MALDI Yaklaşımı ile Bakteriyel Proteomik Profilleme Kullanılarak Süt Ürünlerinin Mikrobiyal Güvenliğinin Değerlendirilmesi

Mikrobiyal toplulukları süt, krema, tereyağı ve peynir gibi çeşitli günlük ürünlerden hazırlayıp izole etmek için bir protokol geliştirdik. İzole edildikten sonra, bu mikroorganizma MALDI-TOF MS kullanılarak hızlı ve doğru şekilde tanımlanabilir. Kültür koşullarının optimize edilmesi, veritabanı boşlukları ve gram-pozitif ile spor oluşturan bakterilerin zorlu ekstraksiyonlarıyla birlikte önemli bir zorluk olmaya devam ediyor. Başlamak için, süt ürününden temsilli bir örnek alın ve düzgünlüğü sağlamak için iyice karıştırın.

Azeptik olarak, bir mililitre veya bir gram katı numuneyi, dokuz mililitre steril sıvı ortam içeren 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 30 ila 60 saniye boyunca güçlü bir şekilde girdabla tutuyor, böylece örnek homojenleştirilir. Sonra, homojenize süspansiyondan bir mililitreyi ardışık tüplere aktararak her biri dokuz mililitre steril çözelti içeren bir dizi on kat seyreltme hazırlayın.

Her seyreltiyi vortex veya sallayarak iyice karıştırın. Sonra, orijinal numuneden veya hazırlanan seyreltmelerden bir 0,1 mililitre alın ve uygun agar ortamı içeren hazırlanmış Petri kabının yüzeyine aktarın. Steril bir yayıcı kullanarak, inokulumu agar plakasının yüzeyine eşit şekilde dağıtın.

Aerobik kuluçka için, hazırlanan örneklerle APT, M17, CBL, MPCA ve TSA agar plakalarını aşılayın. Plakaları aerobik koşullarda 37 derece ve 30 derece Celsius sıcaklıkta 24 saat boyunca kuluçka yapın. Anaerobik kuluçka için, aşılanmış MRS agar plakalarını anaerobik bir odaya yerleştirin ve 37 derece ve 30 derece sıcaklıkta 24 ila 72 saat boyunca kuluçka yapın.

Levhaları kuluçka makinesinden çıkarın ve mikrobiyal büyümeyi izlemek için günlük olarak inceleyin. Bir mikrolitrelik mikrobiyal döngü kullanarak, seçilen kolonileri aynı agar ortamına çizgilendirerek alt kültüre alın. Daha önce kullanılan aynı koşullar altında kuluçka yapın.

Kütle spektrometrisi analizi için, MALDI matris çözümünü hazırlamakla başlayın. Çözücü karışımını %50 asetonitril, %47,5 HPLC kalitesinde su ve %2,5 trikloroasetik asit ile hazırlayın. Matris bileşiğini çözücü karışımına yaklaşık 10 miligram/mililitre nihai konsantrasyona dönüştürür.

Bakterilerin doğrudan koloni transfer yöntemiyle MS tanımlanması için, steril bir halka kullanılarak yetiştirilen bakteri koloninin bir mikrolitresini MALDI hedef plakasında bir noktaya aktarın. Bakteri materyalini yayarak plaka üzerinde ince ve eşit bir tabaka oluşturun. Kuruduktan sonra, üstüne bir mikrolitre HCCA matris çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında hava kurumasına izin verin.

Hedefe uygun formik asit çıkarma yöntemi için, tek bir koloniden az miktarda bakteriyel biyokütle toplamak için tek kullanımlık mikrobiyal halka veya steril diş kürdanı kullanın. Malzemeyi doğrudan MALDI hedef plakasının bir noktasına sürerek ince, eşit bir tabaka oluşturun. Bulanmış alana bir mikrolitre %70 formik asit çözeltisi ekleyin.

Leke kuruduktan sonra, üzerine bir mikrolitre HCCA matris çözeltisi ile serin ve oda sıcaklığında hava kurumasına izin verin. Tüp içi protein ekstraksiyonu yöntemi için, agar kültür plakasından 300 mikrolitre steril su içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne bir ila üç tam koloni aktarın. 900 mikrolitre mutlak etanol ekleyin; böylece nihai etanol konsantrasyonu yaklaşık %75 olur. İçerik kısa bir süre karıştıktan sonra, tüpü oda sıcaklığında 15.000 g sıcaklıkta iki dakika boyunca santrifüjlenin.

