Overview
מקור: ד"ר פול באוור - אוניברסיטת פרדו
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) היא שיטה אנליטית חשובה המשמשת בדרך כלל להפרדת וכימות רכיבים של דגימות נוזליות. בטכניקה זו, פתרון (שלב ראשון) נשאב דרך עמודה המכילה אריזה של חלקיקים נקבוביים קטנים עם שלב שני קשור לפני השטח. המסיסות השונות של רכיבי המדגם בשני השלבים גורמות לרכיבים לנוע דרך העמודה במהירויות ממוצעות שונות, ובכך יוצרות הפרדה בין רכיבים אלה. הפתרון השאוב נקרא השלב הנייד, בעוד השלב בעמודה נקרא השלב הנייח.
ישנם מספר מצבים של כרומטוגרפיה נוזלית, בהתאם לסוג של שלב נייח ו / או נייד מועסק. ניסוי זה משתמש בכרומטוגרפיה הפוכה, שבה השלב הנייח אינו קוטבי, והשלב הנייד הוא קוטבי. השלב הנייח שיש להשתמש בו הוא קבוצות פחמימנים C18 המלוכדות לחלקיקי סיליקה של 3 מיקרומטר, בעוד שהשלב הנייד הוא חיץ מימי עם מחליף אורגני קוטבי (acetonitrile) שנוסף כדי לשנות את כוחו המתחמק. בצורה זו, סיליקה יכול לשמש עבור דגימות כי הם מסיסים במים, מתן מגוון רחב של יישומים. בניסוי זה, תערובות של שלושה מרכיבים הנמצאים לעתים קרובות משקאות קלים דיאטה (כלומר קפאין, בנזואט, אספרטיים) מופרדים. שבעה פתרונות מוכנים המכילים כמויות ידועות של שלושת המינים משמשים, ולאחר מכן הכרומטוגרמה שלהם מתועדת.
Principles
במהלך ניסוי HPLC, משאבה בלחץ גבוה לוקחת את השלב הנייד ממאגר דרך מזרק. לאחר מכן הוא עובר דרך עמודה C18-ארוזה בשלב הפוך להפרדת רכיבים. לבסוף, השלב הנייד עובר לתא גלאי, שבו הספיגה נמדדת ב 220 ננומטר, ומסתיים בבקבוק פסולת. משך הזמן שלוקח לרכיב לנסוע מיציאת המזרק לגלאי נקרא זמן השמירה.
כרומטוגרפיה נוזלית משמשת בניסוי זה, שבו ההפרדה מתבצעת בעמודה בשלב הפוך. מידות העמודות הן 3 מ"מ (i.d.) x 100 מ"מ, ואת אריזת סיליקה (גודל חלקיק 3 מיקרומטר) הוא פונקציונלי עם C18 octadecylsilane (ODS). Rheodyne 6-6-יציאות שסתום הזרקה סיבובית משמש בתחילה לאחסן את המדגם בלולאה קטנה ומציג את המדגם לשלב הנייד על סיבוב של השסתום.
הזיהוי הוא על ידי ספקטרוסקופיית ספיגה אורך גל של 220 ננומטר. ניסוי זה יכול להיות מופעל ב 254 ננומטר, אם גלאי אינו משתנה. לנתונים מהגלאי יש יציאת מתח אנלוגית, הנמדדת באמצעות מולטימטר דיגיטלי (DMM), ונקראת על ידי מחשב טעון בתוכנית לרכישת נתונים. הכרומטוגרמה המתקבלת יש שיא עבור כל רכיב במדגם. לניסוי זה, כל שלושת הרכיבים חומטים תוך 5 דקות.
ניסוי זה משתמש בשלב נייד אחד ומשאבה, אשר נקרא שלב נייד איזוקרטי. עבור דוגמאות שקשה להפריד, ניתן להשתמש בשלב נייד הדרגתי. זאת כאשר השלב הנייד הראשוני הוא בעיקר מימי, ועם הזמן, שלב נייד אורגני שני מתווסף בהדרגה לשלב הנייד הכולל. שיטה זו מעלה את הקוטביות של שלב זה לאורך זמן, אשר מוריד את זמני השמירה של הרכיבים ועובד באופן דומה שיפוע טמפרטורה על כרומטוגרפיה גז. ישנם כמה מקרים שבהם העמודה מחוממת (בדרך כלל עד 40 °C (40 °F), אשר לוקח משם כל שגיאות זמן שמירה הקשורים לשינוי של טמפרטורת הסביבה.
