Detecção de Bacteriófagos em Amostras Ambientais

Detection of Bacteriophages in Environmental Samples

JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Environmental Microbiology

Detection of Bacteriophages in Environmental Samples

40,764 Views

•

09:17 min

•

February 23, 2015

Overview

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba – Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Alex Wassimi

Os vírus são um grupo único de entidades biológicas que infectam organismos eucarióticos e procarióticos. São parasitas obrigatórios que não têm capacidade metabólica, e para se replicarem, dependem do metabolismo hospedeiro para produzir partes virais que se auto-montam dentro das células hospedeiras.

Os vírus são ultramicroscópicos — pequenos demais para serem vistos com o microscópio de luz, visível apenas com a maior resolução do microscópio eletrônico. Uma partícula viral consiste em um genoma ácido nucleico, seja DNA ou RNA, cercado por uma camada de proteína, conhecida como capsid, composta de subunidades proteicas ou capsomers. Em alguns vírus mais complexos, o capsídeo é cercado por um envelope lipídedo adicional, e alguns têm apêndices de superfície ou caudas.

Vírus que infectam o trato intestinal de humanos e animais são conhecidos como vírus entéricos. Eles são excretados em fezes e podem ser isolados de águas residuais domésticas. Os vírus que infectam bactérias são conhecidos como bacteriófagos, e aqueles que infectam bactérias coliformes são chamados de colifagos (Figura 1). Os phages de bactérias coliformes são encontrados em qualquer lugar que as bactérias coliformes são encontradas.

Figura 1. Coliphage T2.

Principles

Bacteriófagos são estudados em ciências ambientais por serem um componente crítico dos sistemas biológicos. Eles são a entidade biológica mais abundante do mundo e são importantes porque ajudam a controlar populações bacterianas, processos alimentares, ciclos biogeoquímicos, bem como melhorar a diversidade procariótica através da transferência horizontal de genes. Há também evidências de que os phages são indicadores substitutos confiáveis para vírus entéricos causadores de doenças que também são transmitidos fecalmente, mas difíceis de avaliar. A disponibilidade de métodos relativamente rápidos e baratos para enumerar bacteriófagos torna-os uma ferramenta atraente para a avaliação da contaminação fecal em amostras ambientais.

Colifagos na água são avaliados pela adição de uma amostra para ágar macio ou sobreposto, juntamente com uma cultura de E. coli na fase de tronco do crescimento. O phage se liga à célula bacteriana e lise as bactérias. As bactérias produzem um gramado confluente de crescimento, exceto para áreas onde a praga cresceu e liseu as bactérias. Essas áreas claras resultantes são conhecidas como placas. Uma sobreposição de ágar macio é usada para restringir a difusão física dos vírus para que, ao sair de uma bactéria, eles só possam se espalhar para células bacterianas vizinhas.

Para obter a formação ideal da placa é importante que a bactéria hospedeira esteja em fase de registro de crescimento. Isso garante que toda a praga se conecte a bactérias vivas e produza progênere. Isso exige que uma cultura de bactérias hospedeiras seja preparada a cada dia que um ensaio seja realizado. Normalmente, uma cultura é incubada um dia antes do ensaio para que ela esteja na fase estacionária. No dia do ensaio, a cultura é usada para inocular um caldo, que é incubado para obter bactérias hospedeiras suficientes na fase de tronco para o ensaio (isso geralmente requer 2-3h de incubação em um banho de água tremendo a 35-37 °C).