Sonrasında, hücre pelletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın. Sonra, kurutulmuş hücre pelletine 20 ila 50 mikrolitre %70 formik asit ekleyin. İçeriği, pellet tamamen yeniden askıya alınana kadar pipetleme veya vortexleme ile karıştırın.

Şimdi, formik asit süspansiyonuna eşit miktarda asetonitril ekleyin ve iyice karıştırın. Tüpü 15.000 g ile iki dakika boyunca santrifüj yapın. Ortaya çıkan süpernatanttan bir mikrolitresini MALDI hedef plakasında belirlenmiş bir noktaya aktarın ve kurumasına izin verin.

Sonra kurumuş noktayı bir mikrolitre HCCA matris çözeltisi ile örtün. Escherichia coli DH5 alfa ekstraktı içeren bakteriyel test standardından veya E.coli ATCC 25922 protein ekstraktı, ribonükleaz ve miyoglobin içeren mikrobiyoloji kalibratöründen bir mikrolitre pipotleyin. Spektrum alımı ve mikrobiyal tanımlama için MALDI hedef plakasında kalibrasyon noktaları hazırlanın.

MALDI hedef plakasına hem hazırlanmış örnek noktaları hem de kalibrant noktaları kütle spektrometrisi cihazına yükleyin. Sistemi kalibre etmek için kalibrasyon analizini kalibrasyon modunda çalıştırın. Genel spektrum elde etmek için kütle spektrometresini doğrusal pozitif iyon modunda çalıştırın.

Sonra, kütle spektrometresinin kütle tespit aralığını 2.000 ile 20.000 kütle-şarj oranı arasında kapsayacak şekilde ayarlayın. Her nokta için spektrumları ikili olarak edinerek her örnek başına en az dört teknik kopya üretin. Şimdi, Savitzky-Golay yöntemini bir yumuşatma algoritması olarak uygulayın.

Arka plan gürültüsünü kaldırmak için TopHat algoritmasını temel düzeltme için kullanın. Sonra, centroid modunda zirveleri tespit edin. Bilinmeyen bakteriyel izolatên işlenmiş kütle spektrumlarını MALDI yazılımındaki mikrobiyal tanımlama platformuna yükleyin ve tanımlamayı çalıştırın.

Üreticinin eşik standartlarına göre tanımlama puanlarını değerlendirin. Kütle spektrometrisi spektrumları, türe özgü protein profillerini gösterir ve cins veya tür düzeyinde tanımlamayı mümkün kılar. Dendrogram, aynı türdeki suşlar arasında gözlemlenen yüksek benzerlik ve türler arasında net bir ayrım olduğunu ortaya koydu.

Bacillus licheniformis için 12 saatlik kısa kuluçka süresi, 2.38 ile daha yüksek bir ID puanı değeri sağlarken, 18 ila 24 saat süren daha uzun kuluçka, spor sinyallerinin baskını nedeniyle 1.85 olan düşük bir ID puanı değerine yol açtı. Örnek hazırlama yöntemleri arasında, tüp içi protein ekstraksiyonu en yüksek ID puanı olan 2.23'ü verdi, ardından hedefe uygun formik asit ekstraksiyonu (1.97) ve doğrudan koloni transferi en düşük puan olan 1.61'i verdi. Kültür bilimi ile özel numune hazırlamayı birleştirerek, MALDI daha hassas ve daha hızlı mikrobiyom analizini daha düşük maliyetle sağlar ve referans 16S rRNA yöntemleriyle karşılaştırılabilir sonuçlar üretir.

Bu protokol, süt ürünlerindeki mikroorganizmaların rutin, yüksek verimli bir şekilde izlenmesini sağlar, tespit hızını ve doğruluğunu artırır ve nihayetinde gıda kalitesi ve güvenlik sistemlerini güçlendirir. MALDI veritabanlarının genişletilmesi ve sektör laboratuvarlarında iş akışlarının otomatikleştirilmesi, mikrobiyal tanımlamayı geliştirecek, verimliliği artıracak, hataları azaltacak ve mikrobiyota izlemesini hızlandıracaktır.