Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Bu yöntem, şu anda araştırma laboratuvarında ve klinik tanı alanında norm olan hücresel ve doku seviyelerinde protein içeriğinin geleneksel nispi yarı kantitatif miktar tayininden uzaklaşmak için doku düzeyinde ELISA olarak adlandırılabilir. Bu tekniğin temel avantajları, yüksek verimli, nicel ve mutlak olmak üzere üç kelimeyle tanımlanabilir. Başka bir kelime ekleyecek olsaydık, basit olurdu.

Bu tekniğin etkileri proteomik alanına kadar uzanırken, biyobelirteçlerin doğrulanması yüksek verimli formatta gerçekleştirilebilir. Bu yöntemin araştırma ve klinik alanda geniş uygulamaları vardır. Protein miktarının hücresel ve doku seviyelerinde ölçülmesi şu anda hala ilkeldir.

Genel olarak konuşursak, bu yönteme yeni olan bireyler bu tekniği öğrenirken herhangi bir sorunla karşılaşmazlar ve oldukça basittir ve gerçekleştirmek için minimum laboratuvar becerileri gerektirir. Hayvan modelini kullanarak tekniğin güvenilirliğini, basitliğini ve doğruluğunu göstermekten heyecan duyuyoruz. Numuneler, araştırma laboratuvarında yaygın olarak kullanılan MP40 veya Triton gibi deterjanlı veya deterjansız herhangi bir lizis tamponu kullanılarak herhangi bir geleneksel numune hazırlama yöntemiyle hazırlanabilir X.In bizim durumumuzda Triton X lizis tamponu kullanıyoruz.

1.5 mililitrelik bir tüpe beş ila 100 miligramlık bir doku dilimi yerleştirin. Ardından, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenmiş 200 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Daha sonra, dokuyu bir homojenizatör ile buz üzerinde bir dakika homojenize edin.

Daha sonra numuneyi dört santigrat derecede 8.000 kez g'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni tüplere toplayın ve BCA testi gibi bir protein belirleme kiti kullanarak protein lizatındaki toplam protein miktarını ölçmek için bir mikrolitre çıkarın. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, ardından bir mikroplaka okuyucuda 562 nanometrede absorbansı ölçün.

Bu adımda, standart olarak bilinen konsantrasyona sahip bir rekombinant protein kullanarak, proteini bir stok çözeltisi olarak mikrolitre başına 12.000 pikogram konsantrasyona seyreltin. Bu arada, hazırlanan numune lizatlarını mikrolitre başına dört mikrograma seyreltin. Daha güvenilir sonuçlar elde etmek için, tek tek numuneler arasında herhangi bir fark olmasını önlemek için numune lizatlarının bir karışımını kullanmanızı öneririz.

Tipik bir doz çalışması için hem standart proteini hem de hazırlanan numuneleri seri olarak seyreltin. BSA, her numune için yüklenen proteinin kabaca eşit miktarlarını sağlamak için takviye edildi. Bundan sonra, 10 mikrolitre seri olarak seyreltilmiş standart proteini veya numune lizatlarını 10 mikrolitre 2X yükleme tamponu ile karıştırın.

Daha sonra karışımı 85 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Bu prosedürde, plakanın alt kısmının masa yüzeyine temas etmesini önlemek için QDB plakasının altına boş bir pipet ucu kutusu yerleştirin. QDB plakasının ayrı bir biriminin altındaki membran merkezine iki mikrolitreye kadar numune yükleyin.

Yükleme sırasında QDB plakasının alt kısmının herhangi bir yüzeye temas etmesine asla izin vermeyin ve bireysel kuyu için çok fazla yükleme yapmayın. Deneyimlerimize göre, kuyu başına en fazla dört mikrolitre. Daha sonra, yüklü QDB plakasını oda sıcaklığında bir saat bekletin veya yüklü plakayı iyi havalandırılan bir yerde 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakın.

Plakayı bloke etmek için QDB plakasını transfer tamponuna batırın ve 10 saniye boyunca hafifçe sallayın. Bundan sonra, QDB plakasını TBST ile üç kez nazikçe durulayın ve ardından plakayı sürekli çalkalayarak TBST'de beş dakika yıkayın. Daha sonra, QDB plakasını sürekli çalkalama altında bir saat boyunca bloke edici tampon ile bloke edin.

Şimdi, bloke edici tampondaki birincil antikoru seçilen bir konsantrasyonda seyreltin ve sıradan bir 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre ekleyin. QDB plakasını 96 oyuklu plakaya yerleştirin ve birleşik plakaları oda sıcaklığında iki saat veya gece boyunca sürekli çalkalama altında dört santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, plakayı sürekli çalkalayarak beş dakika boyunca her seferinde üç kez TBST ile yıkamadan önce TBST ile üç kez nazikçe durulayın.

Daha sonra, bloke edici tampondaki ikincil antikoru seçilen konsantrasyonda seyreltin ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre alikot edin. Daha sonra QDB plakasını yüklü 96 oyuklu plakanın içinde sürekli çalkalama altında oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. QDB plakasını TBST ile üç kez nazikçe durulayın ve ardından plakayı sürekli çalkalayarak TBST ile üç kez, beş dakika yıkayın.

Kantifikasyon için, ECL substratını hazırlayın ve oyuk başına 100 mikrolitre olan 96 oyuklu bir plakaya alikot edin. Ardından, QDB plakasını sürekli çalkalama altında iki dakika boyunca 96 oyuklu plakanın içine yerleştirin. Bundan sonra, QDB plakasını 96 oyuklu plakadan çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için kısa bir süre sallayın.

Ardından, plakayı beyaz bir mikrotitre plakasına yerleştirin. Ardından, mikroplaka okuyucuyu açın ve birleştirilmiş plakaları miktar tayini için mikroplaka okuyucunun içine yerleştirmeden önce kullanıcı arayüzünde kapaklı plakayı seçin. Hatalardan kaçınmak için kapaklı plakayı seçtiğinizden emin olun.

Bu şekil, western blot analizi ile dalak, kalp, kas, böbrek, karaciğer ve prostattan hazırlanan fare dokusu lizatları kullanılarak tavşan anti-CAPG antikorunun özgüllüğünü göstermektedir. Prostat, böbrek, dalaktan hazırlanan lizatlar ve saflaştırılmış rekombinant CAPG protein standardı kullanılarak tavşan anti-CAPG antikorunun QDB analizinin doğrusal aralığı tanımlandı. Sonuçlar ortalama üç kopyaydı.

Ve burada gösterilen, fare böbreklerinden, dalaklardan ve prostatlardan hazırlanan lizatlardaki CAPG seviyelerinin mutlak olarak belirlenmesidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört ila 24 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tüm prosedür için önceden belirlenmiş spesifik bir antikor kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, yalnızca hücresel veya doku düzeyinde bireysel protein içeriklerinin mutlak ölçümü ile elde edilebilecek ek soruları yanıtlamak için biyoistatistik analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, proteomik araştırma alanındaki araştırmacıların, protein biyobelirteçlerinin popülasyon düzeyinde çeşitli hastalıklarla varsayılan ilişkisini keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, QDB analizinin yüksek verimli biçimde nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

İnsan veya hayvan dokuları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.