Overview
מקור: המעבדה של ד"ר .B ג'יל וטון - אוניברסיטת וירג'יניה
כרומטוגרפיה של חילופי יונים היא סוג של כרומטוגרפיה המפרידה בין ניתוחים על בסיס טעינה. נעשה שימוש בעמודה הממלאת בשלב נייח טעון בתמיכה מוצקה, הנקראת שרף חילופי יונים. כרומטוגרפיה חזקה של חילופי cation מפרידה באופן מועדף בין ציטוטים באמצעות שרף טעון שלילית, בעוד כרומטוגרפיה חזקה של חילופי אניון בוחרת באופן מועדף אניונים באמצעות שרף טעון חיובית. סוג זה של כרומטוגרפיה פופולרי להכנת מדגם, למשל בניקוי חלבונים או דגימות חומצת גרעין.
כרומטוגרפיה של חילופי יונגים היא תהליך דו-שלבי. בשלב הראשון, הדוגמה נטענת לעמודה במאגר טעינה. הכריכה של המדגם הטעון לשרף העמודה מבוססת על אינטראקציות יוניות של השרף כדי למשוך את המדגם של המטען ההפוך. לפיכך, דגימות טעונות של קוטביות הפוכה לשרף קשורות בחוזקה. מולקולות אחרות שאינן טעונות או הן מטען הפוך אינן כבולות ונשטפות דרך העמודה. השלב השני הוא לחמוק מהניתוח הכרוך בשרף. זה מושג עם שיפוע מלח, שבו כמות המלח במאגר גדל לאט. שברים נאספים בסוף העמודה כאשר ההתחמקות מתרחשת וניתן לשחזר את המדגם המטוהר של העניין באחד השברים האלה. ייתכן שיהיה צורך בטכניקה אחרת, כגון ספקטרוסקופיה, כדי לזהות איזה שבר מכיל את הדגימה. כרומטוגרפיה של חילופי יונים שימושית במיוחד במחקרי חלבון, כדי לבודד חלבונים בעלי עניין בעלי מטען או גודל ספציפיים, שכן הגודל יכול לקבוע את מספר האינטראקציות עם השרף.
כרומטוגרפיה של חילופי יונים היא טכניקת הפרדה כללית יותר מאשר כרומטוגרפיה של זיקה, המשמשת לעתים קרובות גם בהכנת דגימות חלבון, שבהן מחובר נוגדן לעמודה כדי לאגד ניתוח ספציפי אחד. יש לרכוש עמודת זיקה חדשה עבור כל ניתוח, בעוד שאותו סוג של עמודת חילופי יונים, לעתים קרובות עם תנאי חיזוי שונים, יכול לשמש לניקוי חלבונים רבים מאותו מטען. כרומטוגרפיה של חילופי יונים יכולה לשמש גם בשילוב עם סוגים אחרים של כרומטוגרפיה המפרידים בהתבסס על מאפיינים אחרים. לדוגמה, כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל נפרדת בהתבסס על גודל וניתן להשתמש בה לפני כרומטוגרפיה של חילופי יונים כדי לבחור תרכובות בגודל נתון בלבד.
Principles
כרומטוגרפיה של חילופי יונים נשלטת על ידי עקרונות של אינטראקציות כימיות יוניות המובילות לספיחה הפיכה של הניתוח בשלב הנייח. כוח הקשר בין המדגם לבין התמיכה המוצקה נשלט על ידי מספר וסוגים של קבוצות פונקציונליות על המדגם ואת השרף. מאגר הטעינה בדרך כלל יש מוליכות נמוכה על מנת לקדם אינטראקציות בין המדגם לבין שרף. בשרפים חילופי cation חזקים בדרך כלל תכונה קבוצות פונקציונליות חומצה גופרתית בעוד בשרפים חלשים חילופי cation יש חומצות קרבוקסיליות. בשרפים חזקים לחילופי אניוניה מכילים אמינים רב-שנתיים, בעוד בשרפים חלשים להחלפת אניון יש אמינים משניים או שלישוניים. המונחים חזקים וחלשים מתייחסים למאפייני החומצה/בסיס של חומר העמודה ולא עד כמה הוא קושר ניתוח. בשרפים חלשים טעונים על טווח pH קטן יותר מאשר בשרפים חזקים, אך עדיין קושרים את הניתוחים בצורה יעילה מאוד, ויכולים להיות בחירה טובה אם הם טעונים בטווח ה- pH הדרוש. לפני השימוש, עמודות חילופי יונים מכווצות ב- pH באמצעות מאגר שיוויון.
