Overview
Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidade de Notre Dame, IN
Um requisito fundamental da pesquisa biomédica é a identificação adequada dos animais de pesquisa. É essencial que o animal certo seja utilizado para procedimentos e coleta de dados. Ratos e ratos de laboratório podem ser identificados com os seguintes métodos permanentes: etiquetas de ouvido, códigos de perfuração de ouvido, implantação de microchip, tatuagens de cauda para camundongos adultos e tatuagens dos dedos dos dedos para recém-nascidos. Métodos temporários de corantes e canetas de marcação também podem ser usados para estudos agudos. Este vídeo abrange os aspectos técnicos da marcação e perfuração de ouvido para ratos e ratos, bem como os benefícios de cada um em relação ao tipo de pesquisa que está sendo realizada nos animais. O conhecimento das técnicas básicas de contenção manual para cada animal (coberto em um vídeo separado) é necessário para que esses métodos de identificação sejam devidamente realizados.
Principles
As etiquetas de ouvido são baratas e fáceis de executar e, como resultado, são comumente usadas para a identificação de ratos e ratos individuais. As tags podem ser feitas sob medida com uma série de números e/ou letras. Atribuindo códigos específicos a uma cepa de rato/rato, ou a um Investigador de Princípios (PI), assessores na manutenção de registros e gerenciamento de banco de dados, especialmente em grandes colônias de reprodução onde há múltiplas cepas e PIs. Além disso, há uma variedade de tags comercialmente disponíveis. Etiquetas de metal têm caracteres gravados neles. Embora esta gravação seja clara, ao trabalhar com um mouse muitas vezes é necessário pegá-lo para ler o código nas tags devido ao pequeno tamanho das tags. Outras opções são etiquetas de plástico com números e/ou letras em fundos coloridos ou etiquetas de plástico com um código de barras na superfície frontal. Ambas as opções permitem que as etiquetas sejam lidas sem ter que lidar com os animais. Outra vantagem para as etiquetas plásticas é sua compatibilidade com a ressonância magnética.
O posicionamento da etiqueta no ouvido é crítico, pois o posicionamento inadequado pode ter várias consequências infelizes. As etiquetas devem ser colocadas de forma que não causem uma curva no pinna, interfiram na mobilidade do animal ou peguem em qualquer parte do caging. Se a etiqueta for colocada muito perto da borda da orelha, ela pode ser facilmente arrancada do tecido pinna. Se posicionada muito perto da cabeça, a pele da área do pescoço pode pegar na etiqueta, o que criará irritação, dor e movimento restrito. Isso pode, então, levar ao auto-trauma do animal coçando a etiqueta, arrancando-a da orelha, ou ficando um pé preso na etiqueta. O treinamento para a colocação adequada e técnica é essencial. 1
Embora as tags forneçam identificadores individuais para ratos ou ratos, eles não são infalíveis. As etiquetas podem ser perdidas devido a lutas, excesso de aliciamento, dermatite em cepas suscetíveis, infecção ou auto-trauma. 2 Ratos adultos, em particular, são menos tolerantes com as etiquetas de ouvido e muitas vezes os removem, infligindo auto-trauma. O comportamento de reprodução mais agressivo em ratos também pode levar a uma etiqueta de ouvido sendo arrancada do pinna. Se ratos ou ratos estiverem emparelhados ou agrupados em grupo, a perda de uma etiqueta de ouvido em mais de um animal pode ser problemática. Para contornar esse problema, uma forma secundária de identificação - como um código de perfuração usado na orelha em frente à tag, ou uma tatuagem de cauda ou dedo do pé - deve ser utilizada. Uma instalação deve padronizar tanto a escolha do ouvido a ser marcado quanto o código a ser usado na outra orelha ou nos dedos dos dedos. Todos os códigos devem ser indicados no cartão da gaiola.