ב- HPLC בשלב הפוך, אריזת השלב הנייח של העמודה היא בדרך כלל אריזת C4, C8 או C18. עמודות C4 מיועדות בעיקר לחלבונים בעלי משקלים מולקולריים גדולים, ואילו עמודות C18 מיועדות לפפטידים ודגימות בסיסיות עם משקלים מולקולריים נמוכים יותר.
זיהוי על ידי ספקטרוסקופיית ספיגה הוא באופן גורף שיטת הזיהוי של בחירה, כמו ספקטרום הקליטה של הרכיבים זמינים כולם. מערכות מסוימות משתמשות במדידות אלקטרוכימיות, כגון מוליכות או אמפרומטריה, כשיטת הזיהוי שלהן.
עבור ניסוי זה, השלב הנייד הוא בעיקר 20% acetonitrile ו 80% מים מטוהרים (DI). כמות קטנה של חומצה אצטית מתווספת כדי להוריד את ה- pH של השלב הנייד, אשר שומר על סילנול בשלב האריזה הניחת במצב לא מזוהה. זה מפחית את שיא הספיגה מן הזנב, נותן פסגות צרות יותר. לאחר מכן, ה- pH מותאם עם 40% נתרן הידרוקסיד כדי להעלות את ה- pH ולעזור להפחית את זמני השמירה של הרכיבים.
כל קבוצה משתמשת בקבוצה של 7 הבקבוקונים המכילים ריכוזים שונים של הפתרונות הסטנדרטיים (טבלה 1). 3 הראשונים משמשים לזיהוי כל שיא, ו- 4 האחרונים מיועדים ליצירת תרשים כיול עבור כל רכיב. תקנים 1-3 משמשים גם עבור תרשים הכיול.
| מספר | קפאין (מ"ל) | בנזואט (מ"ל) | אספרטיים (מ"ל) |
| 1 | 4 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 4 | 0 |
| 3 | 0 | 0 | 4 |
| 4 | 1 | 1 | 1 |
| 5 | 2 | 2 | 2 |
| 6 | 3 | 3 | 3 |
| 7 | 5 | 5 | 5 |
טבלה 1. נפחים של תקני מלאי המשמשים להכנת 7 תקני העבודה שסופקו (הנפח הכולל של כל תקן הוא 50 מ"ל).
Procedure
1. להפוך את השלב הנייד
- הכן את השלב הנייד על ידי הוספת 400 מ"ל של acetonitrile כ 1.5 ליטר של מים DI מטוהרים.
- בזהירות להוסיף 2.4 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית לפתרון זה.
- לדלל את הפתרון לנפח כולל של 2.0 L בבקבוק נפחי עם מי DI מטוהרים. הפתרון המתקבל צריך להיות pH בין 2.8 ל 3.2.
- התאם את רמת ה-pH ל-4.2 על-ידי הוספת 40% נתרן הידרוקסיד, מבחינת ירידה עם שימוש במד pH דיגיטלי מכויל. הוסף לאט מאוד ברגע pH מגיע 4.0. זה צריך לקחת סביב 50 טיפות כדי להשיג.
- לסנן את השלב הנייד באמצעות מסנן ממברנה ניילון 66 0.47-μm תחת ואקום כדי degas הפתרון כדי להסיר מוצקים שיכולים לחבר את העמוד הכרומטוגרפי. חשוב degas השלב הנייד כדי למנוע בועה, אשר יכול גם לגרום חלל בשלב הנייח בכניסת העמודה או לעבוד את דרכו לתוך תא הגלאי, גרימת חוסר יציבות עם ספיגת UV.
2. יצירת פתרונות הרכיבים
שלושת המרכיבים שצריכים להיעשות הם קפאין (0.8 מ"ג/מ"ל), אשלגן בנזואט (1.4 מ"ג/מ"ל) ואפרטם (L-אספרטיל-L-פנילאלנין מתיל אסתר) (6.0 מ"ג/מ"ל). ריכוזים אלה, פעם מדולל באותה צורה, לשים את הסטנדרטים ברמות שנמצאו דגימות סודה.
- הוסיפו 0.40 גרם קפאין לבקבוק נפחי של 500 מ"ל, ואז לדלל לסימן 500 מ"ל עם מי DI.
