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Metodo delle aggiunte standard

Overview

Fonte: Laboratorio del Dr. Paul Bower - Purdue University

Il metodo delle aggiunte standard è un metodo di analisi quantitativa, che viene spesso utilizzato quando il campione di interesse ha più componenti che si traducono in effetti matriciali, in cui i componenti aggiuntivi possono ridurre o migliorare il segnale di assorbanza dell'analita. Ciò si traduce in errori significativi nei risultati dell'analisi.

Le aggiunte standard sono comunemente usate per eliminare gli effetti della matrice da una misurazione, poiché si presume che la matrice influenzi tutte le soluzioni allo stesso modo. Inoltre, viene utilizzato per correggere le separazioni di fase chimiche eseguite nel processo di estrazione.

Il metodo viene eseguito leggendo l'intensità sperimentale (in questo caso fluorescente) della soluzione sconosciuta e quindi misurando l'intensità dell'ignoto con quantità variabili di standard noto aggiunto. I dati sono tracciati come intensità di fluorescenza rispetto a. la quantità dello standard aggiunto (l'ignoto stesso, senza standard aggiunto, è tracciato SULL'asse y). La linea dei minimi quadrati interseca l'asse x al negativo della concentrazione dell'ignoto, come mostrato in Figura 1.

Figure 1
Figura 1. Rappresentazione grafica del metodo di aggiunta standard.

Principles

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In questo esperimento, il metodo delle aggiunte standard è dimostrato come strumento analitico. Il metodo è una procedura per l'analisi quantitativa di una specie senza la generazione di una tipica curva di calibrazione. L'analisi di addizione standard viene eseguita misurando l'intensità spettroscopica prima e dopo l'aggiunta di aliquote precise di una soluzione standard nota dell'analita.

Questo esperimento studia le specie non fluorescenti facendole reagire in modo tale da formare un complesso fluorescente. Questo approccio è comunemente usato nello studio degli ioni metallici. Gli ioni di alluminio (Al3+) saranno determinati formando un complesso con 8-idrossichinolina (8HQ). L'Al3+ viene precipitato di 8HQ da soluzione acquosa e quindi viene estratto in cloroformio; la fluorescenza della soluzione di cloroformio viene misurata e correlata alla concentrazione della soluzione originale di Al3+. Per questo esperimento è prevista una sensibilità nell'intervallo parte per milione (ppm o μg/mL).

La reazione è

Reaction

La quantità di alluminio in ciascun campione durante questo esperimento è calcolata come segue:

Vuoto 0
Sconosciuto + 0 mL Standard VSconosciuto(CSconosciuto)= 25 mL(CSconosciuto)
Sconosciuto + 1 mL Standard VSconosciuto(CSconosciuto)+ VStandard(CStandard) = 25 mL(CSconosciuto)+ 1 mL(1 μg/mL)
Sconosciuto + 2 mL Standard VSconosciuto(CSconosciuto)+VStandard(CStandard) =25 mL(CSconosciuto)+2 mL(1 μg/mL)
Sconosciuto + 3 mL Standard VSconosciuto(CSconosciuto)+VStandard(CStandard) =25 mL(CSconosciuto)+3 mL(1 μg/mL)
Sconosciuto + 4 mL Standard VSconosciuto(CSconosciuto)+VStandard(CStandard) =25 mL(CSconosciuto)+4 mL(1 μg/mL)

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Procedure

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1. Preparazione dei reagenti

  1. Soluzione standard Al3+ da 100 ppm: sciogliere 0,9151 g di nitrato di alluminio (Al(NO3)3•9H 2O) in un matraccio volumetrico da 1-L con acqua DI.
  2. Soluzione 8HQ in acido acetico 1 M (2% wt/vol): aggiungere 2,0 g di 8-idrossichinolina in un matraccio volumetrico da 100 mL.
  3. Aggiungere con cautela 5,74 mL di acido acetico glaciale al matraccio da 100 mL, quindi diluire fino al segno con acqua DI. Ciò consente all'8-idrossichinolina di dissolversi in fase acquosa.
  4. Tampone 1 M NH4+/NH3 (pH~8): aggiungere 20 g di acetato di ammonio (NH4OAc) a un flacone da 100 mL.
  5. Aggiungere 7 mL di idrossido di ammonio al 30% a questa bottiglia da 100 mL e diluire fino al segno con acqua DI. Questo aiuta a neutralizzare l'acido nella soluzione 8HQ quando combinato.
  6. Altri reagenti includono solfato disodioanidro (Na 2 SO4) e cloroformio (grado spec).