O uso de códigos de perfuração de ouvido permite um método rápido e simples de identificação, mas a técnica tem limitações. Códigos comumente usados têm um limite superior para números disponíveis para uso, geralmente um máximo de 100 a 399. Para ler os códigos do soco do ouvido, a maioria dos animais deve ser agarrada ao scruff. Os socos podem dobrar como amostras de tecido para genotipagem PCR, o que permite que a identificação animal e a amostragem de genótipos sejam realizadas simultaneamente. Isso resulta em menos estresse para os animais de manipulação repetida. 3
Há três estilos de socos na orelha: o soco da tesoura, o soco no polegar e o soco na alavanca. Embora todos sejam igualmente eficazes, há vantagens e desvantagens para cada um. Por exemplo, à medida que os ratos envelhecem, a pele de suas orelhas engrossa. É melhor executar os socos de ouvido em ratos jovens como eles são desmamados. Para ratos adultos que requerem identificação, deve-se considerar o uso de anestesia inalante. Ergonomicamente, o soco de nível é mais fácil de usar do que um soco no polegar, especialmente para as orelhas mais grossas de ratos mais velhos. No entanto, ambos os socos requerem um movimento de beliscar os dedos. O soco da tesoura tem a vantagem ergonômica de não exigir um movimento de beliscar, evitando assim a fadiga e a lesão do túnel do carpo. Em contraste, o ponche do polegar é vantajoso para a coleta de amostras de genotipagem, pois as pontas com o material tecidual caberão em um tubo Eppendorf. O estilo de uso do soco deve ser determinado pelos indivíduos que executam a tarefa e a idade dos ratos.
Para ratos, embora as etiquetas metálicas sejam mais usadas, estudos têm mostrado que há consequências para usá-los. Inflamações, alterações neoplásticas e até mesmo dor crônica têm sido observadas em animais que usam etiquetas de ouvido de metal há vários meses. 3,4,5,6 As etiquetas devem ser prontamente removidas da orelha se houver uma reação adversa, e a lesão subsequente deve ser examinada e tratada, se necessário, pela equipe veterinária.
Os cuidados adequados e a manutenção dos socos estenderão seu uso. Todos os tipos de socos vão embotar se autoclaved, por isso é recomendado limpá-los com um desinfetante e enxágüe-os com álcool. Em seguida, devem ser completamente secos para evitar enferrujar. Se os socos forem usados para PCR, eles devem ser encharcados por 3 minutos em uma solução que remove DNA residual ou RNA. Antes do uso, são enxaguados em álcool e limpos.
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Procedure
1. Identificação do soco de ouvido
Os códigos de perfuração de ouvido foram desenvolvidos como um método rápido e barato para rotular animais individuais. Há três estilos de socos na orelha: o soco da tesoura, o soco no polegar e o soco na alavanca. A orelha direita do animal é usada para dígitos únicos, a orelha esquerda para dezenas, e o meio das orelhas por centenas.
- Contenha o animal para que as orelhas sejam facilmente acessíveis. A maioria dos ratos são marcados para identificação individual no desmamar. Isso requer manuseio suave devido ao seu tamanho menor e mais frágil. Alguns ratos são menos propensos a lutar se os membros traseiros podem descansar em uma superfície, como um topo de gaiola ou um balcão.
- Determinar os socos de ouvido necessários para corresponder ao número experimental do animal ou identificá-lo dentro de uma gaiola.
- Os socos serão entalhes ou buracos, dependendo do código utilizado.
- O último número na etiqueta da orelha é frequentemente usado como identificador de socos de ouvido quando é o método secundário de identificação.
- Se os animais estão em um estudo de curto prazo em grupos de gaiolas estáveis, eles podem receber números sequenciais. Isso é muitas vezes feito quando não há tags de ouvido presentes.
- Faça o soco na orelha.
- Para fazer um entalhe, o soco é colocado na borda do pinna da orelha.
- Para fazer um orifício, coloque a orelha no soco para que o orifício do soco seja posicionado longe da margem pinna na posição desejada.
- Aplique pressão no polegar ou na alavanca ou feche o soco da tesoura rapidamente e firmemente para cortar a pele da orelha.
