı hücreleri distal plaka bir konuma aktarın. Mikroskop sahne derecelendirildi ise hücreleri sonraki iterasyon sırasında bulmak kolay olacak, bu geçişleri sağlamak için kullanılabilir. Zeiss Axioscope 40, ilk yamalı gerginlik hücreleri koordinatları 90 x 10 yerleştirilir ve oradan dikey olarak dizilmiş. </li><li> Art arda agar yüzeyine dokunarak hücre iğne temizleyin, sonra agar agar yüzeyi boyunca iğne zorlayarak bir delik oluşturmak. Bu delik, diseksiyon ve yavru hücre çıkarılması sonraki iterasyon sırasında plaka üzerinde yönlendirmek sizin için bir işaretleyici olarak hizmet edecektir. Delik maya hücreleri elde etmek için ya da büyüyecek ve bir koloni formu dikkatli olun. </li><li> Doğrudan delik üzerinde, dikey, her hücre pozisyonlar (Şekil 1) arasında 1-3 iğne çapları (~ 100 mcM), 20 eşit aralıklı pozisyonlara bireysel maya hücreleri hizalamak. Her birkaç hücreler, birbirine bitişik iki hücre yerine birden paralel olarak aynı konumda yerleştirin. Devredilen hücreleri bölmek için başarısız olursa, bu, bakire kızı hücre seçimi sırasında artıklık sağlar. </li><li> 10. ve 11. pozisyonu doğrultusunda arasında, agar 7-8 delik yatay bir dizi oluşturmak. Bu diseksiyon ve yavru hücre çıkarılması sonraki iterasyon sırasında plaka yönlendirmek sizin için bir işaretleyici olarak hizmet verecek. Deliklere maya hücreleri elde etmek için ya da büyüyecek ve bir koloni formu dikkatli olun. </li><li> Tekrar aynı eksen boyunca dizi hücreleri dikey devam plaka üzerinde her yama için 2,1-2,4 adımları. 2.2 adım için, oluşturulan delik yama sayısı (ilk yama için bir delik, ikincisi için iki delik, vb.) Uygun olmalıdır. </li><li> Bir keresinde hücreleri parafilm plaka ve inkübe 30 ° C yaklaşık 2 saat boyunca, her yama için dizilmiş edilmiştir. </li><li> Deneyde, her plaka için 2,1-2,6 adımları tekrarlayın. </li></ol> Bölüm 3: ömrü analizi için elde bakire kızı hücreleri Bu bölümde, her hücre bir bakire kızı olarak başlar sağlayarak ömrü analizi başlatmakhücresi. <ol><li> Inkübatör plakaları çıkarın ve dizilmiş hücreler çoğu hücre bölünmesi uğramadığını kontrol edin. Hücre bölünmesi tamamlanmış olmasını sağlamak için ek süreye ihtiyaç duyulması halinde, inkübatör plaka dönün. </li><li> Ilk dizilmiş hücre ile başlayarak, ana hücreden yavru hücrelere bağlı hücrelerin üstüne hafifçe iğne koyarak ayırmak için iğne kullanın. Bu iğne hücreleri üzerinde dinlenme ise mikroskop tabanı yan dokunun bazen yararlı olabilir. </li><li> Ana hücre ve herhangi bir ek kızı hücrelerinin yerine, geçici olarak bir kenara taşıyarak dikey çizgi müstakil yavru hücre yerleştirin. </li><li> Dizilmiş hücrelerin her biri için 3.2 ve 3.3 adımı yineleyin. Bir hücre bölmek için başarısız olursa, adım 2.3 &#39;de yer gereksiz hücreler biri bir kızı hücre alır. Bittiğinde, ömrünün plaka üzerine dikey hizalanmış her yama için 20 yavru hücreye sahip olmalıdır. </li><li> Yığınına anne hücreleri ve ilave kızı hücreleri toplamak ve yamalar yakın bir alanda (&quot;mezarlık&quot;) geri aktarabilirsiniz. Kadar ömrü analizi mikrokoloniler ve yerel besinlerin tükenmesi oluşumunu engellemek için uygulanan hücrelerin istenmeyen hücrelerin tutmak için önemlidir. </li><li> Parafilm plaka ve inkübe 30 ° C yaklaşık 2 saat. </li><li> Deneyde, her plaka için 3,2-3,6 adımları tekrarlayın. </li></ol> Bölüm 4: Ölçüm tek tek hücrelerin replikatif kapasitesi <ol><li> Ömrü veri sayfaları