- הוסיפו 0.70 גרם בנזואט לבקבוק נפחי של 500 מ"ל, ואז לדלל לסימן 500 מ"ל עם מי DI.
- הוסף 0.60 גרם אספרטיים לבקבוק נפחי של 100 מ"ל, ולאחר מכן לדלל לסימן 100 מ"ל עם מי DI. מניחים את הפתרון הזה במקרר כדי למנוע פירוק במהלך האחסון.
3. יצירת 7 פתרונות סטנדרטיים
שלושת הרכיבים כולם יש מקדמי הפצה שונים, אשר משפיע על האופן שבו כל אינטראקציה עם שני השלבים. ככל שמקדם ההפצה גדול יותר, כך הרכיב מבלה יותר זמן בשלב הנייח, וכתוצאה מכך זמני שמירה ארוכים יותר בהגעה לגלאי.
- לאחר התרשים בטבלה 1, הזרם את הכמות המתאימה של כל רכיב לבקבוק נפחי של 50 מ"ל.
- לדלל כל אחד מפתרונות המניה לסימן 50 מ"ל על הבקבוקונים הנפחיים עם שלב נייד.
- יוצקים כל פתרון סטנדרטי לבקבוקונים קטנים המסומנים בארון דוגמה.
- אחסן את מדפי הדגימות במקרר, יחד עם הפתרונות הנותרים בבקבוקונים נפחיים של 50 מ"ל.
4. בדיקת ההגדרות הראשוניות של מערכת HPLC
- ודא כי קו הפסולת נמצא במיכל פסולת ואינו מיחזור בחזרה לשלב הנייד.
- ודא שקצב הזרימה של השלב הנייד מוגדר ל- 0.5 מ"ל/דקה. זה גבוה מספיק כדי לאפשר לכל הפסגות לחמוק תוך 5 דקות ואיטי מספיק כדי לאפשר רזולוציה נחמדה.
- ודא כי הלחץ המינימלי והמקסימלי וקצב הזרימה מוגדרים לערכים הנכונים בלוח הקדמי של מערכת המסירה הממסית (המשאבה).
- הגדרת לחץ מינימלית: 250 פסאיי (זה כדי לכבות את המשאבה, אם מתרחשת דליפה).
- הגדרת לחץ מקסימלית: 4,000 פסאיי (זאת כדי להגן על המשאבה מפני שבירה, אם נוצר סתימה).
- לחץ על "אפס" בלוח הקדמי של הגלאי כדי להגדיר את הריק (הריק הוא השלב הנייד הטהור).
- לשטוף מזרק 100-μL עם מים deionized, ולאחר מכן עם כמה כרכים של אחד תקני העבודה שיש לנתח, ולמלא את המזרק עם פתרון זה. התחל עם 3 דגימות של רכיב יחיד, המאפשר לזהות את השיא של כל רכיב עניין.
5. הזרקה ידנית של המדגם ואיסוף הנתונים
- עם ידית מזרק במצב עומס, לאט להזריק 100 μL של פתרון דרך יציאת המחיצה.
- ודא שתוכנית איסוף הנתונים מוגדרת לאיסוף נתונים עבור 300 s, מה שמאפשר מספיק זמן לכל 3 הפסגות לחמוק דרך הגלאי.
- כאשר אתה מוכן להתחיל את הניסוי, לסובב את ידית המזרק למיקום ההזרקה (אשר מזריק את המדגם לתוך השלב הנייד) ולחץ על "התחל ניסיון" על תוכנית איסוף נתוני המחשב מיד. בתקנים 1-3, רק אחת משלוש הפסגות הרצופות מופיעה על המסך במהלך הריצה(איור 1).
- לאחר ש- 300 s חלפו, איסוף הנתונים שולח בקשה לשמירת קובץ הנתונים. שמור את הנתונים תחת שם קובץ מתאים(למשל,STD #1).
- שים לב לזמן בשניות עבור השיא של כל גירסת ניסיון, המשמשת לזיהוי רכיב זה.
- הסר את המזרק מן המחיצה ולחזור על התהליך עבור כל אחד תקני העבודה הנותרים, באמצעות באותו זמן לכל כרומטוגרמה כפי שנקבע מההפעלה הראשונה.
איור 1. הכרומטוגרמה של 3 הרכיבים. משמאל לימין, הם קפאין, אספרטיים, ובנזואט.