2. Preparazione dei campioni

  1. Preparare una soluzione Standard Al3+ da 1,00 ppm aggiungendo 1,0 mL della soluzione Al3+ da 100 ppm con una pipetta a un matraccio tarare da 100 ml.
  2. Posizionare sei imbuti di separazione da 125 ml sugli anelli che si trovano su un grande supporto ad anello situato nel cofano. Dovrebbero essere etichettati come segue: BL, 0, 1, 2, 3, 4. Assicurarsi che tutti gli oggetti di vetro siano scrupolosamente puliti, in quanto è difficile ottenere risultati quantitativi se piccole perle di cloroformio si attaccano alle pareti della vetreria.
  3. Aggiungere 25,00 ml della soluzione sconosciuta di Al3+ ai cinque imbuti separatori etichettati 0, 1, 2, 3 e 4. In questo esempio, la concentrazione sconosciuta è 0,110 ppm.
  4. Aggiungere 0, 1,00, 2,00, 3,00 e 4,00 ml della soluzione standard Al3+ da 1,00 ppm, rispettivamente, ai 5 imbuti con una pipetta da 1 mL.
  5. Preparare un BLANK aggiungendo 25,00 ml di acqua distillata all'imbuto separatore etichettato BL.
  6. Aggiungere 1,0 ml della soluzione di 8-idrossichinolina con una pipetta a ciascuna delle sei soluzioni.
  7. Aggiungere 3,0 ml di soluzione tampone con una pipetta a ciascuna delle sei soluzioni.
  8. Estrarre ogni soluzione due volte con 10 ml di cloroformio, agitando vigorosamente per 1 minuto ogni volta. Ricordarsi di sfogare occasionalmente l'imbuto separatore per rilasciare l'accumulo di pressione. (NOTA: Una buona estrazione avviene solo quando c'è molto contatto liquido-liquido tra le fasi).
  9. Raccogliere il cloroformio in un becher pulito e asciutto da 100 ml etichettato. Il cloroformio ha una densità vicina a 1,5 g / cm3, quindi è lo strato inferiore. Non dovrebbe esserci traccia di colore giallo lasciato nella fase acquosa dopo una completa estrazione.
  10. Trasferire l'estratto combinato di cloroformio da ciascun becher nel rispettivo matraccio volumetrico da 25 mL e diluire fino al marchio con cloroformio. Assicurarsi di posizionare i tappi in ogni pallone volumetrico per evitare che il cloroformio evapori.
  11. Aggiungere ~ 1 g di solfato di sodio anidro (Na2SO4) a ciascuno dei sei becchi da 100 ml dal passaggio 2.9. Il solfato di sodio aiuta a rimuovere qualsiasi traccia di acqua che può essere presente nell'estratto di cloroformio.
  12. Trasferisci le soluzioni ai loro becchi rispettati. Ruotare con attenzione per facilitare la disidratazione di qualsiasi acqua nel campione.
  13. Decantare gli estratti di cloroformio in una cella fluorimetrica di quarzo (Nota: il cloroformio dissolverà una cella di polistirene plastico).

3. Selezione della lunghezza d'onda di eccitazione

Determinare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione eseguendo scansioni, quindi è sufficiente leggere e registrare l'intensità di fluorescenza di tutti i campioni a tali valori. Le larghezze di banda di eccitazione ed emissione sono preimpostate a 5 nm. Il complesso assorbe nel vicino UV, quindi la lunghezza d'onda di eccitazione dovrebbe essere di circa 385 nm. Inizialmente, monitorare la fluorescenza a 500 nm nel ramo di emissione.

