İlaç tedavisinden sonra hepatosellüler karsinom organoidlerinin oluşumu ve tek hücreli transkriptomik analizi
26 Mayıs 2026
Bu protokol, hepatosellüler karsinom organoidlerinin üretilmesi, ilaç tedavisi uygulanması ve tedavi öncesi ve sonrası tek hücreli RNA dizilenmesi için uygulanan sade bir yöntemi ortaya koyarak tedaviyle ilişkili transkripsiyonel değişiklikleri karakterize eder.
HCC organoidlerinin ilaç tedavisine nasıl yanıt verdiğine ve translasyonel çalışmalarının iş yerinde nasıl değiştiğine odaklanıyoruz. Bu protokol HCC organoidleri için faydalıdır ve diğer tümör organoid sistemlerine de uyarlanabilir. Başlamak için, hepatosellüler karsinom veya HCC hasta kaynaklı organoidler oluşturulabilir ve onları terapötik bozulmaya hazırlayın.
Lenvatinib stok çözeltisini üreticinin talimatlarına göre dimetil sülfoksit (DMSO) içinde hazırlayın. Stok çözeltiyi kullanımdan hemen önce önceden ısıtılan kültür ortamında önceden tanımlanmış çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin. Tüm kuyulardan eşit nihai hacimler elde edecek kadar çözelti hazırlayın, böylece her kuyu boyunca aynı DMSO konsantrasyonu sağlanır.
Sonra, her kuyunun duvarına 20 mikromolar oranında lenvatinib içeren ortam ekleyin ki matris kubbeleri rahatsız edilmesin. Aynı nihai DMSO yoğunluğuna sahip bir araç kontrolü ekleyin. Organoidleri önceden belirlenmiş tedavi süresi için standart kültür koşullarında kuluçka edin.
72 saati aşan tedavilerde, ilaç içeren ortamı her 48 ila 72 saatte bir değiştirin, böylece tüm kuyularda tutarlı bir değişim programı sağlanır. Tedaviden önce temel parlak alan görüntülerini kaydedin. Aynı mikroskop ayarları, büyütme ve alan pozisyonları kullanılarak işlem sırasında sabit aralıklarla görüntüler alın.
Tedavi yanıtının morfoloji temelli değerlendirmesi için, tüm görüntüler için aynı pozlama ayarları, büyütme ve analiz eşikleri kullanın. Her zaman noktasında kuyu veya alan başına toplam organoid alanı hesaplanarak ve değerleri temel alana göre normalleştirerek organoid alan büyüme eğrisini ölçün. Ortalama organoid çapını ölçmek için, bireysel sağlam organoidlerin çapını belirleyin ve kuyu başına ortalama değeri hesaplayın.
Sonra, morfolojik olarak tanımlanabilir sağlam organoidleri sayarak, kalan organoid sayısını belirleyin, ancak herhangi bir enkaz veya çökmüş parçaları hariç tutun. Üreticinin talimatlarına uygun olarak ek toplu canlılık değerlendirmesi gerekirse, tedavi noktasında üç boyutlu bir lülümansans canlılık testi yapılmalıdır. Sonra, organoid alan büyüme eğrilerini zaman içinde çizin.
Araç ile işlenmiş ve lenvatinib ile işlenmiş gruplar arasındaki ortalama organoid çapı karşılaştırın. Ayrıca, tedavi grupları arasında hayatta kalan organoid sayılarını karşılaştırın. Tekrarlanabilirliği sağlamak için tutarlı görüntüleme programları, dahil etme kriterleri ve analiz parametreleri kullanın.
Sağlam 3D morfolojiye, tek hücre yakalama için yeterli malzemeye sahip ve görünür bir kirlenme olmayan organoid kuyuları seçin. Seçilmiş her birinin parlak alan görüntülerini ayrışmadan çok önce aynı mikroskop ayarları, büyütme ve alan seçme kriterleri kullanılarak kaydedin. Organoidleri kontrol ve işlenmiş gruplar arasında eşleşen zaman noktalarında toplayın; tüm örneklerde aynı kaplama yoğunluğu, tedavi programı ve ortam değişim koşulları korunur.
