Overview
Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba -A Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner
A análise da qualidade da água monitora influências antropogênicas, como poluentes, nutrientes, patógenos e qualquer outro constituinte que possa impactar a integridade da água como recurso. A contaminação fecal contribui com patógenos microbianos que ameaçam a saúde vegetal, animal e humana com doenças ou doenças. O aumento das demandas de água e os rigorosos padrões de qualidade exigem que a água fornecida para recursos humanos ou ambientais seja monitorada para baixos níveis de patógenos. No entanto, o monitoramento de cada patógeno associado à poluição fecal não é viável, pois as técnicas laboratoriais envolvem trabalho, tempo e custos extensos. Portanto, a detecção de organismos indicadores fornece uma técnica simples, rápida e econômica para monitorar patógenos associados a condições insalubres.
Principles
Os indicadores são organismos facilmente detectáveis cuja presença se correlaciona diretamente com um ou mais patógenos contaminando um ambiente. Para ser considerado um indicador apropriado, um organismo deve atender aos cinco seguintes critérios:
- O organismo indicador deve estar presente quando o patógeno está presente, e o organismo indicador deve estar ausente quando o patógeno está ausente.
- A concentração do organismo indicador deve se correlacionar com a concentração do patógeno. No entanto, o organismo indicador deve ser sempre encontrado em números mais elevados.
- O organismo indicador deve ser capaz de sobreviver mais fácil e mais tempo no ambiente do que o patógeno.
- A detecção para o organismo indicador deve ser fácil, segura e barata.
- O organismo indicador deve ser eficaz para todos os tipos de água.
A maioria dos indicadores são organismos ou vírus entéricos, que são comumente encontrados em sistemas gastrointestinais de mamíferos de sangue quente e aviários, dando uma conexão direta com a contaminação fecal. No entanto, muitos indicadores podem não ter eficácia devido a uma correlação ruim com certos patógenos. Dois dos organismos indicadores bacterianos mais amplamente aceitos são Escherichia coli e coliformes devido às suas ligações fecais, e facilidade na análise laboratorial.
Colilert é uma abordagem definida de tecnologia de substrato (DST) para detecção simultânea, identificação específica e confirmação de E. coli e coliformes totais em amostras de água. Esta técnica de laboratório utiliza nutrientes substratos específicos da via metabólica de cada organismo indicador, enumerando apenas microrganismos desejados, que liberam um sinal quando as bactérias alteram o composto. Na presença de um coliforme, o nutriente orto-nitrofenil-β-D-galactopyranoside (ONPG) é hidrolisado pela enzima β-galactosidase do coliform. O composto do produto, orto-nitrofenil, é um cromogen que libera um sinal de cor, tornando a água amarela(Figura 1).
Figura 1. Esquemático mostrando orto-nitrofenil liberando um sinal de cor, tornando a água amarela.
Na presença de E. coli, o nutriente metilumbelliferyl-β-D-glucuronida (MUG) é cortado pela enzima glucuronidase da bactéria, produzindo um produto metilumbelliferone que fluoresce azul-verde sob luz ultravioleta(Figura 2).
Figura 2. Esquema mostrando o nutriente metilumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) cortado pela enzima glucuronidase da bactéria, produzindo um produto metilumberlliferone que fluoresce azul-verde sob luz ultravioleta.
Colilert pode ser realizado como um teste de presença-ausência (P-A) para indicar se os organismos existem ou não na amostra. Este teste é concluído dissolvendo o substrato em amostras de água de 100 mL, incubando a 35 ± 0,5 °C por 24 h e observando os sinais de cor. A presença dos indicadores também pode ser quantificada utilizando um sistema que determina o número mais provável (MPN) para cada organismo. Este procedimento envolve a dissolução do substrato em amostras de água de 100 mL que são seladas em uma bandeja contendo 49 poços grandes e 48 pequenos poços. A bandeja é incubada a 35 ± 0,5 °C por 24 h, e então os poços contendo mudanças positivas de cor são contados. A razão de poços grandes para pequenos contendo sinais positivos está alinhada ao gráfico do MPN que fornece a quantificação para a presença de cada organismo indicador presente. As regulamentações para a água potável nos Estados Unidos exigem que coliformes zero estejam presentes em 100 mL de água potável.