  1. Sul fluorimetro, verificare che le ventole di raffreddamento interne ed esterne del fluorimetro siano accese prima di accendere la lampada allo xeno. La lampada allo xeno diventa molto calda e richiede un raffreddamento continuo.
  2. Accendere l'alta tensione (HV) al rilevatore PMT a 400 V.
  3. Apri entrambe le persiane.
  4. Apri il programma di acquisizione dati sul computer, eccolo "100nmFluorScan".
  5. Posizionare la soluzione "Campione + 2 mL aggiunto" (2) nella cella di quarzo da utilizzare per determinare le migliori lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione.
  6. Con la lunghezza d'onda di emissione inizialmente impostata a 500 nm, eseguire una scansione di eccitazione da 335-435 nm con una velocità di scansione di 2 nm / s.
  7. Dal grafico di fluorescenza risultante, determinare la lunghezza d'onda massima di eccitazione della fluorescenza (EXλmax) e impostare lo strumento su tale valore.

4. Selezione della lunghezza d'onda di emissione

  1. Impostare la lunghezza d'onda di emissione del fluorimetro su 450 nm.
  2. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda di emissione per eseguire una scansione a 100 nm da 450-550 nm.
  3. Per avviare la scansione, fare clic sul pulsante "avvia prova" sul programma contemporaneamente alla pressione del pulsante "START" sul pannello frontale del fluorimetro.
  4. Dal grafico di fluorescenza risultante, determinare la lunghezza d'onda massima di emissione di fluorescenza (EMλmax) e impostare lo strumento su tale valore (Figura 2).

Figure 2
Figura 2. Determinazione delle lunghezze d'onda ottimali EXλ max ed EMλmax.

5. Misurazione della fluorescenza dei campioni

  1. Tutti i campioni vengono eseguiti a EMλmax e EXλmax. Le scansioni non sono necessarie per ogni campione, ma solo il valore di fluorescenza in queste condizioni. Iniziando con il campione più diluito (vuoto), mettere in una cella di quarzo e poi nello strumento. Registrare l'intensità fluorescente nel quaderno di laboratorio.
  2. Ripetere l'operazione per tutti gli altri campioni.
  3. Tenere presente che l'intensità relativa vuota deve essere sottratta dalle intensità relative di ciascuna soluzione prima di creare la tabella di calibrazione.

6. Creazione del plottaggio di addizione standard

  1. Traccia l'intensità di fluorescenza rispetto a μg di Al3+ aggiunto.
  2. Determinare il valore dei minimi quadrati del plottaggio risultante e registrare sia la pendenza che l'intercetta.
  3. Determinare la μg di Al3+ nel campione sconosciuto dall'equazione μg di Al3+ = -b/m
  4. Sapendo che l'alluminio sconosciuto aveva un volume di 25,0 ml aggiunto a ciascun campione, determinare la concentrazione dell'alluminio nell'ignoto.

Il metodo di addizione standard è una tecnica di analisi quantitativa utilizzata per ridurre al minimo gli effetti della matrice che interferiscono con i segnali di misurazione degli analiti.

Le concentrazioni di componenti sconosciuti sono spesso chiarite attraverso una serie di tecniche analitiche, come la spettroscopia di luce, la spettrometria di massa e l'elettrochimica. Tuttavia, la misurazione può essere influenzata da altri componenti del campione, chiamati matrice, e causare la riduzione involontaria o il miglioramento del segnale, chiamati effetti della matrice. Questi effetti possono distorcere i risultati e causare errori significativi nell'analisi.

Il metodo di aggiunta standard può essere utilizzato per ridurre al minimo gli effetti della matrice sui segnali di misurazione. Questo viene eseguito aggiungendo volumi precisi di una soluzione di analita nota al campione.

Questo video introdurrà le basi del metodo di aggiunta degli standard e dimostrerà come eseguire la tecnica in laboratorio utilizzando una misurazione a fluorescenza.

Gli effetti della matrice possono sorgere in campioni complessi in cui un certo numero di altre molecole interagiscono con l'analita. Ad esempio, ciò può verificarsi quando le molecole si legano o si agglomerano con l'analita, cambiando così la sua capacità di fluorescenza. Oppure la matrice può cambiare la forza ionica della soluzione complessiva, cambiando le proprietà specifiche dell'analita.