hazırlayın. Bir ömrü veri sayfası, her satırı ayrı bir anne hücreye karşılık gelir ve her sütunun bir yaş-noktası (Şekil 2) karşılık gelen basit bir kılavuz olabilir. Analiz edilecek suşların sayısına göre her bir veri sayfasının etiketleyin. </li><li> Inkübatör plakaları çıkarın ve dizilmiş hücreler çoğu en az bir hücre bölünmesi uğramadığını kontrol edin. Hücre bölünmesi tamamlanmış olmasını sağlamak için ek süreye ihtiyaç duyulması halinde, inkübatör plaka dönün. </li><li> Ilk plaka üzerine dizilmiş ilk hücre ile başlayarak, anne ve yavru hücre (ler) görsel olarak gözlemlemek ve meydana gelen hücre bölünmeleri sayısını belirlemek. Bir anne, cep düzenlemelerin karakteristik kalıplarına dayalı üretti kaç kızı hücreleri belirlemek için genellikle kolaydır. Ömrü puan kağıda uygun kutuya ana hücre tarafından üretilen yavru hücreye numarasını kaydedin. </li><li> Adım 3.2 &#39;de açıklandığı gibi ana hücreden kızı hücreleri ayırmak için iğne kullanın. </li><li> Dikey çizgi konumunu anne hücre saklayın ve bir kenara geçici olarak yavru hücre (ler) taşımak. </li><li> Dizilmiş hücrelerin her biri için 4,3-4,5 adımları tekrarlayın. </li><li> Atılır kızı hücrelerinin tümünü toplayın ve orijinal yamalar yakınında bulunan &#39;mezarlık&#39; taşıyabilirsiniz. </li><li> 30 Parafilm plaka ve inkübe ° C 2-3 saat. </li><li> Deneyde, her plaka için 4,3-4,8 adımları tekrarlayın. </li><li> Tüm anne hücreleri bölünerek geçinceye kadar tekrarlayın 4,2-4,9 adımları. Hücrelerinin annenin yaşı gibi, hücre döngüsünün ilerlemesi daha yavaş olur ve bu yaş noktaları arasında daha uzun süre için plaka inkübe arzu olacaktır. Plakalar 4 ° C gecede yerleştirilebilir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci Sonuçlar. Replikatif ömrü deneyi tarafından üretilen ham veriler, her yaş-noktası (Şekil 2) Her bir ana hücre tarafından üretilen yavru hücreye karşılık gelen bir liste numaraları. Puan sayfasının her satır toplayarak, her anne hücre için replikatif ömrü elde edilir. Veri aynı deney grubu anne hücreleri için bir hayatta kalma eğrisi (Şekil 3A) oluşturmak ve ortalama yaşam süresi, ortalama yaşam süresi, ve standart sapma gibi istatistiksel hesaplamalar gerçekleştirmek için toplanmış olabilir. Wilcoxon Rank Sum testi gibi non-parametrik bir test, deney grupları arasında tespit ömrü önemli farklılıklar olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. Deney düzgün çalışır, hayatta kalma eğrisi düşük erken mortalite ile sigmoidal Shap gösteren Gompertz-Makeham kinetik ile görece hızlı bir gerileme ve bir yaşam eğrisinin düzleşme dışında daha geç yaşlarda takip kabaca tutarlı olmalıdır. Bu aralıkta değişimi dışında olmasına rağmen, en vahşi-tip suşlar, 20-30 nesil aralığında replikatif ömrü değerleri var. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Şekil 1.5" /> Şekil 1. Tipik bir replikatif ömrü plakası diyagramı. Maya hücrelerinin mikrodiseksiyon başlamadan önce akşam, 3-5 suşları plakanın bir tarafı hafifçe boyunca dikey bir çizgi (kırmızı kutu) YEPD plaka yüzeyine yamalı vardır. Gecede büyümesinin ardından, her bir suş yaklaşık 30 ayrı hücreler 20 pozisyonları içeren bir satır içine dikey olarak dizilmiş. Life a analysiler bu ilk hücreleri elde v bakire kızı hücreleri üzerinde yapılacaktır. Koloniler olarak besin yerel tükenmesi önlemek için uzak deneysel hücreleri yer almaktadır &quot;mezarlık&quot; (gri oval), deney