Overview
Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Bradley Schmitz
A reação em cadeia de transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) envolve o mesmo processo que o PCR convencional — temperatura de ciclismo para amplificar ácidos nucleicos. No entanto, enquanto o PCR convencional só amplifica ácidos desoxiribonucleicos (DNA), o RT-PCR permite a amplificação dos ácidos ribonucleicos (RNA) através da formação de DNA complementar (cDNA). Isso permite que organismos baseados em RNA encontrados dentro do ambiente sejam analisados utilizando métodos e tecnologias que são projetados para o DNA.
Muitos vírus encontrados no ambiente usam o RNA como seu material genético. Vários patógenos virais baseados em RNA, como o Norovirus,e organismos indicadores, como o vírus da mísola de pimenta (PMMoV), não possuem métodos de detecção baseados em cultura para quantificação. Para detectar a presença desses vírus RNA em amostras ambientais do solo, água, agricultura, etc., os ensaios moleculares dependem do RT-PCR para converter RNA em DNA. Sem o RT-PCR, os microbiologistas não seriam capazes de avaliar e pesquisar inúmeros vírus baseados em RNA que representam riscos à saúde humana e ambiental.
O RT-PCR também pode ser empregado como uma ferramenta para medir a atividade microbiana no ambiente. Messenger RNA (mRNA) é o modelo de fixação única para tradução de proteínas, e medir os níveis de diferentes mRNAs indica quais genes dos quais micróbios estão sendo expressos dentro do ambiente. Analisar a expressão genética dá pistas de quais caminhos biológicos são usados pelos organismos para sobreviver em diferentes condições ambientais. Em alguns casos, a expressão genética pode ser utilizada para determinar quais organismos podem sobreviver melhor em condições adversas e ter capacidades para bioremediação de solo ou água contaminados.
Principles
O PCR baseia-se na amplificação de modelos de DNA, o que limita seu uso na detecção de RNA de organismos. No entanto, o RT-PCR fornece um meio de usar o RNA para produzir cDNA usando enzimas especializadas, conhecidas como transcriptase reversa (RT). Este cDNA pode então ser usado como o modelo inicial para amplificação subsequente com PCR convencional (Figura 1).
A transcrição reversa pode ser controlada para amplificar apenas produtos desejados ou toda uma comunidade de ácidos nucleicos encontrados dentro de uma amostra ambiental, dependendo dos primers que são usados para modelar a síntese de cDNA. Isso é importante, pois as amostras de solo e água são frequentemente saturadas com vários ácidos nucleicos que não são desejados para análises específicas. Primers aleatórios, que podem se ligar a sequências de RNA encontradas em qualquer tipo de micróbios, podem ser usados no RT-PCR para detectar a maioria do RNA, para que a amostra possa ser analisada para a presença e abundância relativa de múltiplos organismos no ambiente. Por outro lado, primers específicos de sequência iniciam a síntese de CDNA para sequências precisas encontradas em apenas um ou poucos organismos. Isso permite que uma amostra ambiental seja testada para um propósito específico, como determinar se o Norovírus, que pode causar doenças gastrointestinais em humanos, está presente na água.
Figura 1. Processo passo a passo da análise RT-PCR de amostras de RNA ambiental.
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Procedure
1. Coleta de Amostras: Amostra de Solo
- Encontre uma amostra através de GPS, coordenadas ou visão.
- Para amostragem aleatória, escolha pontos aleatórios dentro de uma área para obter um censo geral de habitats microbianos. A amostragem transect coleta de pontos ao longo de uma linha reta, por exemplo,adjacente a um córrego. As amostras de grade são sistematicamente retiradas de pontos em intervalos regulares e são úteis para mapear comunidades microbianas em uma área desconhecida ou variável.
- A amostragem dentro de uma profundidade de 7,5-15 cm fornece acesso à atividade microbiana mais abundante que está próxima, mas não dentro, da rizosfera (a região estreita do solo diretamente afetada pelas raízes das plantas e seus microrganismos associados).
- Para coletar a amostra do solo, empurre e gire uma mão no chão até a profundidade predeterminada.
- Levante o auger. O solo é encontrado dentro da haste oca do auger.
- Raspe o solo no fundo do auger em um saco de coleta de solo. Certifique-se de não tocar ou contaminar o solo.
- Rotule a bolsa corretamente com localização, nome, data e hora.