Per mitigare questi effetti utilizzando il metodo dell'aggiunta standard, viene aggiunto un intervallo di volumi di una soluzione standard di analita a volumi uguali del campione. I volumi della soluzione vengono quindi resi uguali utilizzando il solvente.

Quindi, il segnale viene misurato per i campioni con e senza l'aggiunta standard. I dati vengono tracciati come intensità rispetto alla quantità dello standard aggiunto al campione, piuttosto che una classica curva di calibrazione. La concentrazione effettiva dell'analita in un dato pallone è definita dalla seguente equazione. La risposta strumentale sarà pari ad alcune volte costanti alla concentrazione di analita. L'equazione risultante assume la forma lineare y=mx+b. Pertanto, quando il grafico viene estrapolato a zero assorbanza, l'intercetta è uguale alla concentrazione sconosciuta del campione.

Il grafico del segnale deve essere lineare nell'intervallo di concentrazione che de concerne. Inoltre, l'interferenza non dovrebbe variare al variare del rapporto tra analita e matrice campione. Infine, la matrice stessa non dovrebbe generare alcun segnale di misurazione da sola.

Il seguente esperimento studia l'alluminio, una specie non fluorescente, facendolo reagire con 8-idrossichinolina, o 8HQ, per formare il complesso fluorescente ALQ3.

La fluorescenza del complesso di alluminio in un solvente organico viene misurata e quindi correlata alla concentrazione della soluzione di alluminio originale. Questo approccio è comune nell'analisi degli ioni metallici.

Ora che le basi del metodo di aggiunta standard sono state delineate e le basi dell'esperimento spiegate, eseguiamo la tecnica in laboratorio.

In primo luogo, preparare la soluzione stock di alluminio da 100 ppm in acqua, quindi utilizzarla per preparare una soluzione standard da 1 ppm.

Quindi, aggiungere 2 g di 8-idrossichinolina, o 8HQ, a un matraccio volumetrico da 100 ml.

Aggiungere con attenzione 5,74 ml di acido acetico glaciale, quindi diluire fino al segno di 100 ml con acqua deionizzata. Questo passaggio consente all'8HQ di dissolversi nella fase acquosa.

Quindi, preparare il tampone aggiungendo 20 g di acetato di ammonio e 7 ml di idrossido di ammonio al 30% in una bottiglia contrassegnata da 100 mL e diluire. Verificare il pH con un bastoncino indicatore di pH. Questo tampone aiuta a neutralizzare l'acido nella soluzione 8HQ quando combinato.

Altri reagenti necessari includono solfato di sodio anidro e cloroformio di grado spettrofotometrico.

Ora preparate i campioni, in questo caso estraendo il campione acquoso nella fase organica utilizzando l'estrazione liquido-liquido. Posizionare sei imbuti di separazione da 125 ml su anelli ad anello all'interno del cofano. Assicurati che tutti i bicchieri siano scrupolosamente puliti, poiché i bicchieri sporchi distorceranno i risultati. Etichettare in sequenza gli imbuti "vuoto", "0", "1", "2", "3" e "4".

Utilizzando una pipetta, aggiungere 25 ml della soluzione di alluminio sconosciuta a ciascuno dei cinque imbuti separatori etichettati da "0" a "4". Preparare lo spazio vuoto aggiungendo 25 ml di acqua deionizzata all'imbuto etichettato "vuoto".

Quindi, aggiungere 1, 2, 3 e 4 ml della soluzione standard da 1 ppm agli imbuti numerato corrispondenti. Non aggiungere alcuna soluzione standard agli imbuti vuoti o 0.

Aggiungere 1 mL della soluzione 8HQ e 3 mL di soluzione tampone a ciascuno dei 6 imbuti.

Eseguire un'estrazione liquido-liquida aggiungendo 10 ml di cloroformio a ciascun pallone. Agitare vigorosamente l'imbuto e occasionalmente sfiatare l'imbuto per rilasciare l'accumulo di pressione. Rimettete l'imbuto nell'anello e lasciate che gli strati liquidi si separtino.

Quindi, raccogliere la fase di cloroformio in un becher pulito, asciutto ed etichettato da 100 ml. Poiché il cloroformio ha una densità superiore all'acqua, è lo strato inferiore nell'imbuto.