כדי לחמוק מדגם העניין, נעשה שימוש בשיפוע מלח. דגימות כי הם פחות קשורים חזק שרף יהיה לחמוק הראשון, כמו המלח יפריע בקלות רבה שלהם קשר יוני לעמוד. דגימות כי הם קשורים בחוזקה יותר יחמוק מאוחר יותר, כאשר כמויות גבוהות יותר של מלח משמשים. בדרך כלל, שיפוע ליניארי של מלח משמש, שבו ריכוז המלח עולה עם הזמן בצורה ליניארית. עם זאת, שיפועי צעדים יכולים לשמש גם כאשר ריכוז המלח מוגבר לאורך זמן.
אחד השיקולים החשובים לניסויים של חילופי יונים הוא ה-pH של המאגרים. ה- pH צריך להישמר כך שניתח הריבית יחויב ויחייב את השרף. עבור חלבונים, המטען מבוסס על הנקודה האיזואלקטרית של החלבון, שבה החלבון טעון באופן נייטרלי, ונמדד כ- pI. ה-pH בהשוואה ל-pI של החלבון מספק מידע על מטען החלבון הצפוי. בכרומטוגרפיה של חילופי cation, העלאת ה- pH תגרום לנתח להיות טעון פחות חיובי ופחות סביר לאינטראקציה עם השרף הטעון שלילית. באופן דומה, בכרומטוגרפיה של החלפת אניון, הורדת ה- pH תגרום לנתח להיות פחות טעון שלילית ופחות סביר לאינטראקציה עם השרף הטעון באופן חיובי. לכן התאמות pH יכול לשמש גם כדי לחמוק באופן סלקטיבי ניתוחים מהעמודה. השימוש בהתאמות pH במקום מלחים יכול להיות יתרון להפרדת שני סוגים שונים של חלבונים עם ערכי pI שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הכנת המדגם והעמודה
- בהדגמה זו, תערובת של 2 חלבונים תופרד על עמוד חילופי קטיונים: המוגלובין וציטכרום C. הוסף 0.2 מ"ל חיץ שיווי משקל (pH 8.1) לדגימת החלבון והמערבולת לערבב ביסודיות. צנטריפוגה במשך 2 דקות כדי להסיר כל קצף.
- מניחים את עמודת חילופי הקיצונים במבחנה למשך 5 דקות כדי לאפשר לשרף להתיישב. מהדק את המבחנה עם העמוד על דוכן טבעת כדי לוודא שהוא זקוף.
- פתח את המכסה העליון של העמודה ולאחר מכן את המכסה התחתון. אפשר למאגר בעמודה לטפטף החוצה מתחת לכוח המשיכה לתוך המבחנה.
- לשטוף את העמודה פעמיים עם אמצעי אחסון עמודה (במקרה זה אמצעי האחסון של העמודה הוא 0.3 מ"ל) של מאגר שקילת. תן לנפח העמודות הראשון (0.3 מ"ל) של מאגר שיווי משקל לטפטף החוצה לתוך ממתקין הפסולת לפני הוספת נפח העמודה השני. שלב זה מאפשר לעמודה להיות מכווצת עם מאגר ההסתה. הוסף את מאגר שיווי משקל לאט בשלב זה כדי לא להפריע שרף.
2. הפעלת דגימת חלבון באמצעות עמודת חילופי Cation
- שים את העמוד בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל שכותרתו "לא מאוגד 1". לטעון בזהירות 0.1 מ"ל של דגימת החלבון על החלק העליון של העמודה.
- לאחר המדגם נטען על החלק העליון של העמודה, לשטוף אותו עם 0.3 מ"ל של מאגר שיווי משקל על ידי הוספת המאגר בחלק העליון של העמודה ומאפשר לו לטפטף לאורך כל הדרך. חזור על שלב 4x זה (בסך הכל 5 כביסות) ולאסוף כל לשטוף בצינור צנטריפוגה נפרד, 2 מ"ל. תייג את הצינורות כ"לא מאוגד 1-5".