- No laboratório, passe o solo através de uma peneira de 2 mm para remover qualquer cascalho e rocha.
- Analise uma parte do solo para obter o teor de umidade do solo. Para obter detalhes desta etapa, consulte o vídeo da JoVE Science Education sobre a umidade do solo.
2. Coleta de Amostras: Amostra de Água
- Encontre a localização da amostra via GPS, coordenadas ou visão.
- Pegue a água em uma garrafa de armazenamento. Registrar o volume de água coletado; se os micróbios da amostra forem avaliados quantitativamente, a concentração microbiana pode ser determinada com base no volume coletado.
- Teste imediatamente a água para quaisquer parâmetros necessários para o experimento (temperatura, pH, condutividade, salinidade, nitrogênio e teor de fósforo, etc.) utilizando as sondas eletrônicas apropriadas.
- Coloque a garrafa contendo a amostra de água em um refrigerador com gelo. Transfira o refrigerador para o laboratório.
3. Extração de RNA
- Para coletar e concentrar microrganismos da amostra ambiental, consulte o vídeo da JoVE Science Education sobre a extração de ácido nucleico comunitário.
- Extrair RNA de vírus usando um kit de extração comercial de acordo com as instruções do fabricante.
- Brevemente, misture primeiro as amostras com tampão de lise complementado com etanol e, em seguida, adicione as amostras em colunas de spin.
- Centrifugar as colunas a aproximadamente 12.000 x g, descartar fluxo através. Adicione o tampão de lavagem às colunas e centrífugas novamente.
- Adicione água livre de RNase às colunas e centrífuga por 30 s para elute RNA em tubos de microfuge de baixa adesão estéreis de 1,5 mL.
4. Transcrição reversa - PCR
- Recupere os seguintes reagentes do congelador -20 °C: dNTP, concentrado(por exemplo,10x) tampão de transcrição reversa, primers (neste exemplo, primers aleatórios). Descongele isso no gelo ou à temperatura ambiente dentro de um capô limpo, e mantenha-os no gelo uma vez descongelados. Também recupere a transcriptase reversa e o inibidor de RNase e mantenha-os no gelo.
- Calcule os volumes de reagente necessários para fazer uma "mistura mestre" que combina todos os reagentes constantes entre cada reação (ver Tabela 1 para uma reação amostral). Prepare mix mestre suficiente para cada amostra, bem como um controle positivo (usando um modelo de transcrição conhecido) e controle negativo (por exemplo,sem transcrição reversa, com apenas água como modelo, etc.) reações. Inclua um volume extra de 10%.
- Monte a mistura mestre em tubos de microfuça de baixa adesão de 1,5 mL. Isso minimiza a ligação das moléculas de reagente às paredes plásticas dos tubos.
- Quando os reagentes forem descongelados, adicione volumes calculados ao tubo de microfuça. Vórtice suavemente e centrífuga cada tubo antes da adição. Certifique-se de alterar as pontas da pipeta entre a adição de cada reagente para evitar contaminação.
- Depois de todos os reagentes terem sido adicionados, vórtice e centrífuga a mistura mestre para garantir uma mistura homogênea. Coloque os reagentes de volta ao armazenamento a -20 °C.
- Prepare e rotule tiras PCR de 8 tubos, designando um tubo para cada amostra ou reação de controle.
- Alíquota igual de mistura mestre em cada tubo. Em seguida, adicione componentes específicos de reação, como os extratos de RNA.
- Coloque a tampa da tampa da tira com segurança na tira PCR e centrífuga em um minicentrifuge com um adaptador de tubo de tira para garantir que todo o líquido seja coletado na parte inferior de cada tubo(Figura 2).
- Coloque a tira PCR com segurança no termociclador. Pressione para baixo para garantir que os tubos estejam protegidos.
- Defina o termociclador para executar o programa apropriado para o RT que está sendo usado (consulte tabela 2 para um protocolo de amostra). Quando o programa estiver concluído, os tubos conterão produtos cDNA, que podem então ser submetidos à amplificação pcr. Para obter detalhes, consulte os vídeos da JoVE Science Education sobre PCR e PCR quantitativo. Armazene cDNA a -20 °C até usar.