Trasferire l'estratto di cloroformio in un matraccio volumetrico da 25 ml e chiudere ogni pallone per evitare l'evaporazione.

Eseguire una seconda estrazione liquido-liquida sulla soluzione acquosa rimanente, aggiungendo 10 ml di cloroformio ad ogni imbuto. Agitare l'imbuto, come prima, per trasferire l'analita rimanente alla fase di cloroformio. Non dovrebbe essere rimasto alcun colore giallo nella fase acquosa superiore.

Ripetere la seconda estrazione per ogni imbuto, quindi raccogliere le fasi del cloroformio nei corrispondenti becchi etichettati. Versare il cloroformio raccolto nei rispettivi palloni volumetrici e diluire fino al segno con cloroformio fresco.

Per rimuovere l'acqua traccia, aggiungere circa 1 g di solfato di sodio anidro a ciascuno dei sei becchi da 100 ml. Trasferire le soluzioni nei rispettivi beccatori e ruotare per facilitare la disidratazione del campione.

Decantare l'estratto di cloroformio in una cella fluorimetrica di quarzo.

Impostare il fluorimetro secondo le istruzioni del produttore e impostare la tensione su 400 V. Quindi, aprire il programma di acquisizione dati sul computer.

Utilizzare il campione 2 per determinare le migliori lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. Impostare la lunghezza d'onda di emissione su 500 nm ed eseguire una scansione di eccitazione da 335-435 nm, con una velocità di scansione di 2 nm/s.

Dal grafico a fluorescenza, determinare la lunghezza d'onda massima per l'eccitazione. Impostare lo strumento su quel valore di lunghezza d'onda di eccitazione, in questo caso 399 nm.

Quindi, determinare la lunghezza d'onda di emissione eseguendo una scansione da 450-550 nm. Dal grafico di fluorescenza risultante, determinare la lunghezza d'onda massima e impostare la lunghezza d'onda di emissione, in questo caso 520 nm.

Misurare ogni campione, incluso il bianco alla lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione selezionata. Registrare ogni lettura dell'intensità di fluorescenza.

Sottrarre la fluorescenza misurata del campione in bianco da ciascuno degli altri 5 campioni.

Traccia l'intensità di fluorescenza di ciascuno dei cinque campioni rispetto alla quantità di alluminio aggiunta al campione. Determinare il valore dei minimi quadrati del plottaggio risultante e registrare la pendenza e l'intercetta.

Il grafico dell'intensità della fluorescenza rispetto alla quantità di alluminio aggiunto ha prodotto una linea meno quadrata come mostrato. La quantità di alluminio nel campione può quindi essere calcolata utilizzando questa linea. Poiché la quantità di incognita aggiunta era di 25 ml, il valore determinato, 2,916 μg è diviso per 25 ml. Questo dà un risultato finale di 0,117 μg/mL, o 0,117 ppm. Questo è abbastanza vicino al valore noto di 0,110 ppm.

Ora, diamo un'occhiata ad alcune altre tecniche analitiche che possono avere risultati distorti a causa degli effetti della matrice.

La spettroscopia di assorbimento atomico è un metodo analitico che misura l'assorbanza della luce da parte di un analita bersaglio nella fase gassosa. Per la maggior parte dei campioni, una semplice curva di calibrazione che corremi l'assorbimento alla concentrazione del campione può servire come metodo affidabile per quantificare una concentrazione sconosciuta.

Tuttavia, questa tecnica può perdere precisione se altri componenti della miscela interagiscono con l'analita bersaglio e sopprimono o migliorano l'assorbimento. Il metodo di addizione standard può essere utilizzato in questo caso per tenere conto degli effetti di queste interazioni, specialmente nei campioni in cui la matrice non può essere rimossa prima dell'analisi.

La calibrazione dello strumento svolge un ruolo cruciale nell'accuratezza di una misurazione. Il metodo di aggiunta standard viene spesso utilizzato per facilitare la calibrazione di strumenti come ICP-MS. ICP-MS è un metodo comparativo, il che significa che la misurazione di un campione sconosciuto si basa sulla misurazione di uno standard chimico.