6. הדגימות של דיאט סודה
דיאט קולה, דיאט פפסי וקולה זירו הם ה"לא ידועים". הם הושארו בחוץ במיכלים פתוחים בן לילה כדי להיפטר מהפחמימה, שכן בועות אינן טובות למערכת HPLC. זה מספיק נפטר מכל גזים בדגימות.
- צייר סביב 2 מ"ל של סודה דיאטה לתוך מזרק פלסטיק.
- חבר את קצה המסנן למזרק דרך Luer-Lok על ידי סיבובו במקום.
- דוחפים את הנוזל במזרק דרך המסנן לתוך בקבוקון זכוכית קטן. זה נפטר מחלקיקים לא רצויים שעלולים לסתום את עמודת ההפרדה.
- לדלל כל מדגם עם כמות שווה של מים DI, כך שהם ב 50% טוהר.
- הזרק 100 μL של המדגם לתוך לולאת המדגם, ולהפעיל ניסויים עם אותם פרמטרים כמו עבור הסטנדרטים.
7. חישובים
- מהריכוזים של פתרונות הרכיבים, לחשב את הריכוז של כל הרכיבים בתקנים, בהתבסס על דילול שנעשו עבור 7 דגימות.
- קבע אזורי שיא בכרומטוגרמה עבור כל תקן ואת הדגימות הלא ידועות בשיטה המשולשת, השווה לגובה שיא כפול הרוחב בגובה 1/2 (איור 2). לאחר קביעת הפסגה המתאימה לכל רכיב בהתבסס על הזמן שלוקח לכל רכיב להציג את השיא המתאים לו, הזן אזורי שיא אלה בגיליון אלקטרוני של המחשב.
- צור עקומות כיול של אזור שיא לעומת ריכוז (mg/L) בתקנים עבור כל שלושת הרכיבים.
- קבעו את הריבועים הפחות מתאימים לכל עקומת כיול.
- חשב את הריכוז של כל רכיב במשקאות מוגזים דיאט מאזורי השיא המוצגים בניסויי HPLC עבור הדגימות. זכור כי סודה דיאטה היה מדולל על ידי גורם של 2 לפני הזרקה לתוך מערכת HPLC.
- לחשב את הסכום, mg /L, של כל רכיב משקאות מוגזים דיאטה.
- בהתבסס על התוצאות, לחשב את המיליגרם של כל רכיב שנמצא פחית 12 אונקיות של סודה. נניח 12 אונקיות = 354.9 מ"ל.
איור 2. דוגמה בסיסית לגובה ולרוחב השיא של העקומה, שיש להכפיל (גובה שיא כפול רוחב בגובה 1/2).
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, או HPLC, היא טכניקה רב-תכליתית ביותר המפרידה בין רכיבים של תערובת נוזלית בהתבסס על האינטראקציות השונות שלהם עם שלב נייח.
HPLC הוא עיבוד של כרומטוגרפיה של עמודות. בכרומטוגרפיה של העמודות, עמודה עמוסה בחרוזים בקנה מידה זעיר הנקראים השלב הנייח. חרוזי הפאזה הניויים מתפקדים עם קבוצות כימיות הגורמות לאינטראקציה בין החרוז לבין רכיבי התערובת הממוקמת בנוזל, או בשלב הנייד. כאשר התערובת זורמת דרך העמודה, הרכיבים מתקשרים עם השלב הנייח באופן שונה.
ב- HPLC, כרומטוגרפיה של עמודות מבוצעת בקצב זרימה גבוה יותר, ולכן לחץ גבוה יותר, מאשר כרומטוגרפיה של עמודה קלאסית. זה מאפשר שימוש של חרוזי פאזה נייחים קטנים יותר עם שטח פנים גדול יותר ליחס נפח, אשר מגדיל מאוד את האינטראקציה של השלב הנייח ורכיבים בשלב הנייד.
וידאו זה יציג את היסודות של הפעולה של HPLC על ידי הדגמת ההפרדה של רכיבים של משקאות דיאט שונים.
קיימים שני סוגים של HPLC המשמשים במעבדה: אנליטי, הכנה. ב- HPLC אנליטי, המכשיר משמש לזיהוי רכיבים של אמצעי אחסון קטן, והדגימה המנותחת מושלכת לאחר מכן כפסולת. ב- HPLC הכנה, המכשיר משמש לטיהור תערובת וכמות רצויה של כל רכיב נאספה בשברים.