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Procedure
1. Presença de Colilert – Teste de ausência (P – A)
- Abra a garrafa colilert de plástico de 100 mL. A garrafa inclui uma pequena quantidade de reagente em pó que é necessário para as reações adequadas, não descarte este pó.
- Adicione 100 mL de amostra de água na garrafa colilert.
- Abra o tubo de travesseiro contendo o substrato de nutrientes e despeje o conteúdo na amostra de água dentro da garrafa colilert.
- Cap e sele a garrafa colilert. Agite a garrafa vigorosamente, invertendo repetidamente a garrafa até que o substrato esteja completamente dissolvido.
- Incubar a mistura reagente/amostra de água dentro da garrafa a 35 ± 0,5 °C por 24 h.
- Observe a mudança de cor amarela na mistura reagente/amostra de água. A cor amarela indica que o coliforme está presente. Água clara ou nenhuma mudança de cor indica que coliformes estão ausentes.
- Exponha a amostra de reagente/água à luz ultravioleta e observe a fluorescência azul. Fluorescência azul indica que E. coli está presente. Nenhuma fluorescência indica que E. coli está ausente(Figura 3).
Figura 3. Teste P-A negativo (esquerda), coliform positivo (médio) e E. coli positivo (direita).
2. Colilert MPN: Quanti-tray 2000
- Abra a garrafa colilert, e a amostra de água de 100 mL na garrafa colilert.
- Abra o tubo do travesseiro contendo substrato de nutrientes e despeje o conteúdo na amostra de água dentro da garrafa colilert.
- Cap e sele a garrafa colilert. Agite a garrafa vigorosamente, invertendo repetidamente a garrafa até que o substrato esteja completamente dissolvido.
- Abra cuidadosamente a bandeja Quanti 2000 apertando as bordas na parte superior da bandeja e puxando para trás a guia de papel. Continue apertando para que a bandeja esteja aberta.
- Despeje a mistura de amostra de reagente/água na bandeja e, em seguida, incubar a amostra dentro da bandeja a 35 ± 0,5 °C por 24h.
- Observe a mudança de cor amarela na mistura reagente/amostra de água. Conte o número de poços grandes e pequenos que sinalizam presença positiva para coliformes. A cor amarela indica que o coliforme está presente. Água clara ou nenhuma mudança de cor indica que coliformes estão ausentes.
- Exponha a amostra de reagente/água à luz ultravioleta e observe a fluorescência azul. Conte o número de poços grandes e pequenos que sinalizam presença positiva para E. coli. A fluorescência azul indica que E. coli está presente. Nenhuma fluorescência indica que E. coli está ausente.
- Use a folha quanti-tray de 2000 MPN (Figura 4) para quantificar a concentração para cada organismo indicador presente em 100 mL de água. Use a planilha para comparar grande: pequena relação de poço positivo para presença enumerada para ambos os organismos indicadores.
Figura 4. Quanti-tray negativo (esquerda), coliform positivo (médio) e E. coli positivo (direita).
A análise da qualidade da água é vital para salvaguardar a integridade dos recursos hídricos. A presença de microrganismos indicadores está correlacionada com a presença de matéria fecal, que pode conter patógenos causadores de doenças. Os organismos indicadores podem, portanto, ser usados para avaliar a segurança do abastecimento de água.
A contaminação fecal na água representa um risco significativo para a saúde de plantas, animais e seres humanos, uma vez que os patógenos gastrointestinais são derramados em número muito alto nas fezes. No entanto, o monitoramento de amostras de água para cada tipo de patógeno único associado à poluição fecal não é viável. O levantamento de organismos indicadores fornece uma maneira simples, rápida e econômica de detectar contaminação fecal nos recursos hídricos.