Pertanto, l'incertezza di una misurazione di un'incognita non può essere migliore dell'incertezza della calibrazione. Il metodo di addizione standard può quindi essere utilizzato per creare una curva di calibrazione più accurata del metodo standard e tiene conto delle interazioni matrici nel campione.

Molte molecole biologiche vengono analizzate utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC. L'HPLC è una tecnica che separa e analizza miscele complesse in base alle proprietà delle molecole come polarità, carica e dimensioni. Il momento in cui l'analita lascia la colonna consente all'utente di identificare ogni componente della miscela.

Le molecole biologiche possono spesso interagire in una miscela e sono fortemente influenzate dalla matrice in cui sono sospese. Spesso, il metodo di aggiunta standard viene utilizzato per creare una curva di calibrazione che tenga conto di questi effetti.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE al metodo di aggiunta standard. Ora dovresti capire come eseguire la tecnica per tenere conto degli effetti della matrice nell'analisi del campione.

Grazie per l'attenzione!

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Results

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Una scansione della lunghezza d'onda di eccitazione da 335-435 ha mostrato il più alto assorbimento a 399 nm, quindi il monocromatore di eccitazione è stato impostato per quel valore. Quindi la scansione dell'emissione è stata eseguita da 450-550 nm e il segnale più forte è risultato essere a 520 nm. Queste sono le lunghezze d'onda utilizzate per tutti i campioni.

Campione Intensità di fluorescenza Intensità di fluorescenza corretta
Vuoto 0.008 0.000
Campione 0.128 0.120
Campione + 1 mL 0.167 0.159
Campione + 2 ml 0.220 0.212
Campione + 3 mL 0.260 0.252
Campione + 4 ml 0.290 0.282

Un grafico di fluorescenza (Figura 3) rispetto a μg di Al3+ aggiunto (Figura 4) ha prodotto una linea dei minimi quadrati di:

Intensità di fluorescenza = 0,0417 x (μg di Al3+ aggiunto) + 0,1216

Quantità di Al3+ = -(Y-Int)/Pendenza = -0,1216/0,0417 = -2,916 μg/mL

Poiché la quantità di incognita aggiunta era di 25 ml, il valore di 2,916 μg/mL deve essere diviso per 25.

Concentrazione sconosciuta di alluminio = 2,916 μg/mL / 25,0 mL = 0,117 μg/mL = 0,117 ppm
che è abbastanza vicino al valore effettivo di 0,110 ppm (errore del 6,4%).

Figure 3
Figura 3. Fluorescenza dei campioni.

Figure 4
Figura 4. Grafico di calibrazione dell'aggiunta standard.

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Applications and Summary

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Il metodo delle aggiunte standard è spesso la tecnica utilizzata quando si desiderano risultati quantitativi accurati, utilizzata in analisi analitiche come l'assorbimento atomico, la spettroscopia di fluorescenza, l'ICP-OES e la gascromatografia. Questo viene spesso utilizzato quando ci sono altri componenti nel campione di interesse che causano una riduzione o un miglioramento dell'assorbanza desiderata per risultati quantitativi. Quando questo è il caso, non si può semplicemente confrontare il segnale degli analiti con gli standard utilizzando l'approccio tradizionale della curva di calibrazione. In effetti, la valutazione dell'effetto matrice dovrebbe essere una parte obbligatoria della procedura di convalida.

Un altro esempio in cui è possibile utilizzare aggiunte standard è quando si estrae argento da vecchi rifiuti fotografici. I rifiuti contengono alogenuri d'argento e possono essere estratti in modo che l'argento possa essere recuperato. Aumentando i "rifiuti" sconosciuti con quantità note di argento, questo metodo può prevedere la quantità di argento ottenuta dalla pellicola fotografica.

I lavoratori che sono esposti agli impianti di produzione di benzene sono spesso testati per verificare che siano al di sotto dei livelli accettati di benzene. La loro urina viene testata per la sostanza chimica, e questa è la matrice biologica. Inoltre, la quantità di soppressione dell'analita varia a livello di persone diverse, quindi un singolo kit di calibrazione non funzionerà. Con il metodo di aggiunta standard, ogni dipendente può essere testato e valutato con precisione.

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