Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Tomurcuklanan maya *Saccharomyces cerevisiae*, yaşlanma biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu makalede, maya ana hücrelerinin replikatif yaşam süresini ölçmek için genel bir protokol sunuyoruz. Merhaba, ben Washington Üniversitesi Biyokimya Bölümü'ndeki Brian Kennedy laboratuvarından Kristen Steffen.

Bugün size maya ana hücrelerinin replikatif ömürlerini ölçmeye yönelik bir prosedür göstereceğiz. Maya hücrelerinin ömrünü etkileyen genleri incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Replikatif yaşam süresi deneyi ve yaşam süresi analizi için maya hücrelerinin hazırlanması amacıyla katı YEPD plaklarının hazırlanması gerekmektedir. Bu YEPD agar plaklarını hazırlarken uygun steril teknikleri kullanın. Yaşam süresi deneyinde analiz edilecek her dört ila beş suş için en az iki plaka hazırlayın.

Bu plakalar, yaşam süresi deneyinden en az iki gün önce hazırlanmalı ve yaşam süresi analizi başlamadan önce kurumaya bırakılmalıdır. Deney, plakalar döküldükten sonraki dört ila beş gün içinde gerçekleştirilmeyecekse, kurumayı önlemek için plakalar parafilm veya plastik ile sarılmalı ve soğutmalı bir inkübatöre yerleştirilmelidir. Maya suşları dondurulmuş stoklardan çıkarılmalı ve tek koloni elde etmek için ekilmelidir.

YEPD agar plaklarına. Plak, eşit büyüklükte pasta dilimleri şeklinde bölümlere ayrılarak aynı YEPD plağına altı suşa kadar kolayca ekilebilir. Hücreleri 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından hücreleri inkübatörden çıkarın ve tek bir koloniden hücreleri taze bir YEPD plakasına ekleyin. Bu aşamada, replikatif yaşam süresi deneyinin körleme olarak yürütülmesini sağlamak için analiz edilecek suşlar kodlanmalıdır. Böylece diseksiyonu yapan kişiler münferit suşların kimliklerini bilmeyecektir.

Ardından, yamalı kaplanmış hücreleri ertesi akşama kadar 30 °C'de inkübe edin. Hücreleri çıkarın ve her bir kaplanmış suştan taze YEPD plaklarına hafifçe yamama işlemi yapın. Bunlar, replikatif yaşam süresi için kullanılacak deneysel plakalar olarak hizmet edecektir.

Analiz hücreleri, YEPD plağının sol tarafında dikey bir hat boyunca ekilmelidir. Tek bir taze YEPD plağına çok fazla hücre aktarmayın. Bu durum, gece boyu süren inkübasyon sırasında hücrelerin aşırı yoğun büyümesine neden olarak replikatif yaşam sürelerini etkileyecektir; bu nedenle plak başına yaklaşık üç ila beş yamanın optimal olduğu değerlendirilmektedir.

Her bir yamadan 20 hücre üzerinde replikatif yaşam süresi analizinin yapılacağı varsayılarak, artık yaşam süresi deneyi kurulmuştur ve yapılması gereken tek şey örnekleri tezgah üstünde gece boyunca inkübe etmektir. Ardından yarın, maya hücrelerini plaka üzerine konumlandırmak ve replikatif yaşam süresi analizi için bakire kız hücreler elde etmek amacıyla mikro diseksiyon işlemine başlayabiliriz.

Maya için uygun bir mikrodissection aparatı ile donatılmış bir mikroskop kullanın. İlk yama suşundan yaklaşık 50 hücreyi, plaka üzerinde yamalanmış hücrelerin uzağındaki bir konuma aktarın. Mikroskop tablası dereceli ise, sonraki tekrarlarda hücrelerin kolayca bulunmasını sağlamak için bu derecelerden yararlanılabilir.

Hücreler bazen iğneye takılabilir ve bu durum, hücrelerin yanlış zamanda çıkmaları halinde bir sorun teşkil edebilir. İğnenin temiz olduğundan ve hücre içermediğinden emin olmak için iğneyi agar yüzeyine defalarca değdirin. Ardından, iğneyi agar yüzeyine doğru bastırarak agar üzerinde bir delik açın.

