Name: Immüno Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-20T14:38:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Öğrenin immüno baskılama tekniğini protein ayrıştırma, membrana transfer ve antikor bazlı görselleştirme adımlarıyla. Bu yöntem belirli antijenleri hassas şekilde tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu deneysel bir yaklaşım için tam metin protokolü mevcuttur <a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471142720/cp/cpmb/article/mb1008/current/abstract]">Moleküler Biyoloji Mevcut Protokoller</a>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

immüno analizi

Immunoblot Analysis

(Batı blot) İmmünoblotting antijen-antikor tanıma doğasında özgüllüğü istismar çalışır proteinlerin saptanması ve karakterizasyonu için hızlı ve duyarlı bir testtir. Bu transferi ve geri dönüşü olmayan nicel nitroselüloz için bağlayıcı, PVDF, ya da naylon jel elektroforezi ile çözünmüş ve elektroforetik ayırma, proteinler, glikoproteinler veya lipopolisakkaridinin içerir. Immunoblotting tekniği poliklonal veya monoklonal antikorlar tarafından tanınan özel antijenleri belirlenmesinde yararlı olmuştur ve son derece duyarlıdır (1 ng antijen tespit edilebilir). Bu birim, protein ayırma protokolleri, proteinler membranlar üzerine blot, immunoprobing, kromojenik veya kemilüminesan yüzeyler kullanarak görselleştirme sağlar.

(Batı blot) İmmünoblotting antijen-antikor tanıma doğasında özgüllüğü istismar çalışır proteinlerin saptanması ve karakterizasyonu için hızlı ve duyarlı bir testtir. Bu video protein ayırma protokolleri, proteinler membranlar üzerine blot, immunoprobing, kromojenik veya kemilüminesan yüzeyler kullanarak görselleştirme sağlar.

Immüno Analizi

İmmünoblotlama (western blotting), ... avantajlarından yararlanarak proteinlerin saptanması ve karakterizasyonu için kullanılan hızlı ve hassas bir analiz yöntemidir.

