Método de Adição Padrão

O método de adição padrão é uma técnica de análise quantitativa utilizada para minimizar efeitos matriciais que interferem com sinais de medição de analitos.

Concentrações de componentes desconhecidas são frequentemente elucidadas através de uma série de técnicas analíticas, como espectroscopia de luz, espectrometria de massa e eletroquímica. No entanto, a medida pode ser afetada por outros componentes da amostra, chamado de matriz, e causar a redução inadvertida ou aprimoramento do sinal, chamados efeitos matriciais. Esses efeitos podem distorcer resultados e causar erros significativos na análise.

O método de adição padrão pode ser usado para minimizar os efeitos da matriz nos sinais de medição. Isso é realizado adicionando volumes precisos de uma solução analito conhecida à amostra.

Este vídeo introduzirá o básico do método de adição de padrões e demonstrará como executar a técnica em laboratório usando uma medição de fluorescência.

Efeitos matriciais podem surgir em amostras complexas onde uma série de outras moléculas interagem com o analito. Por exemplo, isso pode ocorrer quando as moléculas se ligam ou aglomeram com o analito, alterando assim sua capacidade de fluoresce. Ou a matriz pode mudar a força iônica da solução global, mudando propriedades específicas do analito.

Para mitigar esses efeitos usando o método de adição padrão, uma gama de volumes de uma solução padrão analito é adicionada a volumes iguais da amostra. Os volumes da solução são então iguais usando solvente.

Em seguida, o sinal é medido para as amostras com e sem a adição padrão. Os dados são plotados como intensidade versus a quantidade do padrão adicionado à amostra, em vez de uma curva de calibração clássica. A concentração real do analito em qualquer frasco é definida pela seguinte equação. A resposta instrumental igualará alguns tempos constantes a concentração de analito. A equação resultante toma a forma linear y=mx+b. Assim, quando o enredo é extrapolado a absorção zero, a interceptação é igual à concentração desconhecida da amostra.

O gráfico do sinal deve ser linear sobre o intervalo de concentração de preocupação. Além disso, a interferência não deve variar como a razão de analito para alteração matricial amostral. Finalmente, a matriz em si não deve gerar sinais de medição por conta própria.

O experimento a seguir estuda o alumínio, uma espécie não fluorescente, reagindo-o com 8-hidroxiquinolina, ou 8HQ, para formar o complexo fluorescente ALQ_3.

A fluorescência do complexo de alumínio em um solvente orgânico é medida e, em seguida, relacionada à concentração da solução original de alumínio. Essa abordagem é comum na análise de íons metálicos.

Agora que o básico do método de adição padrão foi delineado, e o básico do experimento explicou, vamos executar a técnica em laboratório.

Primeiro, prepare a solução de estoque de alumínio de 100 ppm na água e, em seguida, use-a para preparar uma solução padrão de 1 ppm.

Em seguida, adicione 2 g de 8-hidroxiquinolina, ou 8HQ, a um frasco volumoso de 100 mL.

Adicione cuidadosamente 5,74 mL de ácido acético glacial e, em seguida, dilua para a marca de 100 mL com água deionizada. Esta etapa permite que o 8HQ se dissolva na fase aquosa.

Em seguida, prepare o tampão adicionando 20 g de acetato de amônio e 7 mL de hidróxido de amônio de 30% a uma garrafa marcada de 100 mL e diluir. Verifique o pH com uma vara indicadora de pH. Este buffer ajuda a neutralizar o ácido na solução 8HQ quando combinado.

Outros reagentes necessários incluem sulfato de sódio anidro e clorofórmio de grau espectrofotmétrico.

Agora prepare as amostras, neste caso, extraindo a amostra aquosa na fase orgânica usando extração líquido-líquido. Coloque seis funis separados de 125 mL em anéis de suporte dentro do capô. Certifique-se de que todos os vidros estão escrupulosamente limpos, pois os vidros sujos distorcerão os resultados. Sequencialmente rotulam os funis como "em branco", "0", "1", "2", "3" e "4".

Utilizando uma pipeta, adicione 25 mL da solução de alumínio desconhecida a cada um dos cinco funis separados rotulados de "0" a "4". Prepare o espaço em branco adicionando 25 mL de água deionizada ao funil rotulado como "em branco".

Em seguida, adicione 1, 2, 3 e 4 mL da solução padrão de 1 ppm aos funis numerados correspondentes. Não adicione nenhuma solução padrão aos funis em branco ou 0.

Adicione 1 mL da solução 8HQ e 3 mL de solução tampão para cada um dos 6 funis.

Realize uma extração líquido-líquido adicionando 10 mL de clorofórmio a cada frasco. Agite o funil vigorosamente, e ocasionalmente desabastem o funil para liberar o acúmulo de pressão. Coloque o funil de volta no anel e deixe que as camadas líquidas se separem.