מכשור HPLC מורכב מסדרה של רכיבים פשוטים. ראשית, השלב הנייד, המוחזק במאגרי ממסים, נשאב דרך המערכת על ידי משאבה אחת או יותר בקצב זרימה קבוע. המדגם מוזרק לתוך זרם הפאזה הנייד על ידי מזרק המדגם. המדגם, המדולל על-ידי השלב הנייד, מועבר לאחר מכן לעמודה HPLC, שם מופרדים רכיבי המדגם. לאחר מכן, הרכיבים מנותחים על ידי הגלאי, ונשמרים בשברים לשימוש מאוחר יותר, או מועברים לבקבוק פסולת.
העמודה HPLC היא רכיב המפתח במערכת. הוא מורכב גליל מתכת או פלסטיק, ארוז עם חרוזים בקנה מידה מיקרו של שלב נייח, או שרף כרומטוגרפיה. תערובת הדגימה זורמת דרך מיטת החלקיקים הארוזה בקצב זרימה קבוע וכל רכיב מתקשר עם השלב הנייח כשהוא זורם על ידי.
המתחמים מתקשרים עם השלב הנייח באופן שונה, ולכן נעים לאורך העמודה לגלאי בקצב שונה. הזמן הדרוש לרכיב כדי לצאת מהעמודה, או לחמוק, נקרא זמן השמירה. התוצאה היא עלילה של זמן שמירה לעומת עוצמה, או כרומטוגרמה. זמן השמירה משמש לזיהוי הרכיב. גודל השיא, במיוחד האזור שמתחת לפסגה, משמש לכימות כמות המתחם בפתרון הראשוני.
הבחירה של שלב נייח תלויה במאפיינים של הרכיבים בתערובת המדגם. השלב הנפוץ ביותר נייח הוא חרוזי סיליקה, שכן הם חומר לא קוטבי אינרטי היוצר חרוזים בקנה מידה מיקרו, ומשיג צפיפות אריזה מספקת. הסוג הנפוץ ביותר של HPLC הוא כרומטוגרפיה הפוכה, המשתמשת בשלב נייח הידרופובי, בדרך כלל חרוזי סיליקה עם שרשראות C18 מלוכדות לפני השטח של החרוזים. הרכיבים נזכרים על מנת להקטין את הקוטביות.
השלב הנייד המשמש כרומטוגרפיה הפוכה הוא בדרך כלל תערובת של מים וממס אורגני, כגון acetonitrile. בהתאם לדגימה, השלב הנייד יכול להישאר יחס קבוע של מים וממס אורגני, המכונה מצב איזוקרטי. עם זאת, הדבר עלול להוביל לפסגות רחבות, במקרה של תכולת מים גבוהה, או פסגות חופפות – במקרה של תוכן אורגני גבוה.
ניתן גם לשנות את יחס הפאזה הניידת באופן ליניארי או צעד במהלך ההפרדה, כדי ליצור מעבר צבע של פאזה ניידת. זלזול הדרגתי יכול למנוע הרחבת שיא של הרכיבים הקוטביים פחות, ובכך לשפר את ההפרדה ולקצר את זמן ההרחבה.
כעת, לאחר שהיסודות של HPLC תוארו, טכניקת HPLC תודגם במעבדה. בניסוי זה, HPLC ישמש להפרדה וכימות שלושה רכיבים נפוצים של סודה דיאט.
ראשית, כדי להכין את השלב הנייד, להוסיף 400 מ"ל של acetonitrile ל 1.5 ליטר של מים מטוהרים deionrile. לאחר מכן בזהירות להוסיף 2.4 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית. לדלל את הפתרון לנפח כולל של 2 L. הפתרון המתקבל צריך להיות pH בין 2.8 ל 3.2.
התאם את רמת ה-pH ל-4.2 על-ידי הוספת 40% NaOH, מבחינת טיפה לפתרון המרגש, עם שימוש במד pH מכויל.
סנן את השלב הנייד באמצעות מסנן ממברנה 0.47-μm תחת ואקום כדי degas הפתרון ולהסיר מוצקים שיכולים לחבר את העמודה. חשוב degas הפתרון, כמו בועות יכול לגרום חללים בשלב הנייח, או לעבוד את דרכם לתא גלאי ולגרום לחוסר יציבות במדידות.