Her kuyunun kültür ortamını tamamen aspire edin. Her kuyuyu buz gibi PBS ile iki kez yıkayarak kalan ortam ve kalıntıları temizleyin. Her kuyuya bir mililitre buz soğukluğu hücre iyileştirme solüsyesi ekleyin ve 20 ila 30 dakika boyunca buzda kuluçka yapın.
İnkubasyon sırasında her beş ila yedi dakikada bir nazikçe pipet yapın, böylece matriks çözünmesini kolaylaştırın. Çözünmüş malzemeyi geniş bir delik veya kesilmiş pipet ucu kullanarak önceden soğutulan tüplere aktararak sert gerilimi en aza indirin. Enzimatik ayrışmaya ancak matris büyük ölçüde çözüldükten ve minimal görünür jel kalıntısı kaldıktan sonra devam edin.
Geri kazanılan organoid süspansiyonu 300 G'de beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj edin. Süpernatantı peleti rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın. Pelleti bir mililitre rekombinant hücre ayrıştırma enzimiyle yeniden askıya alın ve 37 derece Celsius'ta beş ila 10 dakika kuluçka yapın.
Dissosiyasyonu artırmak için her iki-üç dakikada bir sekiz-on kez nazikçe pipetle geniş delikli P1000 ucu ile nazikçe pipet yapın. Çoğu organoid parça tek hücreye dağıldığında ve geriye sadece küçük kalıntı kümeleri kaldığında sindirimi durdurun. Sonra, sindirimi durdurmak için %2 fetal sığır serumu içeren dört mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin.
Sonra, süspansiyonu 40 mikrometrelik bir hücre süzgencesinden filtreleyin. Kalan enzim, agregalar ve kalıntıları çıkarmak için PBS ile bir kez yıkayın. Hücreleri trypan blue hariç tutarak say.
Hücre canlılığı %85 veya üzerinde olduğundan emin olunduktan sonra, nihai hücre konsantrasyonunu 700'e ayarlayarak mikrolitre başına 1.200 hücreye ayarlayın. Aşırı döküntü, bol ölü hücre, büyük görünür agregalar veya eksik ayrışma içeren örnekleri dışlayın. Agregalar varsa yüklemeden önce filtreleme tekrarlanın.
Aynı koşullarda işlem kontrolü ve işlenmiş örnekler, bunlar arasında dissosiyasyon enzimi, sindirim süresi, pipetleme sıklığı, filtrasyon yöntemi, hücre konsantrasyonu ve yükleme stratejisi dahil. Son olarak, tek hücreli kütüphane amplifikasyonundan sonra tek hücreli dizileme işlemi yapılacaktır. Organoid, iyileşme sonrası ilk günden altıncı güne kadar standart üç boyutlu kültür koşullarında hayatta kaldı ve genişledi.
İlk günde, organoidler küçük kompakt yapılar olarak ortaya çıktı, altıncı güne gelindiğinde ise boyutları arttı ve iyi tanımlanmış morfolojiler sergilediler. Lenvatinib ile işlenmiş organoidler, DMSO ile tedavi edilen kontrol gruplarına kıyasla daha küçüktü ve morfolojide değişiklik gösterdi. Nicel analiz, lenvatinib tedavisinden sonra DMSO kontrollerine kıyasla ortalama organoid çapında bir azalma olduğunu gösterdi.
Bu protokol, tedavi sonrası hücre durumu, hücre bileşimi ve gen ifadesindeki değişiklikleri incelememize olanak tanır. En büyük zorluk, hücre yaşamını korumak, tüm gruplar arasında basit işlemenin tutarlı kalmasıdır. Bu prosedürle birlikte hücresel aşağı akış analizi yapılabilir; kümeleme, diferansiyel gen deneyleri analizi, yol zenginleştirme analizi ve hazine çıkarımı dahil.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Overview
This article presents a standardized workflow for generating hepatocellular carcinoma (HCC) organoids, applying drug treatment, and performing single-cell RNA sequencing to analyze transcriptional changes before and after treatment. The protocol is robust, scalable, and adaptable to other tumor organoid systems, enabling detailed characterization of cellular composition and gene expression changes associated with drug exposure.
