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Electroforesis capilar (CE)

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Electroforesis capilar, o CE, es una técnica utilizada en química analítica para separar las moléculas en un campo eléctrico según tamaño y carga.

Electroforesis capilar se realizan en un tubo de diámetro submilimétrica, llamado un tubo capilar, que contiene una solución electrolítica que fluye. La muestra se inyecta en el tubo capilar, y se aplica un campo eléctrico. Las moléculas entonces se separan en base a la diferencia en la velocidad, que está influenciada por la carga, el tamaño y la viscosidad del disolvente. CE es ideal para la separación de moléculas cargadas y tiene una mayor resolución que la cromatografía líquida de alto rendimiento, lo que es más eficiente y más sensible.

Este video se introducen los fundamentos de la electroforesis capilar y demostrar su uso mediante la determinación de la composición de un refresco.

En la CE, se aplica un campo eléctrico a un capilar llenado con un electrolito. El campo eléctrico induce una carga positiva en la entrada del capilar y una carga negativa a la salida.

Los flujos de electrolitos dentro de los capilares, inducidas por el campo eléctrico. Este flujo, llamada flujo electro-osmótico, es causada por el movimiento de una discreta capa de cargado positivamente iones sal a lo largo de las paredes capilares con carga negativa.

Como el eléctrico actual a través del tubo capilar, las caciones a lo largo de la pared se mueven hacia el extremo negativo. Este flujo de iones tira la solución en el centro a través del tubo.

La muestra entonces se separan moléculas basado en su velocidad dentro del tubo capilar. Esta velocidad, llamada movilidad electroforética, depende de las moléculas carga y tamaño, y cuánto es atraído o repelido por un campo eléctrico.

Las moléculas positivamente cargadas atraviesan más rápido del tubo capilar, ya que son más atraídos por el potencial a la salida. Las moléculas de carga negativa de flujo mucho más lento, ya que son más atraídos por el potencial en la entrada. Moléculas neutras son llevadas junto con el flujo a granel. Así, el orden de las moléculas que salen del tubo capilar es cargado positivamente, neutral y luego de cargado negativamente. Además, el flujo de electrolito tira pequeñas moléculas más rápidamente que moléculas más grandes debido a las fuerzas de fricción.

Las moléculas se registran por un detector, como el UV-Vis, como salir de la columna y se visualizan en una parcela de intensidad de señal de detector frente al tiempo, llamado un electroferograma.

Electropherograms puede producir una variedad de información; tal como muchos compuestos diferentes están presentes en una muestra y la cantidad de cada sustancia.

Ahora que has visto una breve sinopsis de electroforesis capilar, echemos un vistazo a cómo se realiza en el laboratorio.

En primer lugar, encienda la computadora y del instrumento de electroforesis capilar. Luego encienda el detector de UV para permitir que se caliente.

Configure los parámetros para ejecutar el experimento. En primer lugar, ajuste la temperatura para el almacenaje del cartucho y la muestra a 35 ° C y la longitud de onda para la detección de UV a 214 nm.

A continuación, establece los pasos de dos enjuague. El primer enjuague es con hidróxido de sodio para asegurar que los grupos silanol de la pared capilar están protonada. El segundo enjuague utiliza el buffer corriente se equilibren el capilar. A continuación, establezca la muestra a inyectar a 0,5 psi 5 s.

Ajustar el paso de la electroforesis, mediante la selección de la tensión de separación. En este caso, utilice 20 kV durante 5 minutos con polaridad normal, lo que significa que el campo eléctrico es positivo en la entrada y negativo en la salida.

En primer lugar, preparar 50 mL soluciones del aspartame de la soda componentes, cafeína y ácido benzoico en 500 partes por millón en agua.

De las soluciones madre, hacer una solución estándar de aspartamo 150 ppm, 150 ppm cafeína y ácido benzoico de 100 ppm.

Luego, realizar 4 soluciones de cafeína en 50, 100, 150 y 200 ppm. Estas muestras se utilizarán para hacer una curva de calibración. Para obtener más información, consulte esta colección de video en las curvas de calibración.

Finalmente, para preparar las muestras de soda desgasificando con nitrógeno. Se analizarán las muestras de soda con ninguna dilución.

Colocar los frascos con las muestras estándar o soda en el soporte para el frasco. Coloque los frascos que contienen el búfer de ejecución y la solución de lavado de hidróxido de sodio en el portamuestras. Asegúrese de registrar la ubicación de cada uno.

En el software del instrumento CE, indican que las ranuras contienen las soluciones de dos enjuague y el primer frasco de la muestra. Ahora, ejecuta la primera muestra.

Luego, ejecute la norma de combinación, 4 concentraciones de cafeína y un regular y muestra de soda de la dieta cambiando el vial de entrada.

Cuando todas las soluciones se han separado, analizar los datos.

En primer lugar, utilizar las normas para identificar los picos de las muestras de soda. Una comparación de los tres picos observados en la muestra de soda de dieta a los estándares muestra que cafeína, aspartamo y ácido benzoico presentes en la soda de dieta. En la muestra de soda regular, sólo el pico de cafeína es picos de actualidad, pero no el aspartamo y ácido benzoico.

Luego, calcular el área de pico para cada solución patrón de cafeína y hacer una curva de calibración. La curva de calibración para la cafeína puede utilizarse para calcular la concentración de cafeína en cada muestra.

Electroforesis capilar se utilizan para muchas separaciones de especialidad en entornos académicos e industriales.

CE a menudo se utiliza como un componente de la prueba de control de calidad de industria farmacéutica. Drogas, ya sea como pequeñas moléculas o productos biológicos, se pueden ejecutar mediante electroforesis capilar para ver si los productos secundarios están presentes. También puede ser utilizado para determinar si las proteínas se pliegan correctamente, como plegable puede afectar la carga de la proteína.

CE puede utilizarse también para separar el ADN. Usando una placa de micropocillos y múltiples arreglos de discos de los capilares, los investigadores pueden aumentar el rendimiento de un experimento único, como se muestra aquí. Fragmentos de ADN se separaron en base a tamaño, con una resolución de 1 par de base. Esto hace posible, junto con la determinación de otros parámetros como variantes de número de copia, que se utiliza para diagnosticar enfermedades genéticas posibles fragmentos de la secuencia de ADN.

Una proteína puede modificarse por varios grupos funcionales que se unen químicamente a diferentes lugares. Diversas copias de la misma proteína pueden variar con diferentes modificaciones, que cambiarán la carga y el tamaño de cada proteína. Atraviesa las proteínas purificadas de una CE que esté acoplado a un espectrómetro de masas puede separar proteínas basadas en que modificaciones están presentes y también identifican el tipo y la ubicación de la modificación.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para electroforesis capilar. Ahora debería entender cómo CE separa moléculas basadas en carga y masa y cómo ejecutar una muestra sobre el CE en el laboratorio.

¡Gracias por ver!

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