sırasında (örneğin istenmeyen kızı hücreleri) mikrodiseksiyon elde Ekstra hücreleri yerleştirilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Bir replikatif ömrü taksitli sayfalık bir replikatif ömrü deneyi Ham veri gösterilmiştir. Her satır, tek bir maya anne hücreye karşılık gelir ve her sütunun bir yaş noktasına karşılık gelir. Her kutuda girilen numarayı bu yaş noktada o ana hücre tarafından üretilen kızı hücrelerinin sayısı. Her suş maya hücreleri diseksiyon bireysel analiz edilen suşların kimliğini hiçbir bilgiye sahip olduğunu kodlu bir numara ile etiketlenir. Yirmi hücrelerin her bir suş için test. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Replikatif ömrü deneyi Temsilcisi hayatta kalma ve büyüme eğrileri (A), (hücre bölünmesi sayısı. Replikatif yaş bir fonksiyonu olarak hala hayatta anne hücreleri kısmını komplo ile elde edilen sağkalım eğrileri (B) Büyüme eğrilerinin çizilmesi ile elde edilir . Bu örnekte yaş noktasının bir fonksiyonu olarak belirli bir suş tarafından üretilen yavru hücreye ortalama sayısı., gerginlik # 2 uzun ömürlü ama daha yavaş büyüme komplo azaltılmış ilk eğimi ile kanıtlandığı gibi, büyüyen.

<ol><li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+yeast+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109-120 (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li>
<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li>
<li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li>
<li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>Maya Ekstraktı</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geliştirici maya replikatif Ömrü Ölçüm

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Yaşlanma, hücresel bileşenleri ve ölüm ile sonuçlanan organelleri ilerleyici bir bozulma ile karakterize dejeneratif bir süreç. Maya<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Yaşlanma biyolojisi okumak için yaygın olarak kullanılan olmuştur ve maya uzun ömürlü birkaç belirleyicileri solucanlar da dahil olmak üzere, çok hücreli ökaryotlarda korunacak, sinekler ve fareler edilmiştir<sup&gt; 1</sup&gt;. Maya yaşlanma kolayca sayısal yaşla ilişkili fenotipler eksikliği nedeniyle, iki farklı ortak kullanım ömrü paradigmalar farklı bağlamlarda hücrelerinin ömrü ölçerek neredeyse sadece test edilmiştir<sup&gt; 2</sup&gt;. Kronolojik ömrü olmayan bir bölme, sükunet gibi devletin bir anne hücrenin hayatta olduğu zaman süresini ifade eder ve çok hücreli ökaryotlarda post-mitotik hücrelerin yaşlanma için bir model olarak hizmet etmek için önerilmiştir. Replikatif ömrü, kontrast, yaşlılık önce bir anne hücre tarafından üretilen kızı hücrelerinin sayısı anlamına gelir, ve mitotik aktif hücrelerin yaşlanma bir model olduğu düşünülmektedir. Burada Maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçmek için genelleştirilmiş bir protokol mevcut. Replikatif ömür testinin amacı, kaç kez, her anne hücre tomurcukları belirlemek için. Anne ve kızı hücreler Zeiss Axioscope 40 ya da benzeri başka bir model gibi standart bir ışık mikroskobu (toplam büyütme 160x), deneyimli bir araştırmacı tarafından kolaylıkla ayırt edilebilir. Anne hücreleri kızı hücrelerinin fiziksel olarak ayrılması, fiber-optik bir iğne ile donatılmış manuel mikromanipülatör kullanarak elde edilir. Tipik laboratuvar maya suşları anne ortalama 20-30 yavru hücreye üretmek ve bir ömür deneyi 2-3 hafta gerektirir.