Key Study Components
Area of Science
- Cancer biology
- Organoid technology
- Single-cell transcriptomics
Background
- Hepatocellular carcinoma is a leading cause of cancer-related deaths worldwide.
- Marked intratumoral heterogeneity in HCC contributes to variable treatment responses and disease progression.
- Understanding transcriptional changes in tumor cells before and after drug treatment is critical for improving therapies.
- Existing workflows connecting organoid-based drug treatment with single-cell transcriptomic profiling are limited.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for drug treatment and single-cell RNA sequencing of HCC organoids.
- To enable side-by-side comparison of cellular and transcriptional changes in response to therapy.
- To provide technical guidance for improving reproducibility and sample quality in organoid studies.
Methods Used
- Establishment and expansion of HCC patient-derived organoids.
- Drug treatment with lenvatinib and vehicle control under standardized conditions.
- Imaging and quantitative assessment of organoid morphology, area, diameter, and viability.
- Single-cell dissociation, viability assessment, and preparation for single-cell RNA sequencing.
- Comparative analysis of single-cell transcriptomic data, including clustering and pathway enrichment.
Main Results
- Lenvatinib-treated organoids showed reduced size and altered morphology compared to controls.
- Quantitative analysis revealed a decrease in mean organoid diameter after drug treatment.
- The protocol preserved high cell viability and reproducibility across samples.
- Single-cell RNA sequencing enabled detailed analysis of cell state, composition, and gene expression changes post-treatment.
Conclusions
- The workflow provides a practical and scalable approach for studying drug responses in HCC organoids at single-cell resolution.
- It facilitates robust comparative analysis of transcriptional changes associated with therapy.
- The protocol is adaptable to other organoid systems and supports downstream cellular analyses.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of hepatocellular carcinoma (HCC) organoids before and after drug treatment addresses the challenge of intratumoral heterogeneity and variable therapeutic response. This workflow enables high-resolution analysis of cellular and transcriptional changes, supporting predictive confidence in early-stage oncology discovery. The protocol's scalability and adaptability position it as a reusable platform for portfolio-wide mechanistic de-risking and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing drug-induced transcriptional shifts at single-cell resolution.
- Supports biological de-risking through detailed mapping of cell state and composition changes post-treatment.
- Facilitates functional target validation by linking drug exposure to specific gene expression alterations.
- Provides predictive confidence for triaging candidate compounds based on mechanistic response profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid systems for downstream screening and quantitative assessment of drug effects.
- Standardizes imaging, viability, and morphological metrics to ensure reproducibility and assay reliability.
- Enables scalable, side-by-side evaluation of compound efficacy using robust, quantitative outputs.
- Supports platform reuse across different tumor organoid models for broader screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro drug response data with disease-relevant cellular heterogeneity observed in patient tumors.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling comparative transcriptomic analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing pathway-level and cell-type-specific drug effects.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker identification and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging drug perturbation studies with high-content single-cell analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping drug-induced gene expression changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in organoid models.
- Analytics: Enables clustering, differential expression, and pathway enrichment analyses to compare treatment conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular diversity and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for repeated use across oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in drug response studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for organoid-based analytics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets based on high-content data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, single-cell dissociation, and transcriptomic library preparation.
- Demands access to advanced imaging, cell viability assessment, and single-cell sequencing infrastructure.
- Necessitates strict cross-team standardization of imaging, dissociation, and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable across different tumor organoid systems with attention to model-specific dissociation and viability challenges.
- Sample quality and cell viability are critical limitations that must be managed throughout processing.