Bu delik, diseksiyonun ve nokta hücrelerinin çıkarılmasının sonraki tekrarları sırasında plak üzerinde yönünüzü belirlemek için bir işaret görevi görecektir. Deliğe maya hücrelerinin kaçmadığından emin olun, aksi takdirde bunlar büyüyerek doğrudan deliğin üzerinde bir koloni oluşturacaktır. Münferit maya hücrelerini, her hücre pozisyonu arasında bir ila üç iğne çapı olacak şekilde, dikey olarak hizalanmış 20 eşit aralıklı pozisyona yerleştirin.

Her birkaç hücre için, hatta aynı konumda tek bir hücre yerine yan yana iki hücre yerleştirin. Bu, bakire yavru hücre seçimi sırasında yedekleme sağlar. Aktarılan hücrelerden biri hattaki 10. ve 11. konumlar arasında bölünmezse, agarda yedi ila sekiz delikten oluşan yatay bir seri oluşturun.

Bu, sonraki diseksiyonlar ve yavru hücre çıkarımları sırasında plaka üzerinde yönünüzü belirlemeniz için bir işaret görevi görecektir. Tekrar belirtmek gerekirse, deliklere maya hücresi kaçırmamaya dikkat edin; aksi takdirde hücreler büyür ve bir koloni oluşturur. Bu işlemi plakadaki her bir yama için, hücreleri aynı eksen boyunca dikey olarak dizmeye devam ederek tekrarlayın.

AER'de delikler açılırken, oluşturulan delik sayısının yama numarasına karşılık gelmesi, yani birinci yama için bir delik ve ikinci yama için iki delik olması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Hücreler her yama için dizildikten sonra, plakayı parafilm ile kapatın ve yaklaşık iki saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Unutmayın, bu noktadan itibaren, diseksiyon işlemi yapıldığı durumlar haricinde tüm plakalar parafilm ile kapatılmış olmalıdır.

Kurumayı önlemek için, bu prosedürü her plaka için tekrarlayın. Deneyde, yaşam süresi analizi için her hücrenin bakir bir yavru hücre olarak başladığından emin olmak önemlidir.

Bunu yapmak için öncelikle plakaları inkübatörden çıkarın ve dizi hücrelerinin çoğunun bir hücre bölünmesi geçirdiğini doğrulayın. Burada daha önce hizalanmış hücrelerimiz var ve inkübatörde iki saat geçtikten sonra bölünmeye başladıklarını görebilirsiniz. Artık gövdesine bağlı olan daha büyük hücre olan bir ana hücre ve bakir bir yavru hücreye sahibiz; bu bakir yavru hücre, yaşam süresini başlatmak için kullanılacak olan hücredir.

Hücre bölünmelerinin tamamlanması için ek süreye ihtiyaç duyulursa, plakayı inkübatöre geri koyun. İlk dizi hücresinden başlayarak, iğneyi yapışık hücrelerin üzerine nazikçe yerleştirerek yavru hücreleri ana hücreden ayırmak için iğneyi kullanın.

İğne hücrelerin üzerinde dururken, mikroskop tabanının yanına hafifçe vurmak bazen faydalı olabilir. Ardından, ayrılan yavru hücreyi, ana hücrenin ve varsa diğer yavru hücrelerin yerini alacak şekilde hücrelerin dikey hattına yerleştirin ve onları geçici olarak kenara kaydırın. Bu adımları dizideki her bir hücre için tekrarlayın.

Bir hücre bölünmezse, test hücresinin yanındaki yedek hücrelerden birinden bir yavru hücre alın. İşlem tamamlandığında, yaşam süresi plakasında dikey olarak hizalanmış her yama için 20 yavru hücreniz olmalıdır. Tüm ana hücreleri ve fazla yavru hücreleri bir araya toplayıp yamaların yakınındaki mezarlık olarak adlandırılan alana geri aktarın.