Bu yazıda, maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçümü için genel bir protokol mevcut.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Yaşlanma, hücresel bileşenlerin ve organellerin kademeli olarak kötüleşmesiyle karakterize olan ve ölümle sonuçlanan dejeneratif bir süreçtir. Tomurcuklanan...

Tomurcuklanan maya *Saccharomyces cerevisiae*, yaşlanma biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu makalede, maya ana hücrelerinin replikatif yaşam süresini ölçmek için genel bir protokol sunuyoruz. Merhaba, ben Washington Üniversitesi Biyokimya Bölümü'ndeki Brian Kennedy laboratuvarından Kristen Steffen.Bugün size maya ana hücrelerinin replikatif ömürlerini ölçmeye yönelik bir prosedür göstereceğiz. Maya hücrelerinin ömrünü etkileyen genleri incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Replikatif yaşam süresi deneyi ve yaşam süresi analizi için maya hücrelerinin hazırlanması amacıyla katı YEPD plaklarının hazırlanması gerekmektedir. Bu YEPD agar plaklarını hazırlarken uygun steril teknikleri kullanın. Yaşam süresi deneyinde analiz edilecek her dört ila beş suş için en az iki plaka hazırlayın.Bu plakalar, yaşam süresi deneyinden en az iki gün önce hazırlanmalı ve yaşam süresi analizi başlamadan önce kurumaya bırakılmalıdır. Deney, plakalar döküldükten sonraki dört ila beş gün içinde gerçekleştirilmeyecekse, kurumayı önlemek için plakalar parafilm veya plastik ile sarılmalı ve soğutmalı bir inkübatöre yerleştirilmelidir. Maya suşları dondurulmuş stoklardan çıkarılmalı ve tek koloni elde etmek için ekilmelidir.YEPD agar plaklarına. Plak, eşit büyüklükte pasta dilimleri şeklinde bölümlere ayrılarak aynı YEPD plağına altı suşa kadar kolayca ekilebilir. Hücreleri 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından hücreleri inkübatörden çıkarın ve tek bir koloniden hücreleri taze bir YEPD plakasına ekleyin. Bu aşamada, replikatif yaşam süresi deneyinin körleme olarak yürütülmesini sağlamak için analiz edilecek suşlar kodlanmalıdır. Böylece diseksiyonu yapan kişiler münferit suşların kimliklerini bilmeyecektir.Ardından, yamalı kaplanmış hücreleri ertesi akşama kadar 30 °C'de inkübe edin. Hücreleri çıkarın ve her bir kaplanmış suştan taze YEPD plaklarına hafifçe yamama işlemi yapın. Bunlar, replikatif yaşam süresi için kullanılacak deneysel plakalar olarak hizmet edecektir.Analiz hücreleri, YEPD plağının sol tarafında dikey bir hat boyunca ekilmelidir. Tek bir taze YEPD plağına çok fazla hücre aktarmayın. Bu durum, gece boyu süren inkübasyon sırasında hücrelerin aşırı yoğun büyümesine neden olarak replikatif yaşam sürelerini etkileyecektir; bu nedenle plak başına yaklaşık üç ila beş yamanın optimal olduğu değerlendirilmektedir.Her bir yamadan 20 hücre üzerinde replikatif yaşam süresi analizinin yapılacağı varsayılarak, artık yaşam süresi deneyi kurulmuştur ve yapılması gereken tek şey örnekleri tezgah üstünde gece boyunca inkübe etmektir. Ardından yarın, maya hücrelerini plaka üzerine konumlandırmak ve replikatif yaşam süresi analizi için bakire kız hücreler elde etmek amacıyla mikro diseksiyon işlemine başlayabiliriz.Maya için uygun