İlaç tedavisinden sonra hepatosellüler karsinom organoidlerinin oluşumu ve tek hücreli transkriptomik analizi

HCC organoidlerinin ilaç tedavisine nasıl yanıt verdiğine ve translasyonel çalışmalarının iş yerinde nasıl değiştiğine odaklanıyoruz. Bu protokol HCC organoidleri için faydalıdır ve diğer tümör organoid sistemlerine de uyarlanabilir. Başlamak için, hepatosellüler karsinom veya HCC hasta kaynaklı organoidler oluşturulabilir ve onları terapötik bozulmaya hazırlayın.

Lenvatinib stok çözeltisini üreticinin talimatlarına göre dimetil sülfoksit (DMSO) içinde hazırlayın. Stok çözeltiyi kullanımdan hemen önce önceden ısıtılan kültür ortamında önceden tanımlanmış çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin. Tüm kuyulardan eşit nihai hacimler elde edecek kadar çözelti hazırlayın, böylece her kuyu boyunca aynı DMSO konsantrasyonu sağlanır.

Sonra, her kuyunun duvarına 20 mikromolar oranında lenvatinib içeren ortam ekleyin ki matris kubbeleri rahatsız edilmesin. Aynı nihai DMSO yoğunluğuna sahip bir araç kontrolü ekleyin. Organoidleri önceden belirlenmiş tedavi süresi için standart kültür koşullarında kuluçka edin.

72 saati aşan tedavilerde, ilaç içeren ortamı her 48 ila 72 saatte bir değiştirin, böylece tüm kuyularda tutarlı bir değişim programı sağlanır. Tedaviden önce temel parlak alan görüntülerini kaydedin. Aynı mikroskop ayarları, büyütme ve alan pozisyonları kullanılarak işlem sırasında sabit aralıklarla görüntüler alın.

Tedavi yanıtının morfoloji temelli değerlendirmesi için, tüm görüntüler için aynı pozlama ayarları, büyütme ve analiz eşikleri kullanın. Her zaman noktasında kuyu veya alan başına toplam organoid alanı hesaplanarak ve değerleri temel alana göre normalleştirerek organoid alan büyüme eğrisini ölçün. Ortalama organoid çapını ölçmek için, bireysel sağlam organoidlerin çapını belirleyin ve kuyu başına ortalama değeri hesaplayın.

Sonra, morfolojik olarak tanımlanabilir sağlam organoidleri sayarak, kalan organoid sayısını belirleyin, ancak herhangi bir enkaz veya çökmüş parçaları hariç tutun. Üreticinin talimatlarına uygun olarak ek toplu canlılık değerlendirmesi gerekirse, tedavi noktasında üç boyutlu bir lülümansans canlılık testi yapılmalıdır. Sonra, organoid alan büyüme eğrilerini zaman içinde çizin.

Araç ile işlenmiş ve lenvatinib ile işlenmiş gruplar arasındaki ortalama organoid çapı karşılaştırın. Ayrıca, tedavi grupları arasında hayatta kalan organoid sayılarını karşılaştırın. Tekrarlanabilirliği sağlamak için tutarlı görüntüleme programları, dahil etme kriterleri ve analiz parametreleri kullanın.

Sağlam 3D morfolojiye, tek hücre yakalama için yeterli malzemeye sahip ve görünür bir kirlenme olmayan organoid kuyuları seçin. Seçilmiş her birinin parlak alan görüntülerini ayrışmadan çok önce aynı mikroskop ayarları, büyütme ve alan seçme kriterleri kullanılarak kaydedin. Organoidleri kontrol ve işlenmiş gruplar arasında eşleşen zaman noktalarında toplayın; tüm örneklerde aynı kaplama yoğunluğu, tedavi programı ve ortam değişim koşulları korunur.

Her kuyunun kültür ortamını tamamen aspire edin. Her kuyuyu buz gibi PBS ile iki kez yıkayarak kalan ortam ve kalıntıları temizleyin. Her kuyuya bir mililitre buz soğukluğu hücre iyileştirme solüsyesi ekleyin ve 20 ila 30 dakika boyunca buzda kuluçka yapın.

İnkubasyon sırasında her beş ila yedi dakikada bir nazikçe pipet yapın, böylece matriks çözünmesini kolaylaştırın. Çözünmüş malzemeyi geniş bir delik veya kesilmiş pipet ucu kullanarak önceden soğutulan tüplere aktararak sert gerilimi en aza indirin. Enzimatik ayrışmaya ancak matris büyük ölçüde çözüldükten ve minimal görünür jel kalıntısı kaldıktan sonra devam edin.

Geri kazanılan organoid süspansiyonu 300 G'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj edin. Süpernatantı peleti rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın. Pelleti bir mililitre rekombinant hücre ayrıştırma enzimiyle yeniden askıya alın ve 37 derece Celsius'ta beş ila 10 dakika kuluçka yapın.

Dissosiyasyonu artırmak için her iki-üç dakikada bir sekiz-on kez nazikçe pipetle geniş delikli P1000 ucu ile nazikçe pipet yapın. Çoğu organoid parça tek hücreye dağıldığında ve geriye sadece küçük kalıntı kümeleri kaldığında sindirimi durdurun. Sonra, sindirimi durdurmak için %2 fetal sığır serumu içeren dört mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin.

Sonra, süspansiyonu 40 mikrometrelik bir hücre süzgencesinden filtreleyin. Kalan enzim, agregalar ve kalıntıları çıkarmak için PBS ile bir kez yıkayın. Hücreleri trypan blue hariç tutarak say.

Hücre canlılığı %85 veya üzerinde olduğundan emin olunduktan sonra, nihai hücre konsantrasyonunu 700'e ayarlayarak mikrolitre başına 1.200 hücreye ayarlayın. Aşırı döküntü, bol ölü hücre, büyük görünür agregalar veya eksik ayrışma içeren örnekleri dışlayın. Agregalar varsa yüklemeden önce filtreleme tekrarlanın.

Aynı koşullarda işlem kontrolü ve işlenmiş örnekler, bunlar arasında dissosiyasyon enzimi, sindirim süresi, pipetleme sıklığı, filtrasyon yöntemi, hücre konsantrasyonu ve yükleme stratejisi dahil. Son olarak, tek hücreli kütüphane amplifikasyonundan sonra tek hücreli dizileme işlemi yapılacaktır. Organoid, iyileşme sonrası ilk günden altıncı güne kadar standart üç boyutlu kültür koşullarında hayatta kaldı ve genişledi.

İlk günde, organoidler küçük kompakt yapılar olarak ortaya çıktı, altıncı güne gelindiğinde ise boyutları arttı ve iyi tanımlanmış morfolojiler sergilediler. Lenvatinib ile işlenmiş organoidler, DMSO ile tedavi edilen kontrol gruplarına kıyasla daha küçüktü ve morfolojide değişiklik gösterdi. Nicel analiz, lenvatinib tedavisinden sonra DMSO kontrollerine kıyasla ortalama organoid çapında bir azalma olduğunu gösterdi.

Bu protokol, tedavi sonrası hücre durumu, hücre bileşimi ve gen ifadesindeki değişiklikleri incelememize olanak tanır. En büyük zorluk, hücre yaşamını korumak, tüm gruplar arasında basit işlemenin tutarlı kalmasıdır. Bu prosedürle birlikte hücresel aşağı akış analizi yapılabilir; kümeleme, diferansiyel gen deneyleri analizi, yol zenginleştirme analizi ve hazine çıkarımı dahil.