Figura 2. Tira de 8 tubos tampada contendo mistura e extrato mestre.
| Reagente | Volume por reação 1 (μL) |
| 10x tampão RT | 2.0 |
| 25x dNTPs | 0.8 |
| Primer aleatório de 10x | 2.0 |
| Multiscrito | 1.0 |
| Inibidor de Rnase | 1.0 |
| Grau Molecular H2O | 3.2 |
| Total Volume | 10 |
Mesa 1. RT Master Mix Ingredientes.
| Passo 1 | Passo 2 | Passo 3 | Passo 4 |
| 25 °C, 10 min | 37 °C , 120 min | 85 °C , 5 min | 4 °C , ∞ |
Mesa 2. Programa de Thermocicr de Reação RT.
Reação em cadeia de transcrição reversa, ou RT-PCR, permite a detecção de vírus RNA e expressão genética microbiana no ambiente.
Ao contrário de organismos celulares de humanos a bactérias, que usam o DNA como material genético, alguns vírus têm genomas feitos de RNA, incluindo muitos vírus patogênicos como gripe, Ebola e HIV. Enquanto alguns vírus podem ser detectados observando o fenótipo patogênico que se desenvolve quando usado para infectar células na cultura celular, a maioria não tem métodos de caracterização baseados emcultura. O RT-PCR pode ser usado para detectar a presença desses vírus no ambiente com alta sensibilidade.
Ao mesmo tempo, organismos com genomas baseados em DNA "expressam" as informações genéticas codificadas em seus genomas de DNA ao "transcrevê-los" em mensageiro ou "m"RNA, que podem então ser "traduzidos" em proteínas para executar função enzimática ou estrutural nas células. À medida que os micróbios respondem e se adaptam às mudanças no ambiente ligando ou desligando várias vias genéticas, o RT-PCR pode ser usado para monitorar tais alterações na expressão genética para servir como potenciais assessores ecossistêmicos.
Este vídeo vai passar por cima dos princípios por trás do RT-PCR, delinear um procedimento generalizado para executar essa técnica e, por último, examinar algumas das maneiras como este método está sendo aplicado na microbiologia ambiental hoje em dia.
Existem duas partes-chave para este procedimento: a extração de RNA a partir de amostras biológicas, seguida por sua transcrição reversa em DNA.
O isolamento do RNA envolve a lise das células na amostra adicionando um detergente que quebra lipídios e proteínas, seguido de interrupção mecânica. Extrair RNA de vírus geralmente requer a adição de proteínas, que são enzimas de digestão de proteínas, para quebrar os capsídeos dos vírus - as camadas de proteína resistentes que formam a partícula viral. Por outro lado, ao obter RNA de organismos celulares, o liseto pode precisar ser tratado com enzimas degradantes de DNA, ou DNAases, para evitar que os resultados a jusante sejam confundidos pela presença do DNA quimicamente semelhante.
O RNA pode então ser purificado a partir de lises de uma das duas maneiras. Em um método, conhecido como extração de tiocianato-cloronato ácido, o lisato é misturado com uma mistura orgânica-aquosa que é então centrifugada para separar as fases. As proteínas serão divididas na fase orgânica, detritos celulares límbicos na interfase nublada e ácidos nucleicos na fase aquosa. A fase aquosa superior pode então ser coletada, e o RNA é precipitado pela adição de álcool como isopropanol, o que diminui a solubilidade do ácido nucleico na água.
No isolamento do RNA baseado em coluna, o liseto é misturado com álcool e, em seguida, passou por uma coluna de filtragem de gel com uma resina negativamente carregada, como a sílica. O lisato é preparado para que íons carregados positivamente na forma tampão "pontes de sal" que permitem que a espinha dorsal fosfato negativamente carregada dos ácidos nucleicos se ligue à resina. Todos os outros contaminantes são lavados. Os ácidos nucleicos são "elucidos" da coluna usando um tampão de baixo sal ou água. Como o RNA de uma só vez tem menos cargas negativas do que o DNA de dois fios, ele pode ser elucido preferencialmente usando buffers de concentrações específicas.
Uma vez isolado, o RNA é transformado no DNA mais quimicamente estável. Cientistas aproveitaram uma enzima naturalmente codificada por retrovírus como o HIV. Esta enzima é conhecida como transcriptase reversa, ou "RT".