Genellikle Western blotting olarak adlandırılan immünoblotlama, bir protein örneği içerisinde poliklonal veya monoklonal antikorlar tarafından tanınan spesifik antijenlerin tanımlanması için kullanılır. Bu prosedür tipik olarak tek veya iki boyutlu jel elektroforezini takip eder ve ayrıştırılmış proteinlerin nitroselüloz membranlara transferini içerir. Bu membranların, enzimlerle doğrudan veya dolaylı olarak konjüge edilmiş primer ve sekonder antikorlarla inkübe edilmesi ve protein antijenlerinin renkli veya floresan substrat reaksiyonları kullanılarak bu membranlar üzerinde görselleştirilmesi sürecidir.Bu videoda, bir immünoblotlama prosedürünün adım adım gösterimini sunuyoruz. Merhaba, ben UVPI'dan Sean Gallagher; buradaki KE Graduate Institute proteomik merkeziyle iş birliği yapıyorum. Bugün sizlere immünoblotlama analizini göstereceğim.Bu süreç; protein ayırma, proteinlerin membranlara aktarılması, immün problama ve kromojenik ile kemilüminesans substratlar kullanılarak görselleştirme dahil olmak üzere bir dizi adım içerir. Öyleyse başlayalım. İmmün blotting prosedürüne başlamadan önce, protein örnekleri öncelikle küçük veya standart boyutlu tek veya iki boyutlu jeller kullanılarak elektroforez ile ayrılmalıdır.Antijenik örnekleri hazırlayın ve geldeki hatlara yükleyin; bir veya daha fazla gel hattına önceden boyanmış veya biyotinize protein, moleküler ağırlık standartları ekleyin. Bu protein belirteçleri membrana aktarılacak ve immün boyama sonrası membran yönelimini ve protein boyutlarını kolayca belirtecektir. Elektroforez tamamlandığında, immün blotu oluşturmaya hazırız.İmmünoblotu hazırlamak için önce jel sandviçini sökün ve yığma jelini çıkarın; jeli oda sıcaklığında transfer tamponu içerisinde 30 dakika boyunca dengeleyin. Bu dengeleme işlemi, transfer sırasında jelin boyutunun değişmesini önlemek için gereklidir. Jel dengelenirken, plastik transfer kasetini içine alacak büyüklükte bir tepsiyi transfer tamponuyla kaseti örtecek şekilde doldurarak transfer sandviçinin kurulumuna başlayın. Şimdi plastik transfer kasetinin alt yarısına bir scotch bright ped veya sünger yerleştirin.Ardından, jel ile aynı boyutta kesilmiş bir filtre kağıdı parçası alın. Transfer tamponu ile önceden ıslatın ve scotch bright pedin üzerine yerleştirin. 30 dakikalık jel dengeleme işlemi tamamlandığında, jeli filtre kağıdının üzerine yerleştirin.Bir deney tüpünü veya cam çubuğu jel yüzeyi üzerinde hafifçe yuvarlayarak jel ile filtre kağıdı arasındaki hava kabarcıklarını giderin. Alternatif olarak, BioRad kiti ile birlikte gelen BioRad silindirini kullanabilirsiniz. Filtre kağıtlarını, jelleri ve membranları manipüle ederken eldiven kullanmayı unutmayın.Ellerinizdeki yağ transferi engelleyecektir. Ardından, transfer membranını hazırlayın. Membranı, jelin boyutundan her kenarda bir ila iki milimetre daha büyük olacak şekilde kesin.Ardından, membranı bir kenarı 45 derecelik açı yapacak şekilde yavaşça distile suyun içine yerleştirin; su membranın içine kılcallıkla yükselecek ve zamanla tüm yüzeyi ıslatacaktır. Suya çok hızlı yerleştirilirse hava hapsolur ve membran üzerinde beyaz lekeler şeklinde görünür. Protein bu bölgelere transfer olmayacaktır.Membran tamamen ıslandığında, 10 ila 15 dakika boyunca dengeleme ve transfer tamponuyla bekletin. Bu ıslatma prosedürü nitroselüloz ve naylon membranlar için uygundur. Sadece PVDF membranlar hidrofobiktir ve sadece distile su veya transfer tamponuna yerleştirilerek ıslanmazlar.PVDF membranlar önce bir ila iki saniye boyunca %100 metanol içine daldırılmalı, ardından transfer tamponunda 10 ila 15 dakika boyunca dengelenmelidir. Membranın herhangi bir zamanda kurumasına izin vermeyiniz.Bu durum gerçekleşirse, önce metanol ile ve ardından transfer tamponu ile tekrar ıslatın. Membran hazır olduğunda, önceden ıslatılmış membranı doğrudan jelin üst kısmına yerleştirin. Membran yüzeyinde bir deney tüpü cam çubuğunu