- עבור 2 הכביסות האחרונות, צנטריפוגה עבור 10 s ב 1,000 x g כדי לוודא שכל המינים הלא מאוגדים יורדים מהעמוד. כל דגימה שנקשרת לעמודה לא צריכה להיות בשטיפה זו, אך מדגם שאינו מאוגד יישטף ללא טעם. צנטריפוגה מספקת כוח רב יותר לשטוף חומרים לא מאוגדים מהעמוד.
- שים את העמודה בצינור אוסף צנטריפוגות חדש בגודל 2 מ"ל שכותרתו "קשור 1". שים 0.3 מ"ל של חוצץ אלוטיון (מלח גבוה, pH 5.5) על גבי העמודה. צנטריפוגה האלנט המתקבל עבור 10 s ב 1,000 x g.
- חזור על שלב ההתחמקות 2 פעמים נוספות על ידי הצבת העמודה בצינור צנטריפוגה חדש, הוספת 0.3 מ"ל וצנטריפוגה עבור 10 s. תייג את אלה "קשור 2 ו -3".
- הקלט שינויים או תצפיות בצבע על השברים. המוגלובין הוא חלבון צבעוני שנראה חום אדמדם בעוד ציטוכרום C הוא בצבע אדמדם.
3. תוצאות: חילופי cation של המוגלובין וציטכרום C
- לציטוכרום סי יש pI של 10.5 ומוגלובין עם pI של 6.8. לכן, כאשר נעשה שימוש במאגר שיווי משקל pH 8.1, המוגלובין אינו מאוגד לעמודה מכיוון שהוא טעון לרעה. Cytochrome C טעון באופן חיובי ב- pH זה והוא נקשר לעמודה מכיוון שה- pH < pI.
- המוגלובין נצפה בשברים הלא מאוגדים מכיוון שהוא אינו מאוגד לעמודה.
- Cytochrome C נצפתה בשברים מאוגדים, מכיוון שהיא הייתה קשורה לעמודת חילופי הקטירות.
איור 1. תמונה של שבר לא מאוגד (המוגלובין) ושבר כבול (ציטוכרום C).
כרומטוגרפיה של חילופי יונים נמצאת בשימוש נרחב בהפרדה ובידוד של תרכובות טעונות, במיוחד ביומולקולים גדולים.
סוג זה של כרומטוגרפיה נוזלית משתמש בעמודה של חרוזים ארוזים בשלב נייח, הנקרא שרף. הטכניקה מפרידה בין ניתוחים על סמך זיקתם לשרף הטעון.
ישנם שני סוגים עיקריים של טכניקה זו. בכרומטוגרפיה של חילופי cation, שרף טעון שלילי משמש לקשירת ניתוחים טעונים חיובית. באופן דומה, בחילופי אניונים, ניתוחים טעונים שלילית נקשרים לשרף טעון לחיוב. התרכובות הלא מאוגדות נשטפות דרך העמודה, ולאחר מכן ניתן לאסוף את הניתוח במיכל נפרד.
וידאו זה יציג את היסודות של כרומטוגרפיה חילופי יונים, ולהדגים את הטכניקה על ידי הפרדת תערובת חלבון במעבדה.
השלב הנייח הוא מרכיב מרכזי להפרדה מוצלחת. שרפים חזקים להחלפת cation כוללים בדרך כלל קבוצות פונקציונליות חומצה חזקה, כגון חומצה גופרתית. בשרפים חלשים להחלפת cation-exchange כוללים קבוצות חלשות, כגון חומצות קרבוקסיליות.
באופן דומה, בשרפים חזקים להחלפת אניון משתמשים בבסיסים חזקים, כמו אמינים רבועים, בעוד בשרפים חלשים להחלפת אניון להשתמש אמינים משניים או שלישוניים. הבחירה של שרף יהיה תלוי המאפיינים של תערובת מדגם, ואת הניתוח של עניין.
המאגרים המשמשים, הנקראים יחד השלב הנייד, חשובים גם להפרדה, במיוחד במונחים של pH. עבור חלבונים, pH נבחר על סמך הנקודה האיזואלקטרית שלו, או pI. ברמת pH השווה ל-pI של החלבון, החלבון ניטרלי. מעל ה-pI, יהיה לו מטען שלילי נטו, בעוד שמתחת ל- pI, יהיה לו מטען חיובי נטו. יש לבחור את ה- pH של המאגר כך שהחלבון טעון כראוי ומסוגל להיקשר לשלב הנייח.