bir mikrodissection aparatı ile donatılmış bir mikroskop kullanın. İlk yama suşundan yaklaşık 50 hücreyi, plaka üzerinde yamalanmış hücrelerin uzağındaki bir konuma aktarın. Mikroskop tablası dereceli ise, sonraki tekrarlarda hücrelerin kolayca bulunmasını sağlamak için bu derecelerden yararlanılabilir.Hücreler bazen iğneye takılabilir ve bu durum, hücrelerin yanlış zamanda çıkmaları halinde bir sorun teşkil edebilir. İğnenin temiz olduğundan ve hücre içermediğinden emin olmak için iğneyi agar yüzeyine defalarca değdirin. Ardından, iğneyi agar yüzeyine doğru bastırarak agar üzerinde bir delik açın.Bu delik, diseksiyonun ve nokta hücrelerinin çıkarılmasının sonraki tekrarları sırasında plak üzerinde yönünüzü belirlemek için bir işaret görevi görecektir. Deliğe maya hücrelerinin kaçmadığından emin olun, aksi takdirde bunlar büyüyerek doğrudan deliğin üzerinde bir koloni oluşturacaktır. Münferit maya hücrelerini, her hücre pozisyonu arasında bir ila üç iğne çapı olacak şekilde, dikey olarak hizalanmış 20 eşit aralıklı pozisyona yerleştirin.Her birkaç hücre için, hatta aynı konumda tek bir hücre yerine yan yana iki hücre yerleştirin. Bu, bakire yavru hücre seçimi sırasında yedekleme sağlar. Aktarılan hücrelerden biri hattaki 10. ve 11. konumlar arasında bölünmezse, agarda yedi ila sekiz delikten oluşan yatay bir seri oluşturun.Bu, sonraki diseksiyonlar ve yavru hücre çıkarımları sırasında plaka üzerinde yönünüzü belirlemeniz için bir işaret görevi görecektir. Tekrar belirtmek gerekirse, deliklere maya hücresi kaçırmamaya dikkat edin; aksi takdirde hücreler büyür ve bir koloni oluşturur. Bu işlemi plakadaki her bir yama için, hücreleri aynı eksen boyunca dikey olarak dizmeye devam ederek tekrarlayın.AER'de delikler açılırken, oluşturulan delik sayısının yama numarasına karşılık gelmesi, yani birinci yama için bir delik ve ikinci yama için iki delik olması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Hücreler her yama için dizildikten sonra, plakayı parafilm ile kapatın ve yaklaşık iki saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Unutmayın, bu noktadan itibaren, diseksiyon işlemi yapıldığı durumlar haricinde tüm plakalar parafilm ile kapatılmış olmalıdır.Kurumayı önlemek için, bu prosedürü her plaka için tekrarlayın. Deneyde, yaşam süresi analizi için her hücrenin bakir bir yavru hücre olarak başladığından emin olmak önemlidir.Bunu yapmak için öncelikle plakaları inkübatörden çıkarın ve dizi hücrelerinin çoğunun bir hücre bölünmesi geçirdiğini doğrulayın. Burada daha önce hizalanmış hücrelerimiz var ve inkübatörde iki saat geçtikten sonra bölünmeye başladıklarını görebilirsiniz. Artık gövdesine bağlı olan daha büyük hücre olan bir ana hücre ve bakir bir yavru hücreye sahibiz; bu bakir yavru hücre, yaşam süresini başlatmak için kullanılacak olan hücredir.Hücre bölünmelerinin tamamlanması için ek süreye ihtiyaç duyulursa, plakayı inkübatöre geri koyun. İlk dizi hücresinden başlayarak, iğneyi yapışık hücrelerin üzerine nazikçe yerleştirerek yavru hücreleri ana hücreden ayırmak için iğneyi kullanın.