Immüno Analizi

Genellikle Western blotlama olarak adlandırılan immünoblotlama, bir protein numunesi içinde, poliklonal veya monoklonal antikorlar tarafından tanınan spesifik antijenleri tanımlamak için kullanılır. Bu prosedür tipik olarak bir veya 2D jel elektroforezini takip eder ve ayrılan proteinlerin nitroselüloz membranlara transferini içerir. Bu zarların doğrudan veya dolaylı olarak enzimlere konjuge edilmiş primer ve sekonder antikorlarla inkübasyonu ve bu zarlar üzerinde protein antijenlerinin renkli veya floresan substrat reaksiyonları kullanılarak görselleştirilmesi.

Bu videoda, bir immün blok oluşturma prosedürünün adım adım gösterimini sunuyoruz. Merhaba, ben UVPI'den Sean Gallagher, KE Graduate Institute'ta bir proteomik merkezle işbirliği yapıyorum. Bugün size immünoblotlama analizini göstereceğim.

Protein ayrımı, proteinlerin zarlara lekelenmesi, immüno-problama ve kromojenik ve kim lüminesans substratları ile görselleştirme dahil olmak üzere bir dizi adımı içerir. Öyleyse başlayalım. İmmünoblotlama prosedürüne başlamadan önce, protein örnekleri önce küçük veya standart boyutlu bir veya iki boyutlu jeller kullanılarak elektroforez ile ayrılmalıdır.

Antijenik numuneleri hazırlayın ve bunları jel üzerindeki şeritlere yükleyin, jel şeritlerinden bir veya daha fazlasında önceden boyanmış veya biyotinile edilmiş protein, moleküler ağırlık standartlarını dahil edin. Bu protein belirteçleri zara geçecek ve immüno-boyamadan sonra zar oryantasyonunu ve proteinlerin boyutlarını uygun bir şekilde gösterecektir. Elektroforez tamamlandıktan sonra, immünoblotu birleştirmeye hazırız.

İmmüno lekesini monte etmek için İlk olarak, jel sandviçi sökün ve istifleme jelini çıkarın, jeli 30 dakika dengeleyin Transfer tamponundaki oda sıcaklığında, jel dengelenerken transfer sırasında jelin boyutunda bir değişikliği önlemek için bu dengeleme gereklidir. Transfer sandviçini, kasetin üzerini kaplayacak şekilde plastik transfer kaseti dolgusunu transfer tamponu ile tutacak kadar büyük bir tepsiye monte etmeye başlayın. Şimdi plastik transfer kasetinin alt yarısına viski parlak bir ped veya sünger yerleştirin.

Ardından, jel ile aynı boyutta kesilmiş bir filtre kağıdı alın. Transfer tamponu ile önceden ıslatın ve viski parlak pedin üzerine yerleştirin. 30 dakikalık jel dengesi yapıldıktan sonra, jeli filtre kağıdının üzerine yerleştirin.

Jelin yüzeyi üzerinde bir test tüpü veya cam çubuk hafifçe yuvarlayarak jel ve filtre kağıdı arasındaki hava kabarcıklarını çıkarın. Veya BioRad kiti ile birlikte gelen BioRad silindirini kullanabilirsiniz. Filtre kağıtlarını, jelleri ve zarları manipüle ederken eldiven kullanmayı unutmayın.

Elinizdeki yağ transferi engelleyecektir. Ardından, transfer membranını hazırlayın. Membranı jel ile aynı boyutta ve her kenarda bir ila iki milimetre kesin.

Daha sonra zarı, bir kenarı 45 derecelik bir açıyla yavaşça damıtılmış suya yerleştirin, su zarın içine doğru fitillenecek ve sonunda tüm yüzeyi ıslatacaktır. Suya iki hızlı bir şekilde yerleştirilirse, hava sıkışır ve zarda beyaz lekeler olarak görünür. Protein bu bölgelere geçmeyecektir.

Membran tamamen ıslandığında, 10 ila 15 dakika dengeleyin ve tamponu aktarın. Bu ıslatma prosedürü nitroselüloz ve naylon membranlar için işe yarar. Sadece PVDF membranları hidrofobiktir ve sadece damıtılmış suya yerleştirilmekten veya transfer edilmekten dolayı ıslanmaz. Arabellek.

PVDF membranları önce bir ila iki saniye boyunca %100 metanole daldırılmalı, ardından 10 ila 15 dakika dengelenmelidir. Aktarım tamponunda. Membranın hiçbir zaman kurumasına izin vermeyin.