Este vídeo ilustrará os princípios por trás do uso de organismos indicadores para avaliar a qualidade da água, como testar amostras de água coletadas e a interpretação e quantificação dos dados resultantes.
Para serem utilizados como indicador de qualidade da água, os organismos devem atender a cinco critérios específicos. Primeiro, deve ser detectável na água onde o patógeno está presente, e ausente quando o patógeno está ausente. Em segundo lugar, o número de organismos indicadores deve corresponder aos níveis de patógenos. Também deve ser mais resistente e persistir mais tempo no ambiente do que o patógeno. Finalmente, a detecção deve ser fácil, segura e barata, e eficaz em todos os tipos de água.
Dois dos grupos indicadores bacterianos mais comuns são coliformes totais e coliformes fecais, tipicamente E. coli. Coliformes totais podem ser encontrados no intestino dos mamíferos, mas também podem ocorrer naturalmente no solo e na água da superfície. Coliformes fecais são um subconjunto que reside inteiramente dentro dos tratos gastrointestinais de mamíferos e aves e são continuamente derramados em fezes. Coliformes são vulneráveis às mesmas tensões que muitos patógenos intestinais comuns, como tratamento de água ou baixos níveis de nutrientes, sua presença em uma amostra de água é um indicador útil da presença potencial de patógenos. Tanto coliformes totais quanto E. coli são prontamente detectados no ambiente laboratorial.
Para detecção, substratos químicos são adicionados à amostra que os coliformes metabolizam, resultando em uma mudança de cor. Para coliformes totais, adicionado ONPG é convertido em nitrofenol, tornando a água amarela. Para coliformes fecais, E. coli converte MUG em um produto metil-umbelliferone que fluoresce azul-verde sob luz ultravioleta. Em sua aplicação mais simples, o teste do substrato pode confirmar a presença ou ausência de coliformes existentes na água no momento da amostragem.
Em contraste com este método qualitativo, o número de coliformes totais por amostra pode ser estimado usando uma bandeja particionada especializada. Depois que o substrato reativo é dissolvido, a amostra de água é adicionada a uma bandeja contendo poços grandes e pequenos e, em seguida, incubada. Poços que exibem a mudança de cor são contados, e a proporção de poços pequenos para grandes demonstrando sinais coloridos positivos está alinhada a um gráfico que indica uma quantidade. Os suprimentos de água potável dos EUA devem conter coliformes totais zero por 100 mL.
Agora que estamos familiarizados com os princípios do uso de organismos indicadores para identificar e quantificar a contaminação da água, vamos dar uma olhada em como isso é realizado em laboratório.
Uma vez coletadas amostras, leve-as ao laboratório para testes. Para começar, abra uma garrafa de plástico de 100 mL. As garrafas podem conter uma pequena quantidade de reagente de tiossulfato de sódio em pó que é usado para garantir a neutralização de qualquer cloro que possa estar presente. Adicione 100 mL de amostra de água na garrafa. Abra um tubo de travesseiro contendo substrato de nutrientes e despeje o conteúdo na amostra de água dentro da garrafa. Tampa e sele a garrafa, em seguida, agite vigorosamente, invertendo repetidamente a garrafa até que o substrato seja completamente dissolvido. Em seguida, incubar a garrafa de reagente de amostra a 35 °C por 24 h.
Observe a mudança de cor amarela na mistura amostra-reagente. A cor amarela indica que coliformes estão presentes. Nenhuma mudança de cor indica que os coliformes estão ausentes. Por fim, exponha a mistura amostra-reagente à luz ultravioleta e observe. Fluorescência azul, em combinação com uma mudança de cor amarela, indica que E. coli está presente. Nenhuma fluorescência indica ausência.
