Düşük Yoğunluklu Nötrofillerin Verimli Saflaştırılması için Hızlı Manyetik-mikro Boncuk Yöntemi

Periferik kan mononükleer hücrelerindeki düşük yoğunluklu nötrofilleri inceleyerek işlevlerini karakterize ederek farklı hastalıklardaki rollerini belirleyebiliriz. Düşük yoğunluklu nötrofiller sağlıklı kanda nadirdir, ancak sistemik lupus eritematozus ve kanser gibi hastalıklarda belirgin şekilde artarlar. Başlamak için, 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne antikoagülan olarak mililitrede 10 birim heparin ekleyin.

Sonra PBS'de iki mililitre %6dextran T500 ekleyin. Sağlıklı bir yetişkin gönüllüden venipunkturla 10 mililitre kan alın. Başka bir taze 15 mililitrelik santrifüj tüpünde, beş mililitre yoğunluk gradyan ortamı ekleyin.

Eritrositlere dokunmadan plazmayı dikkatlice pipetleyin ve ortamın üzerine katmanlayarak iki ayrı faz oluşturun. Tüpü 516 g sıcaklıkta, dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca santrifüjlendirin. PBMC'leri izole etmek için, hücreleri rahatsız etmeden plazmayı PBMC bandının üzerindeki aspirasyon ve atma yöntemi ile atabilirsiniz.

Plazma ile ortam arasındaki mononükleer hücre bandını toplayın, ortamın toplanmasını en aza indirin. PBMC içeren tüpe 20 mililitre PBS ekleyin, ardından 400 g'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve tüpü kazıyarak pelleti ayırın.

Hücreleri yeniden süsküye almak için 10 mililitre soğuk PBS ekleyin. Nötrofilleri izole etmek için, ortamı pipetledikten sonra hücreleri ayırmak üzere tüpü kazıyarak alın. Sonra 10 mililitre soğuk PBS ekleyin.

Şimdi hücreleri yeni 50 mililitrelik konik santrifüj tüpü ve santrifüjlere aktarın. Süpernatantı aspire edin ve tüpü tekrar kazıyın. Şimdi 10 mililitre soğuk hipotonik çözeltiyi tüpe pipetleyin ve nazikçe karıştırın.

Tam bir dakika boyunca nazikçe karıştırın. Çözeltiyi izotonik hale getirmek için hızlıca 10 mililitre soğuk hipertonik çözelti ekleyin. Sonra nötrofilleri bir Neubauer odası kullanarak sayın ve saflığın %95'ten yüksek olduğundan emin olun. Süspansiyonu santrifüj ederek hücre pelleti elde edin.

Sonra pelleti soğuk PBS'ye tekrar askıya alın. Periferik kan mononükleer hücrelerini 400 g'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Süpernatant çıkarıldıktan sonra, hücreleri 120 mikrolitre soğuk yıkama tamponunda yeniden askıya alın.

Sonra 35 mikrolitre CD66b manyetik mikroboncuklarını hücre süspansiyonuna pipetleyin. Karışımı karanlıkta dört derece Celsius'ta 30 dakika kuluçka yapın. Şimdi bir mililitre soğuk yıkama tamponu tüpe pipetleyin.

Tüpü 400 g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı çıkardıktan sonra hücre pelletini ayırmak için tüpü kazıyın. Ve hücreleri bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süzülür.

Bir manyetik ayırma kolonu bir mıknatısın üzerine yerleştirin. Kolona 0,5 mililitre yıkama tamponu ekleyin, böylece tamamen geçebilir. Yeniden askıya alınmış hücrelerden bir mililitreyi kolona aktarın ve tamponun damla damla geçmesine izin verin.

Yıkamadan sonra kolonu mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sonra kolona bir mililitre yıkama tamponu pipetleyin. Şimdi pistonu kolonun üstüne yerleştirin.

Hücreleri elüasyon etmek için nazikçe baskı uygulayın. Sonra pistonu çıkarın ve kolonu yeni bir mikrosantrifüj tüpünün üzerine yerleştirin. Kolona bir mililitre daha yıkama tamponu ekleyin.

Sonra pistonu tekrar takın ve kalan hücreleri elülasyon için nazikçe baskı uygulayın. Her iki mikrosantrifüj tüpünü 800 g ile üç dakika boyunca santrifüj yapın. Her iki tüpten hücre pelletlerini bir mililitre soğuk PBS'ye yeniden askıya alın.

Hücre askısını buzda tutun. Saflaştırılmış hücreleri, PBS'de %1 fetal sığır serumundan oluşan etiketleme tamponunda yeniden süzülür. 250 mikrolitre süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Nötrofil zar moleküllerine karşı ilgili antikorları tüpe ekleyin. Sonra hücreleri ışıktan korunarak dört derece Celsius'ta 30 dakika kuluçkaya geçirin. Şimdi bir mililitre PBS pipetini tüpe ekleyin.

Tüpü 800 g mikrosantrifüjde üç dakika boyunca döndürün. Süpernatantı aspire edin. Tüpü vurarak peleti kırın.

Ve hücreleri %1 paraformaldehit ile 0,5 mililitre yeniden süzülür. Sonra hücreleri ışıktan koruyarak dört derece Celsius altında tutar, akış sitometrisiyle analiz edilene kadar. Numuneleri akış sitometrisi kullanarak analiz edin, her örnek başına 10.000 olay yakalayın.

Sağlıklı bireylerde düşük yoğunluklu nötrofiller, periferik kan mononükleer hücrelerinin yaklaşık %5'ini oluştururken, tanımlanan manyetik izolasyon protokolü yaklaşık %98 iyileşme oranında düşük yoğunluklu nötrofiller sağladı. Nötrofiller, CD10, CD11b, CD15, CD62L ve CD66b membran belirteçlerini ifade eder. Manyetik olarak saflaştırılmış düşük yoğunluklu nötrofiller, nötrofillerle aynı membran belirteçlerini ifade eder.

Saflaştırılmış düşük yoğunluklu nötrofiller, çok lobulasyonlu bir çekirdek sergilerdi ve nötrofillere benzer boyuttaydı. Hem nötrofiller hem de düşük yoğunluklu nötrofiller, PMA uyarısına yanıt olarak reaktif oksijen türleri üretir; düşük yoğunluklu nötrofiller nötrofillerden daha yüksek seviyeler üretir. Düşük yoğunluklu nötrofiller, PMA stimülasyonuna yanıt olarak nötrofil ekstrahücre tuzakları salgıladı; bu, DNA'nın elastaz ve sitrulin ile kolokalizasyonu ile kanıtlanmıştır.

Hem saflaştırılmış nötrofiller hem de düşük yoğunluklu nötrofiller, PMA tedavisinden sonra benzer kinetik ve miktarlara sahip NET'ler salgılamıştır. Protokolümüz, yüksek saf ve işlevsel düşük yoğunluklu nötrofiller elde etmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yol sunar. İnsan kanından düşük yoğunluklu nötrofillerin izole edilmesi için standartlaştırılmış ve zaman verimli bir protokolün eksikliğini ele alıyoruz.

Bu protokol, karmaşık cihazlar için özel bir eğitim gerektirmez ve FACS'den daha ekonomik ve hızlıdır.