Xenopus Oositlerinden ve Embriyolarından Elde Edilen Proteinlerin İmmünoblotlama ile Optimize Edilmiş Analizi

Bir hayvanın yaşamı boyunca, normal gelişime ve yetişkin bir organizmanın sağlığına izin veren sülfat kararları sürekli olarak gerçekleşir. Bu kararlar, sülfat düzenleyicileri olarak adlandırılan spesifik proteinlere bağlıdır. Araştırmamızın amacı, bu kritik düzenleyicilerin sentezini kontrol eden mekanizmaları bulmaktır.

Protokolümüz, immünoblotlama ve Xenopus oositleri ve embriyolarının ayrıntılı bir taslağını sağlamanın yanı sıra, antikor tedariki gibi bu model organizmada ortak olan zorluklar hakkında fikir verir. Bicaudal C'nin bağlanma ve baskı mekanizmalarının derinlemesine incelenmesi yoluyla, araştırmamız, diğer translasyonel düzenleyicileri karşılaştırmak için bir bilgi temeli oluşturmaya yardımcı olmuştur. İmmünoblotlama için hücreleri işlemeye başlamak için, embriyo veya oosit başına çift deiyonize su ile bir kat konsantrasyona seyreltilmiş 10 mikrolitre soğutulmuş hücre lizis tamponu ekleyin.

Bir mikro havaneli kullanarak numuneleri buz üzerinde homojenize edin. Tüpleri bir tezgah üstü santrifüje yerleştirin ve numuneleri dört santigrat derecede 5.000 g'da 10 dakika boyunca yumurta sarısı ve çözünmeyen pigmentler de dahil olmak üzere kalıntıları pelet haline getirmek için döndürün. Süpernatanı 1,5 mililitrelik temiz bir tüpe aktarın ve transfer sırasında peletin bozulmamasını sağlayın.

Toplanan süpernatanta hacimce ağırlıkça %5 2-merkaptoetanol ile desteklenmiş eşit hacimde iki kat Laemmli numune tamponu ekleyin. Proteinleri denatüre etmek için karışımı 95 ila 100 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Şimdi, %4 ila %12 bis-tris SDS prekast jeli ambalajından çıkarın ve jelin altındaki etiketi soyun.

Jeli bir tampon barajının karşısındaki elektrot düzeneğine yerleştirin ve tüm düzeneği dikey bir elektroforez tankına yerleştirin. Ardından, hem elektrot tertibatını hem de tankın altını Tris-MOPS-SDS çalışma tamponu ile doldurun. Kabarcıkları ortadan kaldırmak ve tamponu dengelemek için jel tarağı ve pipet çalışma tamponunu kuyucuklara yavaşça çıkarın.

Şimdi, ilk kuyucuğa beş mikrolitre önceden boyanmış protein standardı ve kalan kuyucuklara hazırlanan her numuneden 10 mikrolitre yükleyin. Kapağı elektroforez tankına yerleştirin ve bir güç kaynağına bağlayın. Ardından, elektroforezi başlatmak için voltajı 200 volta ayarlayın.

Numune tampon boya cephesi jelden çıktığında elektroforezi durdurun. Elektroforez tamamlanmadan önce, transfer sandviçini transfer klipsine monte etmeye başlayın. Bir cam pişirme kabını soğutulmuş transfer tamponu ile doldurun ve montaj sırasında tüm transfer malzemelerini bu tampona daldırın.

Transfer klipsini, siyah yarısı alta yaslanacak, beyaz yarısı yukarı bakacak ve klips sola açılacak şekilde tabağa yerleştirin. Transfer klipsinin siyah yarısına bir veya iki fiber süngeri düz bir şekilde yerleştirin. İki adet 0,35 milimetrelik selüloz kromatografi kağıdını boyutuna göre kestikten sonra süngerlerin üzerine bir tane yerleştirin.

Elektroforez tamamlandığında, jeli elektroforez tankından çıkarın. Jel kaseti açma kolunu kullanarak, jelin bir tarafa bağlı kalmasını sağlarken jel plakalarını dikkatlice kaldırın. Jel ayırıcıyı kullanarak jelin üst kısmındaki kuyucukları kesin.

Hala plastik kasetin bir yarısına bağlı olan jeli filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve kalan kaset yarısını jelin kağıt üzerinde düz kalması için çıkarın. Ardından, jelin boyutlarına uyacak şekilde 0,45 mikrometrelik nitroselüloz membrandan bir parça kesin. Membranı koruyucu kağıdından çıkarın, transfer tamponunda kısa bir süre ıslatın ve dikkatlice jelin üzerine yerleştirin.