İğne hücrelerin üzerinde dururken, mikroskop tabanının yanına hafifçe vurmak bazen faydalı olabilir. Ardından, ayrılan yavru hücreyi, ana hücrenin ve varsa diğer yavru hücrelerin yerini alacak şekilde hücrelerin dikey hattına yerleştirin ve onları geçici olarak kenara kaydırın. Bu adımları dizideki her bir hücre için tekrarlayın.Bir hücre bölünmezse, test hücresinin yanındaki yedek hücrelerden birinden bir yavru hücre alın. İşlem tamamlandığında, yaşam süresi plakasında dikey olarak hizalanmış her yama için 20 yavru hücreniz olmalıdır. Tüm ana hücreleri ve fazla yavru hücreleri bir araya toplayıp yamaların yakınındaki mezarlık olarak adlandırılan alana geri aktarın.Mikro kolonilerin oluşumunu ve yerel besinlerin tükenmesini önlemek için, istenmeyen hücrelerin yaşam süresi analizine tabi tutulan hücrelerden uzak tutulması önemlidir. Hücreler ayrıştırıldıktan sonra, plakadan uzaklaştırın ve yaklaşık iki saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Bu adımları deneydeki her bir plaka için tekrarlayın.Tekil hücrelerin replikatif kapasitesini ölçmek için yaşam süresi veri sayfaları hazırlamanız gerekecektir. Yaşam süresi veri sayfası, her satırın tek bir ana hücreye ve her sütunun bir yaş noktasına karşılık geldiği basit bir tablo olabilir. Her veri sayfasını, analiz edilecek suş sayısına göre etiketlediğinizden emin olun.Başlamak için, önce plakaları inkübatörden çıkarın ve dizi hücrelerinin çoğunun en az bir hücre bölünmesi geçirdiğini doğrulayın. Hücre bölünmesinin tamamlanması için ek süreye ihtiyaç varsa, plağı inkübatöre geri yerleştirin. İlk plaktaki ilk dizi hücresinden başlayarak, gerçekleşen hücre bölünmelerinin sayısını belirlemek için ana ve yavru hücreyi veya hücreleri görsel olarak inceleyin.Hücre dizilimlerinin karakteristik modellerine dayanarak, bir ana hücrenin kaç tane yavru hücre ürettiğini belirlemek genellikle kolaydır. Buradaki örnekte, iki adet hücre olduğu, boyutlarının aynı olduğu ve her ikisinin de ana hücreden daha küçük olduğu için üretilen hücre sayısını görmek oldukça basittir. Ana hücre tarafından üretilen yavru hücre sayısını, yaşam süresi puan çizelgesindeki uygun kutucuğa kaydedin.Ardından, iğneyi ekli hücrelerin üzerine hafifçe yerleştirip iğne hücrelerin üzerindeyken mikroskop tabanının yan tarafına vurarak, daha önce açıklandığı şekilde iğneyi kullanarak yavru hücreleri ana hücreden ayırın. Ana hücreyi dikey hat üzerindeki konumunda tutun ve yavru hücreyi veya hücreleri geçici olarak yana kaydırın. Bu adımları dizideki her bir hücre için tekrarlayın.Son olarak, tüm atılan yavru hücreleri toplayın ve bunları orijinal yamaların yakınında bulunan mezarlığa taşıyın. Plaka üzerine parafilm çekin ve 30 °C'de iki ila üç saat inkübe edin. Yavru hücrelerin atılması ve inkübasyon işlemlerini tekrarlayın.Deneydeki her bir plaka için izlenecek adım. Tüm ana hücreler bölünmeyi durdurana kadar bu prosedürün tamamını tekrarlayın. Ana hücreler yaşlandıkça hücre döngüsü ilerlemesinin yavaşlayacağını ve bu nedenle sonraki yaş noktaları arasında plakaların daha uzun süre inkübe edilmesinin uygun olacağını unutmayın; ardından plakalar gece boyunca dört derece Celsius'ta saklanabilir.Replikatif yaşam