Procedure

Obtenha uma amostra de esgoto ou água contendo colifago.
Diluir a amostra 1:10 e 1:100 usando tampão Tris. Faça isso transferindo 1,0 mL de cultura para 9 mL de buffer Tris, e depois fazendo uma segunda diluição de 10 vezes.
Derreta três tubos de ágar macio (0,7% de ágar nutriente ou ágar de soja de tripática por tubo de 3 mL) colocando-os em um banho de vapor ou autoclave.
Coloque o ágar em um banho de água a 45-48 °C por 15 minutos para permitir que a temperatura do ágar se ajuste a 45 °C.
Ao primeiro tubo, adicione 1 mL de uma cultura de caldo de fase de tronco de E. coli¹ e 1 mL de amostra não diluída.
Retire o tubo do banho de água e balance suavemente entre as mãos para misturar a suspensão por 2-3 s.
Limpe a água do tubo com uma toalha de papel e despeje o ágar sobre uma placa de Petri previamente preparada contendo ágar inferior (ágar de nutrientes regular ou ágar de soja de tripática).
Gire rapidamente a placa para espalhar o ágar superior. Certifique-se de que o ágar cubra toda a superfície.
Repita as etapas 5-8 com os outros dois tubos de ágar macio, utilizando 1 mL de bactérias e 1 mL de cada diluição amostral(Figura 2).
Depois que o ágar se solidificar, inverta as placas de Petri e incubar a 37 °C por 48 h. Tire qualquer umidade da tampa da placa de Petri. Se uma gota de umidade cair sobre uma placa, fará com que o vírus se espalhe pela superfície do ágar.
Após a incubação, conte o número de placas em cada diluição(Figura 3) e calcule a concentração de phage na amostra original. Regisso regissário de diferenças no tamanho ou aparência das placas.

Figura 2. Procedimento para a preparação de um gramado bacteriano utilizando ágar superior para enumeração colifa.

Figura 3. Placas de phage em um gramado bacteriano.

¹E. coli strain ATCC 15597 geralmente produzirá o maior número de placas a partir de amostras de esgoto. Deve ser cultivado durante a noite em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja de trippticase e incubado em condições de agitação a 35 °C. 3 h antes do ensaio de phage inocular um mL desta cultura em um frasco fresco contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja tripática e colocar em um banho de água tremendo a 35-37 °C. Isso garantirá que as bactérias estejam na fase de registro do crescimento.

Os vírus são partículas biológicas infecciosas que são responsáveis por muitas doenças, resfriado e gripe, para hepatite e HIV.

Vírus são partículas biológicas que consistem em um DNA ou genoma de RNA, envoltos dentro de uma camada de proteína conhecida como capsídeo, às vezes com um envelope lipídico adicional. Os vírus não têm capacidade metabólica ou reprodutiva por conta própria, e devem invadir células vivas e sequestrar suas máquinas celulares para fazer mais cópias de si mesmos.

Ambas as células procarióticas, como bactérias, e células eucarióticas, como as de humanos, podem ser infectadas por classes específicas de vírus. Especificamente, bacteriófagos são vírus que infectam bactérias. Por exemplo, colifagos são aqueles que infectam e. coli, uma bactéria intestinal comum, algumas cepas das quais podem causar intoxicação alimentar, e que é uma indicação de contaminação fecal do abastecimento de água.

Embora os phages em si não sejam geralmente conhecidos por serem patogênicos em humanos, há evidências de que eles são indicadores de substituto confiáveis para enterovírus causadores de doenças que também são transmitidos fecalmente, mas difíceis de avaliar. A disponibilidade de métodos relativamente rápidos e baratos para enumerar bacteriófagos torna-os uma ferramenta atraente para a avaliação da contaminação fecal em amostras ambientais.

Este vídeo introduzirá os princípios por trás da enumeração da phage; demonstrar um protocolo para quantificar phages, conhecido como ensaio de placa; e, finalmente, explorar várias aplicações de ciência ambiental para a detecção e contagem de phages e outros vírus.

Bacteriófagos, como todos os vírus, devem parasitar células vivas, neste caso bactérias, a fim de se reproduzirem.

Phages fazem isso pousando e anexando à superfície celular bacteriana e injetando seus materiais genéticos na célula. Uma vez dentro da célula, o genoma viral é replicado e os componentes proteicos do capsídeo viral são produzidos, ambos usando a máquina bioquímica da célula hospedeira. Uma vez que as partículas de praga são montadas, elas são liberadas das bactérias, muitas vezes lisendo o hospedeiro e estourando, matando a célula hospedeira no processo.

Um método amplamente utilizado para determinar a concentração de phage em uma amostra aproveita essa atividade lítica. Nesta técnica, o phage da amostra é misturado com bactérias e ágar macio. Esta mistura é derramada em pratos petri com ágar regular como um substrato, e a camada superior forma uma sobreposição.