Bu meydana gelirse, bir kez daha metanol ve ardından transfer tamponu ile ıslatın. Membran hazır olduğunda, önceden ıslatılmış membranı doğrudan jelin üst tarafına yerleştirin. Bir test tüpü, cam çubuk veya BioRad silindirini zarın yüzeyi üzerinde nazikçe yuvarlayarak jel ve zar arasındaki tüm hava kabarcıklarını çıkarmayı unutmayın.

Sonra ıslak, başka bir watman üç mm filtre kağıdı parçası. Ardından zarın üzerine yerleştirin ve tekrar tüm hava kabarcıklarını çıkarın. Ardından bu filtre kağıdının üzerine başka bir viski parlak ped veya sünger yerleştirin.

Transfer kasetinin üst yarısını yerine kilitleyerek immünoblo lekeli sandviçin montajını tamamlayın. Artık immüno-leke sandviçi monte edildiğine göre, proteinleri jelden zara aktarmaya hazırız. Transfer prosedürüne başlamak için, elektro lekeleme tankını transfer tamponu ile doldurun ve sandviçi içeren transfer kasetini elektro lekeleme aparatına yerleştirin.

Membranın tankın anot veya pozitif yüklü tarafına bakması için sandviç için önemlidir. Güç kaynağının uçlarını elektro lekeleme aparatının ilgili anot ve katot taraflarına bağlayın. Bu özel kriter kurutma kağıdı, bir soğutma buz bloğu ile birlikte gelir.

Şimdi, elektroforetik transfer proteinleri jelden zara 30 ila 60 dakika boyunca 50 voltta soğutma ile veya gece boyunca soğuk bir odada 14 voltta geçirir. Aktarım tamamlandığında, güç kaynağını kapatın ve cihazı sökün. Daha sonra zarı lekeleme aparatından çıkarın ve bir köşeyi keserek yönü not edin.

Bu noktada, membranlar kurutulabilir ve bir yıl boyunca dört santigrat derecede yeniden kapatılabilir bir plastik torbada saklanabilir. Daha sonraki işlemlerden önce, kurutulmuş PVDF membranları, membranı ıslatmak için az miktarda %100 metanol içine yerleştirilmelidir. Daha sonra metanolü çıkarmak için damıtılmış suda.

Oryantasyon işaretlendikten sonra, transfer verimliliğini doğrulamak için jeli boyayın. Aktarılan proteinleri görselleştirmek için, zarı yakutla geri dönüşümlü olarak veya kamasi mavisi Hindistan mürekkebi, naftol mavisi veya kolloidal altın ile geri dönüşümsüz olarak boyayabilirsiniz. Bu geri dönüşü olmayan boyama prosedürleri naylon membranlarla uyumlu değildir.

Artık proteinler zara aktarıldığına göre, immün problama ve proteinlerin görsel tespiti ile devam edin. Bu adımda, zar üzerindeki hareketsizleştirilmiş proteinler, mevcut herhangi bir antijeni tanımlamak ve kantitatif hale getirmek için spesifik antikorlarla incelenir. Başlamak için, membranı 20 mililitre engelleme tamponu olan plastik bir inkübasyon tepsisine yerleştirin.

Bazı insanlar torba kullanır, ancak tepsiler genellikle bunun yerine kullanılır, çünkü farklı birincil antikor çözeltilerinde çok sayıda şeridi işlerken özellikle yararlıdırlar. Daha sonra, kapalı zarı 30 ila 60 dakika inkübe edin Oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı veya sallanan platform üzerinde çalkalama ile. Membran inkübe edilirken, birincil antikoru ve bloke edici tamponu seyreltin.

Seyreltme ampirik olarak belirlenir, ancak tipik olarak bir ila 100 ila bir ila 1000 arasındadır. Bir poliklonal antikor için, hibrit süpernatanlar için 100'de bir ila 100 ila bir ve monoklonal antikorlar içeren murin asitleri sıvısı için bir ila 1000'den fazla. İnkübasyon tamamlandığında, bloke edici tamponu boşaltın.

Tamponu seyreltilmiş primer antikor ile değiştirin ve tekrar oda sıcaklığında sürekli çalkalama ile 30 ila 60 dakika inkübe edin. Daha sonra, 100 mililitre ile çalkalayarak zarı dört kez yıkayın. NİTROSELÜLOZ veya PVDF filtreler için TTBS veya naylon filtreler için TBS.

Membran yıkanırken her seferinde 10 ila 15 dakika yıkayın, ikincil antikoru bloke edici tamponda seyreltin. İkincil antikorların örnekleri arasında at turpu peroksidaz veya alkalin fosfataz, anti IG konjugat, ticari olarak temin edilebilen konjuge enzim bulunur. İkincil antikorlar genellikle kullanımdan önce bir ila 200 ila 25.000 oranında seyreltilir.