O número mais provável, ou MPN, também pode ser determinado para amostras. Abra uma garrafa e adicione 100 mL de amostra de água. Abra o tubo de travesseiro do substrato de nutrientes e despeje o conteúdo na amostra de água na garrafa. Cap e sele a garrafa. Agite vigorosamente, invertendo repetidamente até que o substrato seja completamente dissolvido. Abra cuidadosamente a bandeja apertando as bordas na parte superior e puxe para trás a guia de papel. Aplique pressão constante para manter a bandeja aberta. Despeje a mistura de reagente de amostra na bandeja e lacre. Incubar a bandeja a 35 °C por 24 h.
Observe a mudança de cor na bandeja de mistura de amostra-reagente. Conte o número de poços grandes e pequenos poços que ficaram amarelos para indicar a presença de coliformes. Em seguida, exponha a bandeja de reagente à luz ultravioleta e observe fluorescência azul. Conte o número de poços grandes e pequenos que sinalizam presença positiva de E. coli.
Utilizando a folha de MPN fornecida, quantifique a concentração para cada organismo indicador presente em 100 mL de água. Encontre o número de pequenos poços positivos ao longo da parte superior da tabela, e o número de grandes poços positivos no eixo lateral esquerdo. A intersecção dos dois dará um número representando o Número Mais Provável, que é o número estimado de organismos por 100 mL.
Testes totais de detecção de coliformes e E. coli são usados para verificar a contaminação em uma variedade de amostras de água.
A água destinada ao consumo humano, ou potável, é rotineiramente testada para contaminação. Para que a água seja considerada segura, deve conter menos de 1 coliform por 100 mL. Aqui, a água de uma torneira foi coletada e testada para contaminação total de coliformes ou E. coli, como demonstrado anteriormente. Os resultados determinaram se uma fonte de água era segura para o consumo.
Outra amostra comumente testada é o tratamento de águas residuais. A água deve ser testada para garantir que seja segura para liberação no ambiente ou redefinição para uso humano. Como eram esperados altos níveis de contaminação antes do tratamento, a amostra de esgoto bruto foi diluída para 1:100.000. Essas amostras foram então submetidas a testes totais de detecção de coliformes e E. coli, e valores de MPN calculados. O valor seguro após o processamento deve ser zero bactérias indicadoras detectáveis.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE para testar a qualidade da água usando organismos indicadores. Agora você deve entender como testar amostras de água para E. coli e outros coliformes, e como quantificar o grau de contaminação presente. Obrigado por assistir!
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Applications and Summary
Organismos indicadores são empregados para determinar de forma rápida e barata a contaminação ambiental. Os ensaios colilert são utilizados para analisar a qualidade da água para fontes de consumo, recreação e efluentes. A qualidade da água deve atender aos padrões legais estabelecidos pela Agência de Proteção Ambiental (EPA) e departamentos reguladores estaduais para ser aceito como recurso para consumo humano e/ou ambiental.
Os ensaios colilert também são estrategicamente utilizados como marcadores de equilíbrio de massa dentro da pesquisa ambiental, e esses dados podem ser analisados juntamente com outros ensaios ambientais para medir a correlação entre os resultados. A realização de um simples teste P-A Colilert indica se uma amostra está contaminada, o que pode ser analisado juntamente com os resultados da pesquisa. Se a amostra P-A mostrar que há contaminação na água, então as amostras de água que estão sendo utilizadas em pesquisas também podem ter contaminação que leva a resultados mal interpretados, enquanto a bandeja MPN Quanti fornece uma quantificação de linha de base para contaminação presente. Por exemplo, os organismos indicadores podem ser usados para correlacionar quantificações de indicadores com o número de patógenos encontrados em uma amostra de água. Se a bandeja de quanti enumerar números de indicadores baixos, isso sugere que a amostra de água também deve experimentar tendências semelhantes com baixos níveis de patógenos.
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