כרומטוגרפיה של חילופי יונגים היא בדרך כלל תהליך בן ארבעה שלבים. ראשית, עמודה ארוזה המכילה שרף של אניון או חילופי קטיונים היא מכווצת באמצעות מאגר. עבור עמודות החלפת אניון, הדבר כרוך בהבלטת השרף, ומבטיח שהוא טעון באופן חיובי.
לאחר מכן, המדגם נטען בעמודה. המאגר חייב להיות מוליכות נמוכה, כמו מינים טעונים יכולים להתחרות עם המדגם עבור אינטראקציות עם שרף. תרכובות של מטען הפוך נקשרות לשרף. מולקולות שאינן טעונות, או נושאות את אותו המטען, נשארות לא מאוגדות.
בשלב השלישי, העמודה נשטפת עם מאגר נוסף כדי להסיר את הרכיבים הלא מאוגדים מהעמודה, ומשאירה את הגבול מאחור.
לבסוף, השלב הרביעי הוא ההבעה של הניתוח הכבול. זה מושג או באמצעות שיפוע מלח, שבו ריכוז המלח גדל בהדרגה, או באמצעות חוצץ אלוטציה מלח גבוה.
מולקולות הכרוכות חלשות יתבהרו תחילה, שכן המלח הנמוך יפריע בקלות רבה להיקשרות היונית שלהם לשרף. תרכובות כי הם קשורים חזק יותר יהיה לחמוק עם ריכוזי מלח גבוהים יותר.
כעת, לאחר שהיסודות של כרומטוגרפיה של חילופי יונים תוארו, בואו נבחן את השימוש בו בהפרדה של שני חלבונים.
ראשית, כדי להכין את תערובת החלבון להפרדה, להוסיף 0.2 מ"ל של חוצץ כריכה, מערבולת לערבב ביסודיות. לאחר מכן, צנטריפוגות התערובת כדי להסיר כל קצף. כדי להכין את עמודת חילופי הcation, מהדק אותה אנכית על מעמד טבעת, ואפשר לשרף להתיישב.
פתח את המכסה העליון של העמודה ולאחר מכן את החלק התחתון. אפשר למאגר לטפטף החוצה תחת כוח המשיכה לתוך צינור מתחת.
כדי להכין את העמודה, שילוו אותו על-ידי טעינת אמצעי אחסון של עמודות של מאגר, במקרה זה 0.3 מ"ל. תן למאגר לטפטף מהעמוד לתוך מקטורון פסולת. לאחר שיצא אמצעי אחסון של עמודות של מאגר, חזור על שלב השתוות הקול.
כדי להפעיל את הניסוי, מקם צינור צנטריפוגה 2 מ"ל שכותרתו "Unbound 1" מתחת לעמודה. לטעון בזהירות 0.1 מ"ל של דגימת החלבון על החלק העליון של העמודה.
לאחר הדגימה נטען, לשטוף עם נפח עמודה של חוצץ ולאפשר לו לזרום לאורך כל הדרך. חוזרים על הפעולה ל-5 כביסות. לאסוף כל לשטוף בצינור שלה, שכותרתו "לא מאוגד 1" עד "5". עבור 2 הכביסות האחרונות, צנטריפוגה את העמודה במשך 10 s כדי לוודא שכל המינים הלא מאוגדים לשטוף את העמוד. שים את הטור בצינור איסוף צנטריפוגות חדש של 2 מ"ל, ותייג אותו כ"כבול 1". טען אמצעי אחסון של עמודה אחד של מאגר אלוטציה מעל העמודה. צנטריפוגה ל-10 s ב-1,000 x ז'.
חזור על שלב ההתחמקות 2 פעמים נוספות כדי להבטיח איסוף של הניתוח הכבול. תייג את הצינורות "קשור 2" ו "3". הקלט שינויים או תצפיות בצבע על השברים.
בדוגמה זו, המוגלובין וציטכרום C הופרדו. להמוגלובין יש PI של 6.8, בעוד שלציטוכרום סי יש pI של 10.5. במאגר pH 8.1, המוגלובין טעון לרעה ואינו מאוגד לעמודה. לעומת זאת, ציטוכרום C טעון באופן חיובי ב- pH 8.1 ונקשר לעמודה.