- Levante suavemente o soco da orelha ao usar o polegar ou os socos da alavanca. Abra o soco da tesoura para removê-lo da orelha.
- Evite puxar ou torcer o soco para evitar rasgar a orelha.
- Socos são maçante após o tempo. Se um soco não conseguir cortar a orelha, solte o soco e selecione um novo soco na orelha. Reposicione o novo soco no mesmo lugar.
- Limpe os socos após cada uso.
- Todos os tipos de socos vão entorpecer se autoclaved. Recomenda-se que sejam limpos com um desinfetante e enxaguados com álcool. Seque-os completamente para evitar enferrujar.
- Os socos de ouvido a serem usados para PCR são rotineiramente encharcados por 3 minutos em uma solução para remover DNA residual ou RNA. Antes do uso, são enxaguados em álcool e limpos.
Figura 1. Socos de orelha em ratos usando soco de tesoura.
2. Identificação de etiqueta de ouvido
As etiquetas de ouvido personalizadas podem ser encomendadas de fabricantes com códigos alfabéticos e/ou numéricos, o que permite a diferenciação de cepas de mouse ou investigadores. As etiquetas de ouvido podem ser feitas de metal ou plástico.
- Selecione as etiquetas de ouvido apropriadas para que os animais sejam identificados. Existem vários estilos de aplicadores disponíveis nos fabricantes de fones de ouvido. Certifique-se de encomendar o aplicador que é para o tamanho específico e estilo de etiquetas de ouvido que estão sendo usadas.
- Remova suavemente uma etiqueta do suporte de papelão e oriente-a no aplicador para que a extremidade com o orifício esteja posicionada sobre a área entalhada do aplicador. A extremidade pontuda da tag deve ser oposta ao entalhe.
- Contenha o animal para que as orelhas sejam facilmente acessíveis. Os animais podem ser menos propensos a lutar se os membros traseiros podem descansar sobre uma superfície, como um topo de gaiola ou um balcão.
- Posicione corretamente a etiqueta da orelha para colocação.
- Posicione o ponto da etiqueta de ouvido o mais profundamente possível na concha do ouvido, de modo que os números de etiquetas encoriçam a parte de trás do animal.
- Para ter os números da etiqueta de ouvido voltados para o nariz do animal, coloque o ponto da etiqueta na base do pinna na parte de trás da orelha.
- Aplique a etiqueta.
- Aperte firmemente o aplicador fechado. A etiqueta da orelha vai perfurar a orelha e travar juntas.
- Solte o aplicador, e a orelha marcada cairá do aplicador.
Figura 2. Um mouse com uma etiqueta de ouvido que está devidamente posicionado no pinna.
- Remova as etiquetas de ouvido de metal.
NOTA: Na ocasião, as etiquetas de ouvido metálicas podem causar irritação e inchaço da orelha. O inchaço e irritação muitas vezes leva a infecções do pinna. O tratamento deve incluir a remoção da etiqueta; no entanto, em casos de irritação grave ou infecção, o animal pode precisar ser anestesiado.- Remova os detritos ao redor da etiqueta com um aplicador de ponta de algodão umedecido com uma solução antisséptica.
- Corte na parte superior do loop de tag de borda a borda com cortadores de arame. Não corte a superfície plana, pois isso comprimirá a etiqueta, aperte a orelha e cause mais danos.
- Evite aplicar o torque durante o corte para evitar rasgar a orelha.
- Use hemostats para espalhar as extremidades cortadas da etiqueta da orelha separadas.
- Guie suavemente a etiqueta da orelha através e fora da orelha usando hemostats. Reduza o trauma evitando o alargamento do furo perfurante e deslizando a etiqueta para fora para que a extremidade amassada não passe pela orelha.
- Uma vez que a etiqueta se foi, limpe a orelha com uma vara aplicadora de algodão antisséptica.
- Se houver uma descarga purulenta da orelha, o acompanhamento pode ser necessário e recomenda-se consulta com a equipe veterinária para avaliação.