veya BioRad silindiri nazikçe gezdirerek jel ile membran arasındaki tüm hava kabarcıklarını gidermeyi unutmayın.Ardından, başka bir parça 3 mm Whatman filtre kağıdını ıslatın. Sonra bunu membranın üzerine yerleştirin ve tekrar tüm hava kabarcıklarını giderin. Daha sonra, bu filtre kağıdının üzerine başka bir Scotch-Brite ped veya sünger yerleştirin.Transfer kasetinin üst yarısını yerine kilitleyerek immünoblot sandviç düzeneğini tamamlayın. İmmünoblot sandviçi oluşturulduğuna göre, proteinleri jelden membrana transfer etmeye hazırız. Transfer prosedürüne başlamak için elektro-blotting tankını transfer tamponuyla doldurun ve sandviç düzeneğini içeren transfer kasetini elektro-blotting cihazına yerleştirin.Sandviçin, membranın anot tarafına veya tankın pozitif yüklü tarafına bakacak şekilde yerleştirilmesi önemlidir. Güç kaynağının uçlarını, elektrotransfer aparatının ilgili anot ve katot taraflarına bağlayın. Bu spesifik kriter blot cihazı, bir soğutucu buz bloğu ile birlikte gelir.Şimdi, proteinlerin jelden membrana elektroforetik transferini, soğutma ile 50 voltta 30 ila 60 dakika boyunca veya soğuk odada 14 voltta gece boyunca gerçekleştirin. Transfer tamamlandığında, güç kaynağını kapatın ve düzeneği sökün. Ardından membranı blotting düzeneğinden çıkarın ve bir köşesini keserek yönünü belirleyin.Bu noktada membranlar kurutulabilir ve yeniden kapatılabilir plastik bir torba içinde dört derece Celsius'ta bir yıl boyunca saklanabilir. Daha ileri işlemlerden önce, kurutulmuş PVDF membranlar, membranı ıslatmak için az miktarda %100metanol içine yerleştirilmelidir. Ardından, metanolü uzaklaştırmak için distile su içerisine konulmalıdır.Yönlendirme işaretlendikten sonra, transfer verimliliğini doğrulamak için jeli boyayın. Transfer edilen proteinleri görüntülemek için membranı cipro ruby ile geri dönüşlü olarak veya kamasi blue India ink, naphthol blue veya kolloidal altın ile geri dönüşsüz olarak boyayabilirsiniz. Bu geri dönüşsüz boyama prosedürleri naylon membranlar ile uyumlu değildir.Proteinler membrana aktarıldığına göre, immün prob ve proteinlerin görsel tespiti aşamasına geçin. Bu adımda, membrandaki immobilize proteinler, mevcut antijenleri tanımlamak ve miktarını belirlemek için spesifik antikorlarla taranır. Başlamak için membranı, 20 milliliters bloklama tamponu içeren plastik bir inkübasyon tepsisine yerleştirin.Bazı kişiler torba kullanır, ancak farklı primer antikor çözeltilerinde çok sayıda şeridin işlendiği durumlarda özellikle kullanışlı oldukları için genellikle tepsiler tercih edilir. Ardından, mühürlenmiş membranı oda sıcaklığında, bir orbital sarsıcı veya sallama platformu üzerinde ajitasyonla 30 ila 60 dakika boyunca inkübe edin. Membran inkübe olurken primer antikoru ve bloklama tamponunu seyreltin.Dilüsyon ampirik olarak belirlenir, ancak tipik olarak 1:100 ile 1:1000 arasındadır. Poliklonal antikorlar için; hibrit süpernatanlarda 1:10 ile 1:100 arasında, monoklonal antikorlar içeren murin asit sıvılarında ise 1:1000'den daha yüksek dilüsyonlar kullanılır. İnkübasyon tamamlandığında, bloklama tamponunu dökün.Tampon çözeltiyi seyreltilmiş primer antikor ile değiştirin ve sabit ajitasyon altında, oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca tekrar inkübe edin. Ardından, NITROCELLULOSE veya PVDF filtreler için 100 mililitre TTBS veya naylon filtreler için TBS ile ajite ederek membranı dört kez yıkayın.Membran yıkanırken her seferinde 10 ila 15 dakika boyunca yıkayın, sekonder antikoru bloklama tamponunda seyreltin. Sekonder antikor örnekleri arasında horseradish peroksidaz veya alkalin fosfataz, anti IG konjugatı ve ticari olarak mevcut enzim konjugatları yer alır. Sekonder antikorlar genellikle kullanımdan önce 1/200 ile 1/25.000 oranında seyreltilir.Yıkama adımları tamamlanıp yıkama materyalleri atıldıktan sonra, seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz veya alkalin fosfataz, anti IG konjuge