המוגלובין, חלבון בצבע חום, נמצא בשברים הלא מאוגדים, בעוד ציטוכרום C, חלבון בצבע אדמדם, נצפה בשבר הכבול.
ישנן צורות רבות של כרומטוגרפיה נוזלית, כל אחד עם יכולות שונות להפריד מרכיבים של תערובת.
בדוגמה זו, כרומטוגרפיה עמודה שימשה להפרדת תערובת של DNA יחיד כפול תקוע. הידרוקסיאפטיט, או HA, היא צורה גבישית של סידן פוספט נפוץ כמו שלב נייח בשל יוני סידן טעון חיובית שלה. במקרה זה, עמוד HA היה אידיאלי להפרדת ה- DNA מכיוון שהוא יכול להיקשר לעמוד השדרה הטעון השלילי של ה- DNA.
צורה נוספת של כרומטוגרפיה עמודה המשמשת לעתים קרובות להפריד חלבונים היא כרומטוגרפיה זיקה מתכת משותקת, או IMAC. ב- IMAC, השלב הנייח מחזיק ליגנד עם יון מתכת, אשר נקשר לתג היסטידין על חלבון העניין.
כל שאר הרכיבים של התערובת יוצאים מהעמודה. לאחר מכן החלבון הוא eluted עם פתרון של imidazole, אשר יש מבנה דומה היסטידין, ונקשר חזק יותר עם יון מתכת.
יישום נפוץ של כרומטוגרפיה עמודה הוא כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, או HPLC. HPLC נמצא בשימוש נרחב בכימיה אנליטית הן לזיהוי והן להפרדה של תרכובות ביולוגיות ולא ביולוגיות בתערובת.
HPLC דומה לכרומטוגרפיה של העמודות המודגמת בסרטון זה, אלא שהיא אוטומטית, ומופעלת בלחצים גבוהים מאוד. זה מאפשר שימוש של חרוזים נייחים-פאזה קטנים יותר, עם שטח פנים גבוה יותר ליחס נפח. לכן, אינטראקציות משופרות בין השלב הנייח ורכיבים בשלב הנייד אפשריים.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לכרומטוגרפיה של חילופי יונג. עכשיו אתה צריך להבין את המושגים מאחורי זה, 4 השלבים המעורבים, וכמה טכניקות הקשורות.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
כרומטוגרפיה של חילופי יונים נמצאת בשימוש נרחב בביוכימיה כדי לבודד ולטהר דגימות חלבון. חלבונים יש חומצות אמינו רבות עם קבוצות פונקציונליות כי הם טעונים. חלבונים מופרדים על בסיס טעינה נטו, אשר תלוי pH. חלבונים מסוימים טעונים באופן חיובי יותר בעוד שאחרים טעונים באופן שלילי יותר. בנוסף, תגי פפטיד ניתן להוסיף גנטית חלבון כדי לתת לו נקודה איזואלקטרית שאינה בטווח של חלבונים נורמליים, מה שהופך אותו להפריד לחלוטין. כרומטוגרפיה של חילופי יונים שימושית להפרדת מתחמי חלבון רב-מצביים, שכן בתצורות שונות יהיו כמויות שונות של מטען ואינטראקציות שונות.
יישום מרכזי נוסף של כרומטוגרפיה חילופי יונים הוא ניתוח מים. כרומטוגרפיה החלפת אניון ניתן להשתמש כדי למדוד את הריכוז של אניונים, כולל סולפטים, חנקות, ניטריטים, פלואוריד, וכלוריד. כרומטוגרפיה של חילופי Cation משמשת למדידת ריכוז של cations כגון נתרן, אשלגן, סידן, ומגנזיום. סוג של כרומטוגרפיה חילופי יונים משמש גם בטיהור מים, כמו רוב מרככי מים לסנן מגנזיום ויוני סידן במים קשים על ידי קשירתם שרף, אשר משחרר נתרן קשור. מתכות כבדות, כגון נחושת או עופרת, ניתן גם להסיר מהמים באמצעות כרומטוגרפיה חילופי יונים.
כרומטוגרפיה של חילופי יונג שימושית גם בטיהור מתכת. זה יכול לשמש כדי לטהר actanides, כגון פלוטוניום, ולהסיר אותו ממוטות דלק כור גרעיני בילה. זה יכול לשמש גם כדי נבלות אורניום ולהסיר אותו ממים או דגימות סביבתיות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