A identificação adequada de animais de laboratório é um requisito fundamental da pesquisa biomédica. É essencial que os pesquisadores possam distinguir entre animais individuais para que o animal correto seja utilizado para procedimentos experimentais e coleta de dados. Cientistas desenvolveram vários métodos permanentes e temporários para identificar animais de laboratório individuais. Aqui, vamos discutir os dois métodos mais usados: marcação de ouvido e socos nos ouvidos.
Antes de mergulhar no procedimento para perfuração de ouvido, vamos introduzir o código de soco do ouvido, os tipos de socos disponíveis, e discutir os benefícios e desvantagens deste método. Como você deve ter adivinhado, socos na orelha envolvem perfurar um buraco ou um entalhe na orelha externa ou pinna do animal. Para padronizar este método, foram desenvolvidos códigos universais de socos para fones de ouvido.
Dependendo da posição, os entalhes no ouvido direito representam dígitos únicos, como 1, 3 e 5, e um entalhe duplo representa 2. Usando diferentes combinações desses entalhes, e somando o valor para cada entalhe, você pode rotular o animal de 1 a 9. Da mesma forma, na orelha esquerda, os mesmos entalhes representam as dezenas. E novamente, diferentes combinações cobrirão o alcance de 10 a 90. Buracos no centro do pinna direito e esquerdo representam 100 e 200, respectivamente. E buracos em ambos indicam 300. Portanto, por exemplo, se você quiser rotular o animal 173, você deve fazer um buraco no centro da orelha direita por 100, três entalhes no ano esquerdo somando o total de 70, e um único entalhe no ouvido superior direito representando o lugar da unidade "três".
Agora, vamos discutir os três estilos de socos de ouvido disponíveis comercialmente: o soco da tesoura, o soco no polegar e o soco na alavanca. Cada uma delas tem suas vantagens e desvantagens.
O soco do polegar requer um movimento de beliscar, mas é pequeno o suficiente para caber em um tubo Eppendorf para que o tecido auditivo possa ser mais facilmente coletado. Ergonomicamente, o soco da alavanca é mais fácil de usar do que o soco do polegar, especialmente para as orelhas mais grossas dos ratos mais velhos. O soco da tesoura não requer um movimento de beliscar, evitando assim a fadiga e a lesão do túnel do carpo.
Apesar de ser um método rápido e simples de identificação, o soco no ouvido tem algumas limitações. Primeiro, o código de perfuração de ouvido discutido acima tem um limite superior de 399, o que pode limitar o uso deste método em alguns estudos em larga escala. Outra limitação é que a maioria dos animais deve ser agarrada ao scruff para ler o código, aumentando assim os tempos em que são manuseados. À medida que os ratos envelhecem, a pele de suas orelhas engrossa e é difícil realizar socos no ouvido sem causar sofrimento significativo ao animal. Portanto, é melhor executar os socos de ouvido em ratos jovens como eles são desmamados. Para ratos adultos que requerem identificação, o uso de anestesia inalante deve ser considerado na realização de socos de ouvido.
Agora que você tem algumas informações de fundo sobre o código de perfuração do ouvido e os tipos de ferramentas disponíveis, vamos aprender como executar essa técnica em ratos.
Antes de iniciar o procedimento, recomenda-se que as ferramentas de perfuração sejam limpas com uma solução desinfetante, enxaguadas com álcool e secas completamente. Evite autoclavar os socos de ouvido, pois acabará entorpecendo-os.
Para começar, decida o código experimental do animal e o soco a ser usado. Vamos usar o código 173 e o soco da tesoura como exemplos aqui. O mesmo procedimento é aplicável a qualquer outro código ou soco. Quando estiver pronto, contenha o animal agarrando-o no scruff para que as orelhas sejam facilmente acessíveis. Comece com o buraco por 100. Coloque a orelha direita no soco para que o orifício do soco seja posicionado longe da margem pinna. Em seguida, aplique pressão para fechar a tesoura rapidamente e firmemente para cortar a pele. Em seguida, solte o soco e remova-o da orelha. Evite puxar ou torcer o soco para evitar rasgar a orelha. Para fazer um entalhe, coloque o soco na borda da orelha pina no ponto correto, neste caso na parte superior da orelha direita para os "três" no lugar da unidade do código, e faça o mesmo - aplique pressão rápida e firme e, em seguida, abra a tesoura para removê-lo. Repita o mesmo procedimento na outra orelha para socar três entalhes - dois para "20" perto do canto externo e um para "50" perto do canto interno, totalizando o código para "70".