As bactérias estão em uma concentração tão alta que formam um gramado contínuo. As bactérias devem ser obtidas a partir da cultura que está na fase de registro do crescimento, para garantir que cada bactéria que os phages infectam esteja viva e permita que o phage produza prole.

Quando uma partícula de phage infecta e lise uma bactéria, a prole phage se espalhará para células bacterianas próximas e continuará a infecção. O ágar macio restringe a difusão das partículas de praga. Eventualmente, uma área de desmatamento, conhecida como placa, será formada.

Se a praga for diluída a uma concentração baixa o suficiente, então discretas, placas individuais podem ser observadas no gramado bacteriano. Estes podem ser contados e usados para calcular o número de unidades formadoras de placas, ou PFUs, de phage por mL da amostra original.

Agora que você entende como as pragas infectam bactérias e como essa atividade pode ser usada para medir a concentração de phage, vamos passar por um protocolo para usar um ensaio de placa para enumerar phages em amostras de água ambiental.

Um dia antes de realizar o ensaio, inocular uma colônia de E. coli escoar ATCC 15597 em 100 mL de caldo de soja de tripca em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL. Incuba-o com agitação a 35 °C durante a noite.

3 h antes do ensaio, inocular 1 mL da cultura E. coli durante a noite em um fresco 100 mL de caldo. Coloque esta nova cultura em um banho de água tremendo a uma temperatura entre 35 e 37 °C. Isso garante que as bactérias estejam na fase de registro do crescimento quando o ensaio começar.

Para iniciar o ensaio da placa, faça diluições seriais de 10 e 100 vezes da amostra de água, usando 9 mL de tampão Tris.

Usando um banho de vapor, derreta três tubos de 5 mL de 0,7% de ágar superior macio, ou soja de trippticase ou ágar nutriente. Uma vez derretido, coloque em um banho de água a 45 a 48 °C por pelo menos 15 minutos para que a temperatura do ágar caia para 45 °C.

Ao primeiro tubo de ágar macio, adicione 1 mL da cultura E. coli de fase de tronco previamente preparada e 1 mL da amostra de água não diluída. Retire o tubo do banho de água e balance suavemente entre as mãos por 2-3 s para misturar a suspensão.

Despeje o ágar macio sobre uma placa de Petri previamente preparada com soja de trippticase ou ágar nutriente. Gire rapidamente a placa para se espalhar, certificando-se de que ela cobre toda a superfície.

Repita a inoculação e o revestimento para os outros dois tubos, utilizando 1 mL de cada uma das amostras diluídas.

Uma vez que o ágar superior tenha solidificado, inverta os pratos e incuba-os a 37 °C por 48 h.

Após a incubação, conte o número de pragas em cada prato. A partir da contagem, calcule a concentração de phage na amostra original

Por exemplo, se 9 placas foram obtidas da placa de diluição de 10 vezes, então há 9 vezes 10 divididas por 1 mL, ou 90 PFUs/mL de colifago na amostra de água original.

Agora que você viu como os ensaios da placa de phage são realizados, vamos ver como os ensaios de placa podem ser usados para enumerar phage e outros tipos de vírus de uma variedade de fontes.

Métodos baseados em ensaios de placa podem ser usados para isolar bacteriófago de diferentes amostras ambientais, como o solo. Neste exemplo, os pesquisadores primeiro coletaram phage do solo por filtragem. A praga foi então usada para infectar a bactéria do solo comum Arthrobacter em um ensaio de placa. Phages foram colhidos a partir de placas individuais e listrados em novas placas de ágar, e depois sobrepostos com ágar superior contendo bactérias. A concentração de fáragem diminui ao longo do comprimento da raia, de modo que placas discretas, provavelmente formadas por um único tipo de phage, possam ser obtidas. Essas placas individuais poderiam então ser escolhidas para analisar melhor os phages dentro.

Além dos bacteriófagos, ensaios de placas também podem ser realizados com outros vírus, incluindo aqueles, como a gripe, que infectam mamíferos. Para isso, as células de mamíferos são cultivadas pela primeira vez como monocamadas em pratos de cultura tecidual. As mídias que contêm os vírus são então adicionadas às células para permitir que a infecção ocorra, antes que as células sejam sobrepostas com um meio imobilizador, como a agarose semelhante ao gel. Após um período de incubação que pode durar até duas semanas, as células infectadas são fixas e manchadas para permitir que as placas sejam visualizadas e contadas.