süresi deneyinden elde edilen ham veriler, her bir anne hücre tarafından her bir yaş noktasında üretilen yavru hücrelere karşılık gelen bir sayı listesidir. Burada görüldüğü gibi. Puanlama çizelgesindeki her bir satır toplanarak, her bir anne hücre için replikatif yaşam süresi elde edilir.Aynı deney grubundaki diğer hücrelerden elde edilen veriler, bir sağkalım eğrisi oluşturmak ve istatistiksel hesaplamalar yapmak için birleştirilebilir. Eğri, başlangıçta düşük mortalite, ardından sağkalımda nispeten hızlı bir düşüş ve ileri yaşlarda eğrinin düzleşmesiyle karakterize sigmoidal bir şekil göstererek, kabaca Gomperts Mac am kinetiği ile uyumlu olmalıdır. Size maya replikatif yaşam süresi deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk.Bu prosedürü uygularken, hücrelerin soğuk ortamda olmadıkları her an bölünmeye devam edeceklerini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, sabah sayımda çok fazla yavru hücrele karşılaşmamak için plakları gece boyunca 4 °C'de beklettiğinizden emin olun. İşlem bu şekildedir.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, UV öldürüldü bakteriyel gıda ile sağlam bir medya üzerinde muhafaza nematod ömrü ölçmek için genel bir protokol mevcut.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

Bu protokolü biz ölçmek için bir yöntem mevcut.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Burada bir dizi maya kronolojik yaşlanma sırasında düzenleyen veya genomik DNA istikrarsızlığa katkıda genlerin / yolları çalışma ömrü modeli ile kombine edilebilir DNA mutasyon deneyleri açıklar.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Bu videoda, C. elegans'ın ömrünü ölçmek için geleneksel, plaka tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Örnek protokol, RNAi ile tedavi edilen solucanların ömrünü ölçer.

Yaşam Süresi Analizi: C. elegans Uzun Ömürlülüğün Ölçülmesi

Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Burada biz yineleme kümesi yöntemi, bir yaklaşım kantitatif ölçmek C. elegans ömrü/hayatta kalma ve healthspan yüksek üretilen iş ve sağlam bir şekilde böylece veri kalite ödün vermeden birçok koşullar tarama izin tanımlamak. Bu iletişim kuralı strateji detayları ve yineleme kümesi veri çözümlemesi için bir yazılım aracı sağlar.

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2'nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran

İn vivo olarak dahil edilen ve mikroskopi ve akış sitometrisi ile Click kimyası kullanılarak tespit edilen bir timidin analoğu olan EdU'yu kullanarak S. cerevisiae'deki S-faz süresini doğru bir şekilde belirlemek için iki tamamlayıcı protokol tanımladık. DNA replikasyon süresinin ve mutantlarda gözden kaçan replikasyon kusurlarının kolay karakterizasyonuna izin verir.

Saccharomyces cerevisiae'de 5-Etinil-2'-deoksiüridin Kullanımı Kullanılarak S-Faz Süresinin Belirlenmesi

Öğrenin, maya ana hücrelerinin replikatif ömrünü ölçmek için kullanılan güvenilir protokolü. Bu yöntem, Saccharomyces cerevisiae kullanarak yaşlanma mekanizmalarını ve genetik faktörleri incelemeye yardımcı olur.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Daha fazla video keşfet