Confirme que o código correto foi perfurado antes de adicionar o animal de volta à gaiola. Novamente, limpe o soco com um desinfetante, enxágue com álcool e seque-o completamente para evitar enferrujar.
Agora, vamos passar para a marcação de ouvido, que é outro método barato e fácil de executar para a identificação individual de ratos e ratos. Há uma variedade de etiquetas de ouvido disponíveis comercialmente. Estes incluem: etiquetas metálicas que têm uma série de números e/ou letras gravadas neles, e etiquetas de plástico com caracteres ou códigos de barras em fundos coloridos.
Uma desvantagem das etiquetas metálicas é que muitas vezes é necessário pegar o animal para ler o código. Em contraste, etiquetas plásticas são fáceis de ler sem ter que lidar com os animais. Outra vantagem para as etiquetas plásticas é sua compatibilidade com a ressonância magnética. Embora as tags forneçam um identificador individual para um mouse ou rato, elas não são infalíveis. As etiquetas podem ser perdidas devido ao excesso de aliciamento, dermatite ou infecção, auto-trauma infligido tentando remover etiquetas devido à intolerância, combate e comportamento agressivo de reprodução. Se vários animais estão alojados na mesma gaiola, a perda de uma etiqueta de ouvido pode ser problemática. Para contornar esse problema, uma forma secundária de identificação, como um código de perfuração no ouvido oposto da tag, deve ser utilizada. Uma instalação deve padronizar tanto a escolha do ouvido a ser marcado quanto o código a ser usado na outra orelha, e todos os códigos devem ser indicados no cartão da gaiola.
Agora vamos aprender como aplicar corretamente uma etiqueta de ouvido, pois o posicionamento incorreto pode ter várias consequências infelizes. Após a aplicação, também discutiremos a remoção da tag ear, que geralmente é realizada em caso de infecção devido à aplicação da tag.
O primeiro passo é selecionar uma etiqueta apropriada para que os animais sejam identificados. Aqui, usaremos uma etiqueta de metal para demonstrar o procedimento em camundongos. Certifique-se de encomendar o aplicador apropriado para o tamanho e estilo específicos das etiquetas de ouvido que estão sendo usadas. Remova suavemente a etiqueta do suporte de papelão e oriente-a no aplicador para que a extremidade com o orifício esteja posicionada sobre a área entalhada do aplicador. A extremidade pontuda da tag deve ser oposta ao entalhe.
Quando estiver pronto para aplicar a etiqueta da orelha, contenha o animal para que as orelhas sejam facilmente acessíveis. Os animais podem ser menos propensos a lutar se os membros traseiros podem descansar em uma superfície como o topo da gaiola ou um balcão. Uma vez que o animal é contido, posicione o ponto da etiqueta da orelha profundamente na concha da orelha para que os números de etiquetas enfrentem a parte de trás do animal. Em seguida, aperte firmemente o aplicador fechado; a etiqueta da orelha vai perfurar a orelha e travar juntos. Quando você soltar, a orelha marcada cairá do aplicador. Confirme se a tag foi devidamente posicionada e aplicada. Se preferir ter os números da etiqueta de ouvido voltados para o nariz do animal, coloque o ponto da etiqueta na base do pinna na parte de trás da orelha e, em seguida, aperte para travar a etiqueta no lugar.