Yıkama adımları tamamlandıktan ve yıkama malzemeleri atıldıktan sonra, seyreltilmiş at turpu peroksidaz veya alkalin fosfataz, anti IG konjugatı ekleyin ve sürekli çalkalama ile oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika inkübe edin. 30 ila 60 dakika sonra, zarı hazneden çıkarın ve her seferinde 10 ila 15 dakika olmak üzere dört kez yıkayın. Daha önce açıklandığı gibi TTBS'de.

Yıkamalar tamamlandıktan sonra görselleştirme adımına geçmeye hazırız. Ama önce, alternatif bir immün araştırma prosedürü göstereceğiz. Bu alternatif immün problama prosedürü, Vector Labs'ın vektör boyası A BC kitine dayanmaktadır.

Biyotinile edilmiş ikincil antikora at turpu peroksidaz veya HRPO veya alkalin fosfataz A A P bağlamak için bir avidan biyotin kompleksi kullanır. Bugün HRPO kitini tanıtacağız. TTBS, avadon biyotin sistemleri için bir bloke edici tampon olarak çok uygundur.

Ancak naylon filtreler için protein bağlayıcı reaktifler önerilir, çünkü yağsız kuru süt, immünolojik teste müdahale edecek artık biyotin içerir. Bloke etme adımında, yalnızca bir orbital çalkalayıcı veya sallanan platform kullanarak sürekli çalkalama ile açık bir tepside bloke edici tampondaki membranı dengelemeye başlamak için kullanılmalıdır. Membran dengelenirken membranı oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika inkübe edin.

Birincil antikor çözeltisini hazırlayın. Yüksek hassasiyetli Aden NITROSELÜLOZ veya PVDF membranlar için TTBS kullanın. Biyotin sistemleri.

Primer antikor içeren cera seyreltilmesi genellikle 1000'de bir ile 100.000'de bir arasında değişir. Kemilüminesan kimyasının kullanımı, daha yüksek seyreltme aralığı gerektirir. Bizim durumumuzda, kromojenik gösteriyor.

Primerin 5.000'de bir seyreltmesini kullanıyoruz. E dengelemesi yapıldıktan sonra, engelleme tamponunu çıkarın. Daha sonra zarı kaplayacak kadar birincil antikor çözeltisi ekleyin.

Membranı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve 30 dakika sonra hafifçe sallayın. Membranı nitroselüloz için TTBS'de beş dakikalık aralıklarla üç kez yıkayın Yıkama aşaması sırasında, bir damla biyotinile antikoru 10 mililitre TTBS ile seyrelterek biyotinile edilmiş ikincil antikor çözeltisini hazırlayın. Yıkama adımları tamamlandıktan sonra ikincil antikor solüsyonunu ekleyin.

Membran ikincil antikor ile inkübe edilirken, zarı oda sıcaklığında yavaş sallanarak 30 dakika inkübe edin. Bunu yapmak için avadon biotin HRPO'yu hazırlayın. İki damla vti leke reaktifi A ve iki damla reaktif B'yi 10 mililitreye karıştırın.

Nitroselüloz için TTBS. İkincil antikor inkübasyonu tamamlandığında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Membranı TTBS veya TBS ile 15 dakikalık bir süre boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra, avidan biotin enzim çözeltisini zara ekleyin ve yavaş sallanarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra membranı 10 dakika aralıklarla üç kez TTBS ile yıkayın. Artık immün problama prosedürü tamamlandığına göre, zara bağlı proteinler kromojenik substratlarla görüntülenmeye hazırdır.

Bu son görselleştirme adımı için, substratlar dört, CN, dab, eğik çizgi, ICL iki ve TMB, at turpu, peroksidaz bazlı immüno-tespit prosedürleri ile yaygın olarak kullanılır. İmmünoprob prosedürü sırasında son membran yıkaması TTBS'de yapıldıysa, membran oda sıcaklığında 15 dakika ve 50 mililitre yıkandı. TBS şimdi zarı kromojenik görselleştirme çözeltisine yerleştiriyor.

Protein bantları 10 ila 30 dakika içinde ortaya çıkmalıdır. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, substrat reaksiyon karışımını atın ve damıtılmış su ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. İmmüno-blotlama, bir veya 2D elektroforezi takiben spesifik proteinlerin varlığını tespit etmek için binlerce laboratuvar tarafından kullanılan çok adımlı bir prosedürdür.

Az önce size bir immün kan analizinin nasıl yapılacağını gösterdim. İşte bu kadar. Deneylerinizde iyi şanslar ve izlediğiniz için teşekkürler.