RT sintetiza DNA complementar ou "c" de um pequeno trecho de nucleotídeos conhecido como primer. Esta cartilha pode ter diferentes sequências, dependendo do propósito do experimento. Por exemplo, o primer pode ser projetado para ter uma sequência específica, a fim de detectar genes ou organismos específicos. Uma vez sintetizado, este cDNA "primeiro fio" pode ser amplificado por PCR regular.
Agora que temos uma compreensão dos princípios por trás do RT-PCR, vamos olhar para um protocolo para a realização desta técnica em amostras de RNA coletadas do ambiente.
Para iniciar o procedimento, encontre um local de coleta de amostras usando coordenadas gps ou visão. Escolha pontos aleatórios dentro de uma área para obter uma pesquisa geral de habitats microbianos.
Para coletar a amostra sólida, empurre e gire uma mão no solo até a profundidade predeterminada. Quando o auger é levantado, o solo pode ser encontrado dentro da haste oca do auger.
Este solo é raspado diretamente em um saco de coleta de solo e o saco é rotulado com o local, nome, data, hora da coleta e quaisquer outras informações necessárias.
Transfira o solo para o laboratório e passe o solo através de uma peneira de 2 mm para remover cascalho e rocha. Analise uma amostra do solo para teor de umidade, que pode ser informativa sobre o nível de atividade microbiana no solo. Para isso, consulte o vídeo desta coleção "Determinação do Conteúdo de Umidade do Solo".
Para a coleta de amostras de água, escolha um local de interesse semelhante à coleta de solo e colete água em uma garrafa de plástico de parede grossa estéril. Tome nota do volume de água coletado. Teste a água imediatamente para parâmetros como temperatura, pH e salinidade, que podem fornecer informações importantes sobre os níveis microbianos esperados na amostra. Em seguida, coloque a garrafa no refrigerador e transfira para o laboratório.
Microrganismos como vírus são coletados e concentrados a partir da amostra ambiental.
O RNA pode ser extraído dos vírus coletados pelo método da coluna spin usando kits comerciais de extração de RNA de acordo com a instrução do fabricante. O tampão de lise, complementado com etanol, é primeiro misturado com a amostra. Coloque o número apropriado de colunas de spin em tubos de coleta e aplique as amostras na matriz da coluna. Centrifugar as colunas a aproximadamente 12.000 x g por 1-2 min para deixar os ácidos nucleicos se ligarem à coluna e descartar o fluxo líquido.
Adicione o tampão de lavagem às colunas e centrífugas novamente. Coloque as colunas em novos tubos de microfuça de baixa adesão de 1,5 mL. Em seguida, adicione água livre de RNases, que são enzimas que degradam o RNA, às colunas e centrífugas por 30 s para elufa o RNA. O RNA elucido pode ser armazenado a -80 °C até o uso.
Antes do experimento, devem ser projetados primers apropriados para detectar as sequências de interesse, que podem servir como marcadores para a presença de microrganismos específicos.
Tire os reagentes RT armazenados a -20 °C e descongele os reagentes congelados no gelo (ou à temperatura ambiente). Estes incluem nucleotídeos, buffer de transcrição reversa e primers. Uma vez descongelado, mantenha os reagentes no gelo; a enzima transcriptase reversa, e o Inibidor RNase devem ser sempre mantidos no gelo.
Enquanto os reagentes estão descongelando, calcule os volumes e concentrações dos componentes da reação. Uma vez que os reagentes são descongelados, suavemente vórtice e girar cada tubo para garantir que o conteúdo esteja bem misturado.
Trabalhando em uma coifa de fluxo laminar para evitar contaminação, monte os componentes em uma mistura mestre para adicionar a cada tubo PCR. Ao montar a mistura mestre em um tubo Eppendorf, certifique-se de trocar as pontas da pipeta entre cada reagente para evitar contaminação. Depois de todos os reagentes terem sido adicionados ao tubo Eppendorf, suavemente vórtice e gire o tubo de mistura mestre para garantir uma mistura homogênea.
Rotule um conjunto de tubos PCR, certificando-se de incluir controles. Alíquota igual do mix mestre em cada tubo. Em seguida, adicione componentes específicos de reação, como extratos de RNA ou água para controle negativo.
Uma vez que todos os componentes sejam adicionados, coloque os tubos em um termociclador e defina o programa de transcrição reversa para ser executado. O cDNA pode então ser submetido à amplificação do PCR. Para obter uma descrição detalhada desta etapa, consulte o vídeo desta coleção no PCR.
