Yenidoğnan, genç ve yetişkin fare akciğerlerinden alveolar tip II epitel hücrelerinin enfeksîyonel deneysel ortamlara uyarlanabilir izolyasyonu

Araştırmamız, alveolar tip II epitel hücrelerin, kısaca AECII'nin, akciğer gelişimi, enfeksiyon ve iltihaplanma için rollerini belirlemeyi amaçlamaktadır. Yenilik olarak, protokolümüz bulaşıcı örnekler dahil olmak üzere yenidoğan ve genç farelerden AECII izolasyonunu mümkün kılar. Başlamak için, ötenazi edilmiş bir genç fare edinin.

Kadın döküldükten sonra, kalp ve akciğerleri açığa çıkarmak için diyaframı dikkatlice çıkarın. Kaburga kafesini makasla açın. Yetişkin ve genç farelerde enzimatik sindirim için, tükürük bezlerini ve çevresindeki kasları çıkararak trakeayı açığa çıkarın.

Trakeaya 22 kalibre bir yerleşik kanül yerleştirin. İğneyi çıkarın ve plastik kateteri akciğerlere doğru ilerletin. Trakea ve kateterin etrafına bir iplik sabitleyin, böylece sabit kalsın.

Akciğer dokusunu hazırlamak için kateter üzerinden dispaze injekte edin. Şırıngayı değiştirin ve akciğer yapısını korumak için hacim başına %1 ağırlıkta düşük erimeli agaroz yerleştirin, böylece akciğer yapısı korunur. Şimdi, akciğeri laboratuvar kağıdıyla kaplayın ve agarozun katılaşması için iki dakika buz ekleyin.

Buz, mendil kağıdı, şırıngayı ve kateteri çıkarın. Sonra ipliği bağlayarak trakeayı kapatın ve enzimi alt hava yollarında tutun. Kalbi ve timusu çıkarın.

Ipliğin üzerindeki trakeayı kesin ve göğüsteki sağlam akciğeri çıkarın. Akciğer, önceden ısıtılmış dispaz içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Genç akciğer dokusunu oda sıcaklığında dispazda 45 dakika kuluçka edin.

Akciğeri dispazdan çıkarın ve akciğer loblarını bronş gövdesinden disseksiye. Akciğer loblarını, HEPES ile takviye edilmiş yedi mililitre DMEM ve 100 mikrolitre DNaz içeren bir Petri kabına yerleştirin. Pens kullanarak, akciğer dokusunu parçalayın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın, böylece akciğer dokusunun enzimatik sindirimi verimli hale getirilir.

Alveolar epitel tip II hücrelerini ayırmak için, floresansla aktive edilen hücre ayırma cihazına 100 mikrometrelik bir nozul takın. Antikor etiketli hücreleri 50 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve hücre kaybını önlemek için süzgeçi takviyeli DMEM ile durulayın. Hücreleri ayırmadan hemen önce girdap ile yeniden askıya alın.

Alveolar epitel tip II hücreleri için yüksek yan saçılma, negatif soy florokromları ve pozitif CD326 sinyali olayları seçerek kapayı. İleri saçılma yüksekliği ile alan ve yan saçılma yüksekliği ile alan arasındaki çift veya agregatları hariç tutun. Sıralanmış hücreleri, takviye edilmiş DMEM ve santrifüj içeren tüplere toplayarak daha fazla analiz veya kültür için alın.

Akış ayırma, saf alveolar epitel tip II hücre popülasyonları üretti; sıralama sonrası analizler ise yerleşik hücresel belirteçler için neredeyse %100 özgüllüğü doğruladı. Sorgulama sonrası örneklerin nicel olarak belirlenmesi, neonatal akciğerlerden yaklaşık 0,15 milyon canlı alveoller epitel tip II hücresi ve yetişkin akciğerlerden tüm akciğer preparatı başına 1 milyona kadar hücre verimini gösterdi. İzole alveolar epitel tip II hücreler, izolasyondan sonra tipik hücresel morfolojiyi korudu.

İzole edilmiş alveolar epitel tip II hücrelerin hücresel bütünlüğü izolasyon süreci boyunca korundu. İzole alveolar epitel tip II hücreleri, mCherry raporlayıcı proteinini ifade eden influenza A virüsüyle ex vivo enfeksiyonu destekledi ve zamanla viral çoğalma gösterdi. Yüksek kaliteli RNA, paraformaldehit sabit alveolar epitel tip II hücrelerinden farklı işlem zaman noktalarında başarıyla çıkarıldı.

Ekstraksiyon yapılan RNA'nın kalitesi, ekstraksiyon sırasında 80 derece Celsius sıcaklıkta termal işlem süresiyle doğrudan ilişkilendirilmiştir. Nicel ters transkripsiyon PCR analizi, paraformaldehit sabit ve taze alveolar epitel tip II hücre örneklerinden ribozomal protein S9 ve yüzeyaktif protein C transkriptlerinin başarılı amplifikasyonunu doğrulamıştır. Laboratuvarımız daha önce akciğer iltihabı ve enfeksiyon sırasında AECII'nin kritik immünoregülasyon rollerini belirlemiş ve bağışıklığı eğitmiştir.

Genel olarak, aynı anda yüksek AECII verimi ve yüksek saflık elde etmek deneysel bir zorluktur. Bu protokol, AECII'nin solunum yolu enfeksiyonu ve doğum sonrası akciğer gelişimi sırasında rolleri üzerine gelecekteki araştırmaların yolunu açmaktadır.