הכן שלושה פתרונות מרכיבים של קפאין, בנזואט, אספרטיים, שהם שלושה מרכיבים אופייניים של משקאות מוגזים דיאט. פתרונות רכיבים אלה משמשים לאחר מכן להכנת הפתרונות הסטנדרטיים שישמשו לקביעת הלא ידועים. הכן 500 מ"ל של קפאין ופתרונות בנזואט.
הכן 100 מ"ל של פתרון רכיב אספרטיים. יש לאחסן את הפתרון במקרר כאשר אינו בשימוש כדי למנוע פירוק.
לאחר מכן, להכין 7 פתרונות סטנדרטיים, כל אחד עם ריכוזים שונים של קפאין, בנזואט, אספרטיים. הזרם את הכמות המתאימה של כל רכיב לבקבוק נפחי, ודלל לסימן 50 מ"ל עם שלב נייד.
3 הפתרונות הראשונים מכילים כל רכיב אחד, כדי לאפשר זיהוי שיא. 4 הפתרונות האחרים מכילים מגוון ריכוזים של כל 3 הרכיבים, על מנת לתאם את גובה השיא לריכוז.
יוצקים כל פתרון סטנדרטי לתחנתון עם תווית בארון דוגמה. יש לאחסן את מדף הדגימה עם דוגמאות ואת הפתרונות הנותרים במקרר.
ראשית, להגדיר את השלב הנייד מכולות פסולת. ודא כי קווי הפסולת מוזנים לתוך מיכל פסולת, והם לא מיחזור בחזרה לשלב הנייד. ודא שקו הפאזה הנייד של הכניסה מוזן למיכל השלב הנייד.
ודא שקצב הזרימה של השלב הנייד מוגדר ל- 0.5 מ"ל/דקה. קצב זרימה זה יאפשר לכל הרכיבים לחמוק תוך 5 דקות, אך הוא איטי מספיק כדי להבטיח רזולוציה של פסגות בודדות.
לאחר מכן, אמת את הלחצים המינימליים והמקסימום על מערכת אספקת הממסים. הגדרות אלה סגרו את המשאבה במקרה של דליפה או סתימה, בהתאמה.
לחץ על "אפס" בלוח הקדמי של הגלאים, כדי להגדיר את הריק. לשטוף מזרק 100-μL עם מים deionized, ולאחר מכן עם כמה כרכים של 1 מתוך 7 תקני עבודה. אז תמלא את המזרק בתמיסה הזאת. התחל עם 3 דגימות של רכיב יחיד כדי לזהות את השיא של כל רכיב.
לאחר מכן, הזריקו ידנית את התמיסה, על ידי הצבת ידית המזרק במצב העומס. לאט להזריק את 100 μL של פתרון דרך יציאת המחיצה.
ודא שתוכנית איסוף הנתונים מוגדרת לאיסוף נתונים עבור 300 s, מה שמאפשר מספיק זמן לכל 3 הפסגות לחמוק דרך הגלאי. כאשר מוכן להתחיל את הניסוי, לסובב את ידית המזרק למיקום ההזרקה, על מנת להזריק את המדגם לתוך השלב הנייד. מיד, לחץ על "התחל גירסת ניסיון" בתוכנית איסוף הנתונים. לאחר השלמת הסריקה, חזור על התהליך עבור כל אחד מ- 7 הפתרונות הסטנדרטיים. עבור כל אחד מ-3 התקנים הראשונים, מופיעה רק אחת מ-3 הפסגות. שים לב למיקום הפסגה, המשמשת לזיהוי הרכיב.
בחר 3 דגימות סודה דיאט, ולאפשר להם לשבת בחוץ במיכלים פתוחים לילה כדי להסיר את הפחמימה.
לאחר סילוק גיחות לילה, לצייר כ 3 מ"ל של כל סודה דיאטה לתוך מזרק פלסטיק. לאחר מכן, לצרף קצה מסנן למזרק ולדחוף את הסודה דרך המסנן לתוך בקבוקון זכוכית, על מנת להסיר כל חלקיקים מוצקים.
לדלל 2 מ"ל של כל מדגם עם 2 מ"ל של השלב הנייד כדי להקטין את ריכוז הסודה בחצי.
צייר 100 μL של אחת מדגימות סודה לתוך מזרק, ולהזריק אותו לתוך לולאת המדגם. הפעל את גירסת הניסיון עם פרמטרים זהים לפתרונות הסטנדרטיים. חזור על הפעולה עבור כל דגימת סודה.