Ardından, nitroselüloz zarın üzerine ikinci bir filtre kağıdı parçası koyun. Bir rulo kullanarak tüm hava kabarcıklarını nazikçe ama sıkıca bastırın. Sandviçi tamamlamak için filtre kağıdının üzerine bir veya iki ek fiber sünger koyun.

Transfer kasetini kapatın ve monte edilmiş sandviçi kapatmak için sıkıca klipsleyin. Ardından, kapalı transfer sandviçini klips yukarı bakacak şekilde transfer göbeğine yerleştirin ve klipsin siyah tarafının göbeğin siyah tarafına baktığından emin olun. Transfer çekirdeğini elektroforez tankına yerleştirin.

Tanka bir buz torbası ve bir karıştırma çubuğu ekleyerek karıştırma çubuğunun serbestçe dönebilmesini sağlayın. Cihaz tamamen suya batana kadar tankı soğutulmuş transfer tamponu ile doldurun ve kapağı üstüne sabitleyin. Cihazı güç kaynağına bağlayın, elektrot renklerini eşleştirin ve karıştırma çubuğu dönerken koşulları bir saat boyunca 100 volta ayarlayın.

Aktarım tamamlandıktan sonra kaseti dikkatlice açın ve sandviçi sökün. Nitroselüloz membranı çıkarın ve jel ile temas eden tarafı işaretleyin. Ardından, nitroselüloz membranı dibe düz duracak şekilde küçük bir kaba yerleştirin.

Membranı tamamen Ponceau boyası ile örtün ve 5 ila 10 dakika boyunca bir rocker üzerinde hafifçe sallayın. Ponceau boyasını döktükten sonra, fazla leke çıkana ve şeritlerde protein bantları görünür hale gelene kadar zarı birkaç kez çift deiyonize su ile durulayın. Ardından, gösterildiği gibi membran blokajı, antikor inkübasyonu ve yıkama adımlarını gerçekleştirin.

İkincil antikor inkübasyonu ve yıkama tamamlandıktan sonra membran görüntülemeye hazırdır. Karanlık bir odada film geliştiricisini açın ve ısınmasına izin verin. Membranı tamamen kaplayacak kadar büyük iki kare plastik sargı kesin.

Forseps kullanarak, nitroselüloz membranı yüzü yukarı bakacak şekilde plastik sargının ilk karesine yerleştirin. 1,5 mililitrelik bir tüpte, eşit hacimlerde geliştirilmiş kemilüminesans luminol ve güçlendirici reaktifleri karıştırın. Ardından, çoğu zarı kaplamak için karışımın yaklaşık bir mililitresini kullanın.

Plastik sargıyı kullanarak, tüm yüzeyin eşit şekilde kaplandığından emin olmak için membranı hafifçe hareket ettirin ve bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından, membranı forseps ile kavrayarak ve sıvıyı hafifçe sallayarak fazla ECL reaktifini çıkarın. Membranı yüzü yukarı bakacak şekilde plastik sargının ikinci karesine yerleştirin, zarın üzerine gevşek bir şekilde katlayın ve sargıyı bir otoradyografi kasetine sıkıca bantlayın.

Ardından, gösterilen adımları izleyerek karanlık bir odada bir otoradyografi filmi kullanarak membranı görüntüleyin. İstenen protein görselleştirmesi elde edildikten sonra, geliştirilen filmi karanlıkta parlayan işaretleyicilerle hizalayın ve bunları önceden boyanmış protein standartlarının film üzerindeki konumunu işaretlemek için bir kılavuz olarak kullanın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, membranı plastik ambalajdan dikkatlice çıkarın ve kalan ECL reaktifini yıkamak için TBSTW'ye daldırın.

Membranın Ponceau boyaması başarılı protein transferini doğruladı. Endojen B1 proteini oosit örneklerinde tespit edilmedi, ancak yedinci evre ve evre 10.5 embriyo örneklerinde yaklaşık 107 kilodaltonda açıkça tespit edildi. Bicc1 antikoru kullanılarak tüm aşamalarda enjekte edilen numunelerde daha küçük bir 70 kilodalton protein bandı tespit edildi ve bu, HA-Bicc1 C-terminal füzyonunun başarılı ekspresyonunu gösterdi.

HA antikoru, aynı 70 kilodalton bandını yalnızca enjekte edilen numunelerde tespit ederek Bicc1 antikorunun füzyon proteini için özgüllüğünü doğruladı. CNOT1 antikoru kullanılarak tüm örneklerde yaklaşık 250 ve 270 kilodalton olmak üzere iki yüksek moleküler ağırlıklı bant tespit edildi. 54 kilodaltonluk DDX6 proteininin ekspresyonu tüm örneklerde tespit edildi, ancak evre 10.5 embriyolarda gözle görülür şekilde azaldı.