ekleyin ve oda sıcaklığında, sabit ajitasyon altında 30 ila 60 dakika inkübe edin. 30 ila 60 dakika sonra, membranı kaptan çıkarın ve daha önce açıklandığı şekilde TTBS içerisinde, her biri 10 ila 15 dakika sürecek şekilde dört kez yıkayın.Yıkama işlemleri tamamlandığında, görselleştirme adımına geçmeye hazırız. Ancak öncelikle, alternatif bir immün problama prosedürünü göstereceğiz. Bu alternatif immün problama prosedürü, Vector Labs'in Vector Stain ABC kitine dayanmaktadır.Biyotillenmiş sekonder antikora horseradish peroksidaz (HRP) veya alkalin fosfataz (AP) bağlamak için bir avidin-biotin kompleksi kullanılır. Bugün HRP kitini uygulamalı olarak göstereceğiz. TTBS, avidin-biotin sistemleri için bloklama tamponu olarak oldukça uygundur.Ancak naylon filtreler için, yağsız süt tozunun immünanalizi engelleyecek kalıntı biyotin içermesi nedeniyle protein bağlayıcı reaktifler önerilir. Sadece bloklama adımında kullanılmalı; membran, orbital bir çalkalayıcı veya sallanır platform kullanılarak sürekli ajitasyon altında, açık bir tepside bloklama tamponu ile dengeye getirilmeye başlanmalıdır. Membran dengeye gelirken, oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.Birincil antikor çözeltisini hazırlayın. Yüksek hassasiyetli Adenin Biotin sistemli NITROCELLULOSE veya PVDF membranlar için TTBS kullanın.Primer antikor içeren serumun dilüsyonları genellikle 1/1000 ile 1/100.000 arasında değişir. Kemilüminesans kimyasının kullanımı, dilüsyonların daha yüksek aralıklarda olmasını gerektirir. Bizim durumumuzda, kromojenik yöntem gösterilmektedir.Birincil antikoru 5.000'de 1 oranında dilüsyonla kullanıyoruz. Dengeleme işlemi tamamlandıktan sonra bloklama tamponunu uzaklaştırın. Ardından, membranı kaplayacak miktarda birincil antikor solüsyonu ekleyin.Membranı oda sıcaklığında, hafifçe sallayarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Nitrocellulose membranı, beşer dakikalık aralıklarla üç kez TTBS ile yıkayın. Yıkama aşaması sırasında, bir damla biyotinize antikoru 10 mililitre TTBS ile seyrelterek biyotinize sekonder antikor çözeltisini hazırlayın. Yıkama adımları tamamlandığında, sekonder antikor çözeltisini ekleyin.Membran, sekonder antikor ile inkübe edilirken oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça sallanarak inkübe edin. Bunun için avadon biotin HRPO'yu hazırlayın. 10 mililitre içerisine iki damla vti boyama reaktifi A ve iki damla reaktif B karıştırın.Nitroksellüloz için TTBS. Sekonder antikor inkübasyonu tamamlandığında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Membranı 15 dakikalık bir süre boyunca üç kez TTBS veya TBS ile yıkayın.Ardından, avidan biotin enzim çözeltisini membrana ekleyin ve oda sıcaklığında, yavaşça sallayarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra membranı, 10 dakikalık aralıklarla üç kez TTBS ile yıkayın. İmmün prob yöntemi tamamlandığına göre, membrana bağlı proteinler kromojenik substratlar ile görüntülenmeye hazırdır.Bu son görselleştirme adımı için, horseradish peroksidaz tabanlı immün tespit prosedürlerinde genellikle dört CN dab/ICL 2 ve TMB substratları kullanılır. İmmün prob prosedürü sırasındaki son membran yıkaması TTBS ile yapıldıysa, membranı oda sıcaklığında 50 mL TBS ile 15 dakika boyunca yıkayın. Şimdi membranı kromojenik görselleştirme solüsyonuna yerleştirin.Protein bantları 10 ila 30 dakika içinde görünmelidir. 30 dakikalık inkübasyonun ardından substrat reaksiyon karışımını atın ve distile su ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. İmmünoblotlama, bir veya iki boyutlu elektroforezin ardından spesifik proteinlerin varlığını tespit etmek için binlerce laboratuvar tarafından kullanılan çok aşamalı bir prosedürdür.Size bir immün kan analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş oldum. Hepsi bu kadar. Deneylerinizde başarılar dilerim, izlediğiniz için teşekkürler.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