ראשית, לתאם את אזורי השיא של הדגימות הסטנדרטיות לריכוזים הידועים. כדי לעשות זאת, לקבוע את אזורי השיא על הכרומטוגרפים עבור כל מדגם סטנדרטי באמצעות השיטה המשולשת. חשב את זמני הגובה של השיא ברוחב של חצי מהגובה והשתמש בערך זה כאזור השיא.
השימוש באזור השיא והריכוזים הידועים יוצרים עקומת כיול עבור כל רכיב וקובעים את הריבועים הפחות מתאימים לכל עקומת כיול.
לחשב את הריכוז של כל רכיב משקאות מוגזים דיאטה מאזורי השיא. זכור כי משקאות מוגזים היו כל מדולל על ידי גורם של 2 לפני הזרקה לתוך HPLC. בהתבסס על תוצאות אלה, לחשב את המ"ג של כל רכיב בפחית 12 אונקיות של סודה.
באופן לא מפתיע, כל 3 משקאות מוגזים שנבדקו הכילו בערך את אותה כמות של בנזואט משמר. עם זאת, מוצרי קולה הכילו יותר קפאין. הערכים המחושבים עבור כל הרכיבים מתואמים היטב לערכים המדווחים על-ידי היצרנים.
HPLC הוא מכשיר רב-תכליתי ביותר, המשמש במגוון רחב של ניתוחים.
HPLC משמש לעתים קרובות כדי לטהר מולקולות פפטיד. בדוגמה זו, מתחמי פפטיד transmembrane הוכנו, ולאחר מכן התייצבו על ידי הצלבה חמצונית של החלבונים עם קשרים דיסולפידים.
החלבונים הומסו אז בחומצה פורמית, וטוהרו באמצעות HPLC בשלב הפוך. המדגם נגמל אז באמצעות שיפוע ליניארי של שני ממיסים, והטוהר אושר עם ספקטרומטריית מסה.
HPLC יכול לשמש גם לזיהוי תרכובות אורגניות מסונתזות במעבדה. בניסוי מילר-אורי, הסינתזה האביוטית של תרכובות אורגניות על כדור הארץ הקדמוני נחקרה. גזים קדמונים, כגון מתאן ואמוניה, הוכנסו לבקבוק המכיל מים, המדמה אוקיינוסים מוקדמים. לאחר מכן הופעלה פריקה חשמלית, ומחקה ברקים על פני האדמה הקדמונית.
לאחר מכן נותחו המים באמצעות HPLC בשילוב עם ספקטרומטריית מסה, בהשוואה לתקנים ידועים של חומצות אמינו. 23 חומצות אמינו היו מסונתזות וזוהו בניסוי זה.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב ל-HPLC. כעת עליך להבין את היסודות של הפעלת המכשיר וניתוח הנתונים המתקבלים.
תודה שצפיתם!
Results
הכרומטוגרמה של HPLC מסוגלת לכמת כל אחד מ-3 הרכיבים עבור כל הדגימות בהתבסס על עקומות הכיול של התקנים(איור 3).
מתוך קבוצה זו של ניסויים, נקבע כי פחית 12 אונקיות של משקאות דיאט דיאט אלה הכיל את הכמויות הבאות של כל רכיב:
דיאט קולה: 50.5 מ"ג קפאין; 217.6 מ"ג אספרטיים; 83.6 מ"ג בנזואט.
קולה זירו: 43.1 מ"ג קפאין; 124.9 מ"ג אספרטיים; 85.3 מ"ג בנזואט.
דיאט פפסי: 34.1 מ"ג קפאין; 184.7 מ"ג אספרטיים; 79.5 מ"ג בנזואט.
באופן לא מפתיע, כל 3 היה בערך באותה כמות של בנזואט, כפי שהוא רק חומר משמר. למוצרי הקולה היה קצת יותר קפאין, ולקולה זירו היה הרבה פחות אספרטיים משתי המשקאות הנוספים, מכיוון שהוא כולל גם חומצת לימון לקצת טעם.