Finalmente, além das amostras coletadas do ambiente, os ensaios de placas são úteis para detectar e enumerar vírus em amostras de tecidos de indivíduos infectados. Aqui, os pesquisadores obtiveram e homogeneizaram tecidos pulmonares de camundongos infectados com herpesvírus gama. Este homogenate contendo vírus foi então usado para infectar a cultura celular dos mamíferos. O número de placas poderia então ser contado para fornecer uma estimativa para o título viral nos tecidos pulmonares infectados.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre a detecção de bacteriófagos em amostras ambientais. Agora você deve entender a biologia básica dos phages, como realizar um ensaio de placa para quantitar phages em uma amostra ambiental, e como ensaios de placa podem ser usados para estudar phages e outros vírus em amostras ambientais ou clínicas. Como sempre, obrigado por assistir!

Results

Diluição da amostra de esgoto = 10^-1

Número de placas obtidas = 9

Portanto, concentração de phage na amostra de esgoto
= 10 x 9 ÷ 1 mL
= 90 unidades formadoras de placas / mL

O esgoto bruto normalmente contém 10³ – 10⁴ colifagos por mL, com um intervalo de 10² – 10⁸ por mL.

Applications and Summary

Existem muitas aplicações potenciais de colifagos como indicadores ambientais. Estes incluem seu uso como indicadores de contaminação de esgoto, eficiência do tratamento de água e esgoto, e sobrevivência de vírus e bactérias entéricas no meio ambiente. O uso de bacteriófagos como indicadores da presença e comportamento de bactérias entéricas e vírus animais sempre foi atrativo devido à facilidade de detecção e baixo custo associado aos ensaios de phage. Além disso, podem ser quantificados em amostras ambientais dentro de 24h em comparação com dias ou semanas para vírus entéricos.

¹E. coli strain ATCC 15597 geralmente produzirá o maior número de placas a partir de amostras de esgoto. Deve ser cultivado durante a noite em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja de trippticase e incubado em condições de agitação a 35 °C. 3 h antes do ensaio de phage inocular um mL desta cultura em um frasco fresco contendo 100 mL de nutrientes ou caldo de soja tripática e colocar em um banho de água tremendo a 35-37 °C. Isso garantirá que as bactérias estejam na fase de registro do crescimento.

Transcript

Viruses are infectious biological particles that are responsible for many diseases, cold and flu, to hepatitis and HIV.

Viruses are biological particles consisting of either a DNA or RNA genome, wrapped inside a protein coat known as a capsid, sometimes with an additional lipid envelope. Viruses have no metabolic or reproductive ability on their own, and must invade living cells and hijack their cellular machinery in order to make more copies of themselves.

Both prokaryotic cells, such as bacteria, and eukaryotic cells, such as those of humans, can be infected by specific classes of viruses. Specifically, bacteriophages are viruses that infect bacteria. For example, coliphages are those phages that infect E. coli, a common gut bacterium, some strains of which can cause food poisoning, and which is an indication of fecal contamination of the water supply.

While phages themselves are not generally known to be pathogenic in humans, there is evidence that they are reliable surrogate indicators for disease-causing enteroviruses that are also fecally-transmitted but difficult to assay. The availability of relatively quick and inexpensive methods to enumerate bacteriophages makes them an attractive tool for the assessment of fecal contamination in environmental samples.

This video will introduce the principles behind phage enumeration; demonstrate a protocol for quantifying phages, known as the plaque assay; and finally, explore several environmental science applications for the detection and counting of phages and other viruses.

Bacteriophages, like all viruses, must parasitize living cells, in this case bacteria, in order to reproduce.

Phages do so by landing and attaching to the bacterial cell surface and injecting their genetic materials into the cell. Once inside the cell, the viral genome is replicated and the protein components of the viral capsid are produced, both using the host cell’s biochemical machinery. Once the phage particles are assembled, they are released from the bacteria, often by lysing the host and bursting out, killing the host cell in the process.

A widely used method for determining phage concentration in a sample takes advantage of this lytic activity. In this technique, the phage from the sample is mixed with bacteria and soft agar. This mixture is poured onto Petri dishes with regular agar as a substrate, and the top layer forms an overlay.