Mikro kolonilerin oluşumunu ve yerel besinlerin tükenmesini önlemek için, istenmeyen hücrelerin yaşam süresi analizine tabi tutulan hücrelerden uzak tutulması önemlidir. Hücreler ayrıştırıldıktan sonra, plakadan uzaklaştırın ve yaklaşık iki saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Bu adımları deneydeki her bir plaka için tekrarlayın.

Tekil hücrelerin replikatif kapasitesini ölçmek için yaşam süresi veri sayfaları hazırlamanız gerekecektir. Yaşam süresi veri sayfası, her satırın tek bir ana hücreye ve her sütunun bir yaş noktasına karşılık geldiği basit bir tablo olabilir. Her veri sayfasını, analiz edilecek suş sayısına göre etiketlediğinizden emin olun.

Başlamak için, önce plakaları inkübatörden çıkarın ve dizi hücrelerinin çoğunun en az bir hücre bölünmesi geçirdiğini doğrulayın. Hücre bölünmesinin tamamlanması için ek süreye ihtiyaç varsa, plağı inkübatöre geri yerleştirin. İlk plaktaki ilk dizi hücresinden başlayarak, gerçekleşen hücre bölünmelerinin sayısını belirlemek için ana ve yavru hücreyi veya hücreleri görsel olarak inceleyin.

Hücre dizilimlerinin karakteristik modellerine dayanarak, bir ana hücrenin kaç tane yavru hücre ürettiğini belirlemek genellikle kolaydır. Buradaki örnekte, iki adet hücre olduğu, boyutlarının aynı olduğu ve her ikisinin de ana hücreden daha küçük olduğu için üretilen hücre sayısını görmek oldukça basittir. Ana hücre tarafından üretilen yavru hücre sayısını, yaşam süresi puan çizelgesindeki uygun kutucuğa kaydedin.

Ardından, iğneyi ekli hücrelerin üzerine hafifçe yerleştirip iğne hücrelerin üzerindeyken mikroskop tabanının yan tarafına vurarak, daha önce açıklandığı şekilde iğneyi kullanarak yavru hücreleri ana hücreden ayırın. Ana hücreyi dikey hat üzerindeki konumunda tutun ve yavru hücreyi veya hücreleri geçici olarak yana kaydırın. Bu adımları dizideki her bir hücre için tekrarlayın.

Son olarak, tüm atılan yavru hücreleri toplayın ve bunları orijinal yamaların yakınında bulunan mezarlığa taşıyın. Plaka üzerine parafilm çekin ve 30 °C'de iki ila üç saat inkübe edin. Yavru hücrelerin atılması ve inkübasyon işlemlerini tekrarlayın.

Deneydeki her bir plaka için izlenecek adım. Tüm ana hücreler bölünmeyi durdurana kadar bu prosedürün tamamını tekrarlayın. Ana hücreler yaşlandıkça hücre döngüsü ilerlemesinin yavaşlayacağını ve bu nedenle sonraki yaş noktaları arasında plakaların daha uzun süre inkübe edilmesinin uygun olacağını unutmayın; ardından plakalar gece boyunca dört derece Celsius'ta saklanabilir.

Replikatif yaşam süresi deneyinden elde edilen ham veriler, her bir anne hücre tarafından her bir yaş noktasında üretilen yavru hücrelere karşılık gelen bir sayı listesidir. Burada görüldüğü gibi. Puanlama çizelgesindeki her bir satır toplanarak, her bir anne hücre için replikatif yaşam süresi elde edilir.

Aynı deney grubundaki diğer hücrelerden elde edilen veriler, bir sağkalım eğrisi oluşturmak ve istatistiksel hesaplamalar yapmak için birleştirilebilir. Eğri, başlangıçta düşük mortalite, ardından sağkalımda nispeten hızlı bir düşüş ve ileri yaşlarda eğrinin düzleşmesiyle karakterize sigmoidal bir şekil göstererek, kabaca Gomperts Mac am kinetiği ile uyumlu olmalıdır. Size maya replikatif yaşam süresi deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, hücrelerin soğuk ortamda olmadıkları her an bölünmeye devam edeceklerini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, sabah sayımda çok fazla yavru hücrele karşılaşmamak için plakları gece boyunca 4 °C'de beklettiğinizden emin olun. İşlem bu şekildedir.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.