As etiquetas devem ser colocadas de forma que não causem uma curva no ouvido, interfiram na mobilidade do animal ou peguem em qualquer parte do caging. Se a etiqueta for colocada muito perto da borda da orelha, ela pode ser facilmente rasgada. Se posicionada muito perto da cabeça, a pele da área do pescoço pode pegar na etiqueta, criando irritação, dor e movimento restrito, o que pode levar ao auto-trauma. Ocasionalmente, etiquetas metálicas podem causar irritação e inchaço da orelha. Isso muitas vezes leva a infecções do pinna, e o tratamento imediato deve incluir a remoção da etiqueta.
Para remover a etiqueta, umedeça um aplicador com ponta de algodão com uma solução antisséptica e use-a para remover quaisquer detritos ao redor da etiqueta. Em casos graves de infecção, o animal pode precisar ser anestesiado. Em seguida, usando cortadores de arame, corte através da parte superior do laço de tag de borda em borda. É importante ressaltar que não corte a superfície plana, pois isso comprimirá a etiqueta, aperte a orelha e cause danos à orelha. Usando hemostats, guie suavemente a tag da orelha através e fora da orelha. Deslize a etiqueta para que a extremidade amassada não passe por causar trauma e alargamento do orifício perfurante. Uma vez que a etiqueta se foi, limpe a orelha com uma vara antisséptica de algodão-aplicador, e devolva o animal para sua gaiola. Se houver uma descarga purulenta da orelha, o acompanhamento pode ser necessário e recomenda-se consulta com a equipe veterinária para avaliação.
Agora que você sabe como marcar os animais de laboratório usando etiquetas de ouvido e socos, vamos rever alguns experimentos em que esses métodos podem ser úteis. Uma grande vantagem do uso do código de perfuração de ouvido é que os socos podem dobrar como amostras de tecido para genotipagem, reduzindo assim o estresse aos animais causado devido ao manuseio repetido. No entanto, se você planeja usar os socos para coletar amostras de PCR, lembre-se primeiro de molhar o aparelho em uma solução descontaminante superficial por pelo menos 3 minutos para remover DNA residual ou RNA, e depois enxaguar com álcool antes do uso.
A importância da técnica de identificação aumenta ainda mais se o experimento durar vários dias. Por exemplo, neste experimento, os cientistas primeiro rotularam os animais usando uma etiqueta metálica e, em seguida, injetaram o nervo ciático com uma suspensão de células tumorais transgênicas expressando proteína luciferase. Em seguida, a fim de quantificar a progressão do câncer, eles imaginaram os animais usando bioluminescência em um, dez e dezoito dias após a injeção.
Você acabou de assistir a apresentação do JoVE demonstrando os dois métodos comumente usados de identificação em roedores: etiquetas de ouvido e socos de ouvido. Agora você deve entender o código do soco auditivo, conhecer os diferentes tipos de etiquetas de orelha de roedores disponíveis comercialmente, e deve ser capaz de realizar esses procedimentos com precisão sem causar desconforto animal significativo.
Lembre-se, cada técnica tem suas vantagens e desvantagens, que devem ser consideradas em relação às suas necessidades experimentais. Além de considerar o custo, a facilidade da técnica e o nível de dor para os animais devem ser algumas das principais considerações na escolha do método de identificação adequado. Como sempre, obrigado por assistir!
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Applications and Summary
Ao escolher o método de identificação adequado, muitos fatores devem ser deliberados. Cada técnica tem vantagens e desvantagens que devem ser consideradas em relação às necessidades experimentais. Embora os custos devem ser ponderados juntamente com outros fatores, a facilidade da técnica e o nível de desconforto para os animais devem ser as principais considerações. 3,4
O soco/entalhe de ouvido é comumente usado em ratos e ratos porque há pouco custo, e o procedimento é facilmente feito. Há um número limitado de códigos que podem ser usados, com a maioria dos códigos tendo um limite superior de 100 a 399. Para ler os códigos do soco do ouvido, a maioria dos animais deve ser agarrada ao scruff. No entanto, os socos podem dobrar como amostras de tecido para genotipagem PCR, o que permite que a identificação e amostragem de genótipos sejam realizadas simultaneamente, resultando em menos estresse para os animais devido ao manuseio repetido. 5
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