En korunmuş dizileri biyoinformatik analizleri ile tespit hedefleyen evrensel bir antikor kullanarak influenza virüs hemaglutinin ve nöraminidaz miktarının tayini için basit bir yuva blot yöntemi geliştirilmiştir. Bu yenilikçi yaklaşım, tüm viral hemaglutinin ve nöraminidaz kantitatif tayini için kullanışlı bir alternatif sunabilir.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Luminex Corporation Xmap mikroküre teknolojisini kullanarak, çeşitli laboratuvar hayvanı türlerinin serosurveillance için Multiplexed Florometrik immunoassay (MFIA) geliştirdik. MFIA antijeni, doku kontrolü veya immünglobulin kovalent renk kodlu polistiren mikroküreler bağlantılı bir süspansiyon mikroarray olduğunu. MFIA test yöntemi hem de çeşitli giderme konularını ele almaktadır.

Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

Bu videoda, bir serum örneğindeki çeşitli antikor izotiplerini aynı anda tespit etmek için farklı antijenlerle birleştirilmiş floresan manyetik boncuklar veya mikroküreler kullanan bir immünolojik test tekniği açıklanmaktadır. Test, bir enfeksiyon sırasında veya aşılama sonrası serokonversiyonun anlaşılmasında yardımcı olur.

Multianalit İmmünoboncuk Testi: İnsan Serum Numunesinde Çoklu Antikor Alt Tiplerinin Eşzamanlı Tespiti için Akış Tabanlı Bir İmmünoassay Tekniği

Burada biz ayrıntılı işlem nicel dot blot Analizi (QDB) mutlak içerik hedefli bir proteinin belirlenerek aktin proteini, gelsolin gibi (CAPG), üç farklı fare dokularda kapatma göstermek. Biz yüksek üretilen iş, cep ve doku düzeyinde biyomarker doğrulama için uygun, nicel immunoblot tekniği göstermektedir.

Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Burada açıklamak için geliştirme ve insan örneklerinde tüm IFN-α türlerinden Ultra-duyarlı algılama sağlayan bir tek molekül dizi dijital ELISA yöntemi, doğrulama iletişim kuralı mevcut.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Nicel immunoblotting ayirt Histoloji formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi bir protein miktarının aracı olarak görüntü analizi ile birleştiğinde doğrulamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bizim sonuçlar biyomarker proteinler rutin biyopsi örneklerinde göreli miktarı ascertaining için ayirt Histoloji yarar gösterilmektedir.

Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak

Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

Protein-protein etkileşimleri, hedef proteinlerin işlevini aydınlatmak için önemlidir ve ko-immünopresipitasyon (co-IP), PPI'leri kolayca doğrulayabilir. Epitop etiketli bir proteini kodlayan bir plazmiti HEK-293 hücrelerine geçici olarak transfekte ettik ve iki hedef proteinin bağlanmasını kolayca doğrulamak için bir immünopresipitasyon yöntemi geliştirdik.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Anti-Epitop Etiket Afinite Jeli ile İmmünopresipitasyon

Bu makale, Xenopus oositlerinden ve embriyolarından alınan proteinleri immünoblotlama ile analiz etmek için bir protokolü açıklamaktadır. Toplama adımları açıklanır, ardından numune işleme, SDS-PAGE, transfer, antikor boyama ve görüntülemeye karşılık gelen adımlar gelir. Protokol, endojen antikorlar ve protein afinite etiketlerine karşı antikorlar içeren translasyonel düzenleyici protein komplekslerinin incelenmesini vurgulamaktadır.

Xenopus Oositlerinden ve Embriyolarından Elde Edilen Proteinlerin İmmünoblotlama ile Optimize Edilmiş Analizi

Öğrenin immüno baskılama tekniğini protein ayrıştırma, membrana transfer ve antikor bazlı görselleştirme adımlarıyla. Bu yöntem belirli antijenleri hassas şekilde tespit eder.

Immüno Analizi

Daha fazla video keşfet