המספרים הבאים הם כמויות קפאין ואפרטם בפועל בפחית של 12 אונקיות של 3 משקאות מוגזים דיאט (תוכן הקפאין התקבל מאתרי קוקה קולה ופפסי. תוכן אספרטיים התקבל הן LiveStrong.com והן DiabetesSelfManagement.com.):
דיאט קולה: 46 מ"ג קפאין; 187.5 מ"ג אספרטיים
קולה זירו: 34 מ"ג קפאין; 87.0 מ"ג אספרטיים
דיאט פפסי: 35 מ"ג קפאין; 177.0 מ"ג אספרטיים
חישובים לדוגמה (טבלה 2):
ריכוז קפאין ב STD #1: הפתרון המרכיב עבור קפאין היה 0.400 גרם של קפאין מדולל ל 500 מ"ל = 0.500 L → 0.800 גרם / ליטר = 0.800 מ"ג / מ"ל.
STD #1 היה 1 מ"ל של פתרון זה מדולל ל 50.0 מ"ל
0.800 מ"ג/מ"ל * (1.0 מ"ל / 50.0 מ"ל) = 0.016 מ"ג / מ"ל = 16.0 מ"ג / ליטר.
STD #2 היה 2 מ"ל של פתרון זה מדולל ל 50.0 מ"ל
0.800 מ"ג/מ"ל * (2.0 מ"ל / 50.0 מ"ל) = 0.032 מ"ג / מ"ל = 32.0 מ"ג / ליטר.
התוצאות משלושת תרשימי הכיול (איור 4) הניבו את המשוואות הבאות:
אזור שיא קפאין = 0.1583*[קפאין מ"ג/ליטר] - 0.574
אזור פסגת אספרטיים = 0.02696*[אספרטיים מ"ג/ליטר] - 0.405
אזור פסגת בנזואט = 0.1363*[בנזואט מ"ג/ל' - 1.192
דיאט קולה: אזור שיא קפאין = 10.68 = 0.1583*[קפאין מ"ג/ליטר] - 0.574
[קפאין מ"ג/L] = ((10.68 + 0.574)/ (0.1583) = 71.1 מ"ג/ל' במדגם המוזרק.
מאז המדגם היה מדולל על ידי גורם של 2, דיאט קולה היה 141.2 מ"ג / ליטר קפאין.
הכמות לכל פחית של 12 אונקיות = (141.2 מ"ג/ל')(0.3549 מ"ל/12 אונקיות) = 50.5 מ"ג קפאין/פחית.
איור 3. הכרומטוגרמה של HPLC של 5 התקנים ו-3 הדגימות.
איור 4. הכיול מתעקל עבור כל אחד מ-3 הרכיבים.
טבלה 2. טבלאות הנתונים עבור ניסויי HPLC המשמשים ליצירת עקומות הכיול.
Applications and Summary
HPLC היא טכניקה נפוצה בהפרדה ובזיהוי עבור יישומים רבים. הוא אידיאלי עבור תרכובות לא נדיפות, כמו כרומטוגרפיה גז (GC) דורש כי הדגימות נמצאות בשלב הגז שלהם. תרכובות לא נדיפות כוללות סוכרים, ויטמינים, תרופות, מטבוליטים. כמו כן, זה לא הרסני, המאפשר לאסוף כל רכיב לניתוח נוסף (כגון ספקטרומטריית מסה). השלבים הניידים הם כמעט בלתי מוגבלים, מה שמאפשר שינויים בקוטביות של pH כדי להשיג רזולוציה טובה יותר. השימוש בשלבים ניידים הדרגתיים מאפשר שינויים אלה במהלך הניסויים בפועל.
יש כבר חשש לגבי בעיות בריאותיות אפשריות שעשויות להיות קשורות אספרטיים ממתיק מלאכותי. תיוג המוצר הנוכחי אינו מציג את כמות הרכיבים האלה בתוך משקאות הדיאטה. שיטה זו מאפשרת לכמת כמויות אלה, יחד עם קפאין ובנזואט.
יישומים אחרים כוללים קביעת כמויות חומרי הדברה במים; קביעת כמות פרצטמול או איבופרופן בטבליות משככי כאבים; קביעת אם יש תרופות לשיפור ביצועים נוכח זרם הדם של ספורטאים; או פשוט לקבוע את נוכחותם של סמים במעבדת פשע. בעוד הריכוזים של דגימות אלה, ולעתים קרובות את זהות הרכיבים, ניתן לקבוע בקלות, המגבלה היחידה היא כי כמה דגימות יכול להיות קרוב זמני שימור זהים, וכתוצאה מכך שיתוף eluting.