Quando o PCR estiver completo, parte do produto PCR pode ser separado e visualizado em um gel de agarose. Por exemplo, um primer específico de genes foi usado aqui para detectar a presença de um vírus RNA. Faixas do tamanho esperado são obtidas a partir da reação RT-PCR, mas não dos controles negativos, indicando a presença desse vírus na amostra de água que está sendo testada.
A identificação de microrganismos à base de RNA pela RT-PCR permite a análise da saúde ecológica, dos riscos ambientais e da conservação da biodiversidade.
O uso de microrganismos para limpar hidrocarbonetos e solventes de solo e água poluídos representa uma alternativa de remediação ecosustainável. Compreender a expressão genética microbiana nativa pode destacar caminhos microbianos específicos que quebram contaminantes nessas condições. O RT-PCR é frequentemente utilizado para amplificar o mRNA de tais amostras ambientais.
As medidas de saúde pública muitas vezes requerem uma rápida vigilância das fontes virais de infecção no ambiente. A Gripe Aviária, por exemplo, é altamente infecciosa e pode rapidamente se espalhar para aves, gado e até humanos. Neste exemplo em particular, os pesquisadores procuraram a ameaça da Gripe Aviária espalhada por aves silvestres.
Usando uma configuração e aparelhos RT-PCR portáteis, eles selecionaram uma variedade de aves selvagens, mesmo em áreas remotas, para detectar infecções precocemente e prevenir a transmissão.
Finalmente, o RT-PCR pode ser usado para caracterizar "biopesticidas" que estão sendo desenvolvidos para atingir pragas como o atirador de asas vidrados, Homalodisca vitripennis, o hosulário de uma doença que danifica severamente videiras na América do Norte. Um novo vírus RNA de uma única cadeia está sendo desenvolvido como um agente para infectar este inseto. Usando uma combinação de cultura celular Homalodisca e confirmação rt-PCR de carga viral, esses autores foram capazes de propagar uma alta concentração de vírus para uso como um agente de controle biológico.
Você acabou de assistir à introdução da JoVE à Análise de Organismos Ambientais Baseados em RNA pela RT-PCR. Agora você deve entender a teoria por trás do protocolo, como aplicar a técnica à sua pesquisa, e algumas das maneiras pelas quais ela está sendo usada no campo hoje. Obrigado por assistir!
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Results
Quando o RT-PCR estiver completo, parte do produto PCR pode ser separado e visualizado em um gel de agarose(Figura 3). Neste exemplo, uma cartilha específica de genes foi usada para detectar a presença de um vírus RNA. Faixas do tamanho esperado são obtidas a partir de duas das amostras e da reação de controle positivo, mas não do controle negativo, indicando a presença desse vírus em duas das amostras de água que estão sendo testadas.
Figura 3. Eletroforese de gel de produtos RT-PCR. M: marcador de tamanho de DNA; P: controle positivo; N: controle negativo. As reações utilizando RNA de quatro amostras de água foram realizadas nas faixas 1, 2, 3 e 5.
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Applications and Summary
O RT-PCR é necessário para criar cDNA a partir de um modelo RNA. Isso permite que microrganismos baseados em RNA sejam analisados utilizando ensaios moleculares desenvolvidos para DNA. Uma vez sintetizado o CDNA, os ensaios do PCR podem determinar a presença ou ausência de microrganismos baseados em RNA dentro de uma amostra ambiental. Isso permite uma análise mais a jusante para determinar a ecologia microbiana, os riscos à saúde e os riscos ambientais.
O RT-PCR também pode ser utilizado para avaliar o mRNA como um meio de observar quais genes estão sendo expressos em um ambiente. Isso fornece informações sobre quais proteínas e caminhos os micróbios dependem para sobreviver em condições ambientais particulares. Análises de expressão genética podem identificar vias microbianas que despreensam contaminantes ambientais, como hidrocarbonetos ou solventes clorados, e micróbios com essas vias podem ser aproveitados para a bioremediação.
A avaliação de riscos incorpora o RT-PCR para analisar os riscos à saúde humana e ambiental. A combinação da TR com o PCR quantitativo permite que os vírus RNA sejam enumerados dentro das amostras, para que a exposição humana e ambiental possa ser calculada para fins de Avaliação quantitativa de Risco Microbiano (QMRA).
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