The bacteria are at such a high concentration that they form a continuous lawn. The bacteria should be obtained from culture that is in the log phase of growth, to ensure that every bacterium that the phages infect is alive and allows the phage to produce progeny.

When a phage particle infects and lyses a bacterium, the phage progeny will spread to nearby bacterial cells and continue the infection. The soft agar restricts the diffusion of the phage particles. Eventually, an area of clearing, known as a plaque, will be formed.

If the phage is diluted to a low enough concentration, then discrete, individual plaques can be observed on the bacterial lawn. These can be counted and used to calculate the number of plaque-forming units, or PFUs, of phage per mL of the original sample.

Now that you understand how phages infect bacteria and how this activity can be used to measure phage concentration, let’s go through a protocol for using a plaque assay to enumerate phages in environmental water samples.

One day before performing the assay, inoculate a colony of E. coli strain ATCC 15597 into 100 mL of trypticase soy broth in a 250-mL Erlenmeyer flask. Incubate it with shaking at 35 °C overnight.

3 h before the assay, inoculate 1 mL of the overnight E. coli culture into a fresh 100 mL of broth. Place this new culture into a shaking water bath at a temperature between 35 and 37 °C. This ensures that the bacteria are in the log phase of growth when the assay begins.

To start the plaque assay, make 10- and 100-fold serial dilutions of the water sample, using 9 mL of Tris buffer.

Using a steam bath, melt three 5-mL tubes of 0.7% soft top agar, either trypticase soy or nutrient agar. Once melted, place in a water bath at 45 to 48 °C for at least 15 min for the agar’s temperature to drop to 45 °C.

To the first tube of soft agar, add 1 mL of the previously prepared log-phase E. coli culture and 1 mL of the undiluted water sample. Remove the tube from the water bath and gently rock between your hands for 2-3 s to mix the suspension.

Pour the soft agar over a previously prepared Petri dish with trypticase soy or nutrient agar. Quickly rotate the plate to spread, making sure that it covers the entire surface.

Repeat the inoculation and plating for the other two tubes, using 1 mL of each of the diluted samples.

Once the top agar has solidified, invert the dishes and incubate them at 37 °C for 48 h.

After the incubation, count the number of plagues on each plate. From the count, calculate the phage concentration in the original sample

For example, if 9 plaques were obtained from the 10-fold dilution plate, then there are 9 times 10 divided by 1 mL, or 90 PFUs/mL of coliphage in the original water sample.

Now that you have seen how phage plaque assays are performed, let’s look at how plaque assays can be used to enumerate phage and other types of viruses from a variety of sources.

Plaque assay-based methods can be used to isolate bacteriophage from different environmental samples such as soil. In this example, researchers first collected phage from soil by filtration. The phage was then used to infect the common soil bacteria Arthrobacter in a plaque assay. Phages were picked from individual plaques and streaked onto new agar plates, and then overlaid with bacteria-containing top agar. Phage concentration decreases along the length of the streak, so that discrete plaques, likely formed by a single type of phage, might be obtained. These individual plaques could then be picked to further analyze the phages within.

In addition to bacteriophages, plaque assays can also be performed with other viruses, including those, such as influenza, that infect mammals. To do this, mammalian cells are first grown up as monolayers in tissue culture dishes. Media containing the viruses are then added to the cells to allow infection to occur, before the cells are overlaid with an immobilizing medium such as the gel-like agarose. After an incubation period that could last up to two weeks, the infected cells are fixed and stained to allow the plaques to be visualized and counted.

Finally, in addition to samples collected from the environment, plaque assays are useful for detecting and enumerating viruses in tissue samples from infected individuals. Here, researchers obtained and homogenized lung tissues from mice infected with gamma-herpesviruses. This virus-containing homogenate was then used to infect mammalian cell culture. The number of plaques could then be counted to provide an estimate for the viral titer in the infected lung tissues.

You have just watched JoVE’s video on the detection of bacteriophages in environmental samples. You should now understand the basic biology of phages, how to perform a plaque assay to quantitate phages in an environmental sample, and how plaque assays can be used to study phages and other viruses in environmental or clinical samples. As always, thanks for watching!