Em seguida, colete a fase do clorofórmio em um béquer limpo, seco e rotulado de 100 mL. Como o clorofórmio tem uma densidade maior que a água, é a camada inferior no funil.

Transfira o extrato de clorofórmio em um frasco volumoso de 25 mL e tampe cada frasco para evitar a evaporação.

Realize uma segunda extração líquido-líquido na solução aquosa restante, adicionando 10 mL de clorofórmio a cada funil. Agite o funil, como antes, para transferir qualquer analito restante para a fase do clorofórmio. Não deve sobrar cor amarela na fase superior aquosa.

Repita a segunda extração para cada funil e colete as fases de clorofórmio em béquers rotulados correspondentes. Despeje o clorofórmio coletado em seus respectivos frascos volumoscos e dilua até a marca com clorofórmio fresco.

Para remover a água do traço, adicione cerca de 1 g de sulfato de sódio anidro a cada um dos seis béquers de 100 mL. Transfira as soluções de volta para seus respectivos béquers, e gire para facilitar a desidratação da amostra.

Decante o extrato de clorofórmio em uma célula fluorímetro de quartzo.

Configure o fluorímetro de acordo com as instruções do fabricante e coloque a tensão em 400 V. Em seguida, abra o programa de aquisição de dados no computador.

Use a amostra 2 para determinar os melhores comprimentos de onda de excitação e emissão. Defina o comprimento de onda de emissão para 500 nm e execute uma varredura de excitação de 335-435 nm, com uma velocidade de varredura de 2 nm/s.

A partir do enredo de fluorescência, determine o comprimento de onda máximo para excitação. Defina o instrumento para esse valor de comprimento de onda de excitação, neste caso 399 nm.

Em seguida, determine o comprimento de onda de emissão realizando uma varredura de 450-550 nm. A partir do gráfico de fluorescência resultante, determine o comprimento máximo de onda e defina o comprimento de onda de emissão, neste caso 520 nm.

Meça cada amostra, incluindo o em branco no comprimento de onda de excitação e emissão selecionado. Registo cada leitura de intensidade de fluorescência.

Subtrair a fluorescência medida da amostra em branco de cada uma das outras 5 amostras.

Plote a intensidade da fluorescência de cada uma das cinco amostras versus a quantidade de alumínio adicionada à amostra. Determine o valor mínimo quadrado do enredo resultante e registo da inclinação e intercepte.

O enredo da intensidade da fluorescência versus quantidade de alumínio adicionado rendeu uma linha menos quadrada, como mostrado. A quantidade de alumínio na amostra pode então ser calculada usando esta linha. Como a quantidade de adicionados desconhecidos foi de 25 mL, o valor determinado, 2.916 μg é dividido por 25 mL. Isso dá um resultado final de 0,117 μg/mL, ou 0,117 ppm. Isso é bem próximo do valor conhecido de 0,110 ppm.

Agora, vamos olhar para algumas outras técnicas analíticas que podem ter resultados distorcidos devido aos efeitos matriciais.

Espectroscopia de absorção atômica é um método analítico que mede a absorção da luz por um analito alvo na fase gasosa. Para a maioria das amostras, uma simples curva de calibração relacionando a absorção à concentração amostral, pode servir como um método confiável para quantificar uma concentração desconhecida.

No entanto, essa técnica pode perder a precisão se outros componentes da mistura interagirem com o analito de destino e suprimir ou melhorar a absorção. O método de adição padrão pode ser usado neste caso para explicar os efeitos dessas interações, especialmente em amostras onde a matriz não pode ser removida antes da análise.

A calibração do instrumento desempenha um papel crucial na precisão de uma medição. O método de adição padrão é frequentemente utilizado para auxiliar na calibração de instrumentos como o ICP-MS. ICP-MS é um método comparativo, o que significa que a medição de uma amostra desconhecida baseia-se na medição de um padrão químico.

Assim, a incerteza de uma medição de um desconhecido não pode ser melhor do que a incerteza da calibração. O método de adição padrão pode, portanto, ser usado para criar uma curva de calibração mais precisa do que o método padrão, e explica as interações matricial na amostra.

Muitas moléculas biológicas são analisadas usando cromatografia líquida de alto desempenho, ou HPLC. O HPLC é uma técnica que separa e analisa misturas complexas baseadas em propriedades de moléculas como polaridade, carga e tamanho. O momento em que o analito sai da coluna permite que o usuário identifique cada componente da mistura.

Moléculas biológicas podem frequentemente interagir em uma mistura, e são muito afetadas pela matriz em que estão suspensas. Muitas vezes, o método de adição padrão é usado para criar uma curva de calibração que explica esses efeitos.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE ao método de adição padrão. Agora você deve entender como executar a técnica para explicar os efeitos matriciais na análise da amostra.

Obrigado por assistir!